Name: Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Aprenda a usar vetores AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas após AVC isquêmico. Este método avalia a recuperação neuronal e motora em fases subaguda e crônica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistemas AAV e modelos de camundongos para estudar a expressão ectópica de Neurod1 pós-AVC

<ol><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).</li>
<li>Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+stroke%3A+Mechanisms%2C+modulation%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential.</a> J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).</li>
<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+of+stroke%3A+Present+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).</li>
<li>Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+degeneration+of+neurons+in+the+penumbra+region+following+a+small%2C+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke.</a> Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+gliosis+and+the+multicellular+response+to+CNS+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin-1+and+endothelin+receptor+antagonists+in+inflammatory+response+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+is+more+than+just+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The glial scar is more than just astrocytes.</a> Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Adams, K. L., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+and+disparity+of+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diversity and disparity of the glial scar.</a> Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).</li>
<li>Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+overview+of+neuroinflammation+in+an+experimental+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model.</a> Sci Rep. 9 (1), 507(2019).</li>
<li>Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Bridging+the+gap+between+basic+science+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).</li>
<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurod1+aav-based+gene+therapy+for+functional+brain+repair+after+ischemic+injury+through+in+vivo+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion.</a> Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).</li>
<li>Ghazale, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+phospho-site+mutations+enhance+neuronal+conversion+of+adult+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo.</a> Front Neurosci. 16, 917071(2022).</li>
<li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+astrocyte+to+neuron+conversion+with+lineage+tracing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo.</a> Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).</li>
<li>Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aav+tools+fail+to+detect+neurod1-mediated+neuronal+conversion+of+muller+glia+and+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo.</a> EBioMedicine. 90, 104531(2023).</li>
<li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promise+for+neuronal+repair%3A+Reprogramming+astrocytes+into+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo.</a> Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).</li>
<li>Hickmott, J. W., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-to-neuron+reprogramming+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-to-neuron reprogramming to the rescue.</a> Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).</li>
<li>Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+reactive+glia+into+iPSCs+to+produce+new+neurons+in+the+cortex+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 22490(2016).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Livingston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+neurod1+is+sufficient+for+functional+recovery+following+a+sensory-motor+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke.</a> Biomedicines. 12 (3), 663(2024).</li>
<li>Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+through+in+vivo+cell+fate+reprogramming+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair.</a> Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+conversion+of+striatal+astrocytes+into+gabaergic+neurons+in+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).</li>
<li>Roome, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+endothelin-1+model+of+forelimb+motor+cortex+stroke+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse.</a> J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).</li>
<li>Islam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+in+a+model+of+ischemic+stroke+leads+to+enhanced+cell+survival%2C+endogenous+neural+precursor+cell+activation+and+improved+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes.</a> Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titer+AAV+disrupts+cerebrovascular+integrity+and+induces+lymphocyte+infiltration+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Jiang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+reactive+astrocytes+to+induced+neurons+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), e76310(2013).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+specificity+of+GFAP+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Expression specificity of GFAP transgenes.</a> Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).</li>
<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+delivery+to+the+brain+using+AAV+and+ultrasound+depends+on+serotypes+and+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas.</a> J Control Release. 351, 667-680 (2022).</li>
<li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+murine+genetic+background+in+adeno-associated+virus+transduction+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).</li>
<li>Hu, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+inducible+cre+recombinase+driven+by+differential+astrocyte-specific+promoters+in+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines.</a> Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).</li>
<li>Botterill, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+expression+of+cre-dependent+adeno-associated+viruses+in+wild-type+c57bl%2F6j+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice.</a> eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).</li>
<li>Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+astrocyte+subtypes+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).</li>
<li>Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+RD+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+Impact+to+brain+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease.</a> Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).</li>
<li>Miller, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system.</a> Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).</li>
<li>Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+age+upon+astrocyte-specific+responses+to+acute+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).</li>
<li>Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tamoxifen-induced+cre+activity+and+its+effect+on+immune+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations.</a> Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).</li>
<li>Gresita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+efficiency+of+direct+reprogramming+of+astrocytes+into+neurons+in+the+brains+of+young+and+aged+mice+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia.</a> Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Broca #77 (0,018")</td><td>David Kopf Instruments</td><td>8177</td><td></td></tr><tr><td>AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre</td><td>Vector&nbsp; Biolabs Sutura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorvível com Agulha Polysorb&trade; Agulha de Poliéster CV-15 3/8 Tamanho 4 - 0 Trançado</td><td>Covidien</td><td>GL-881</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN Anticorpo (coelho)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>ABN78&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Camundongos</td><td>Charles River</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Clorexidina</td><td>Partnar</td><td>PCH-020</td><td></td></tr><tr><td>Contec&trade; &nbsp; PREempt&trade; Solução Desinfetante RTU</td><td>Fisher Scientific</td><td>29-636-6212</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>HM525 NX&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-23-3800-0.5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Segurança para Pena Lâminas de Micrótomo</td><td>Pena</td><td>12-631P</td><td></td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Óculos de Capa: Retângulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem de Fluorescência</td><td>Agilent Technologies</td><td>S3023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton Company</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Broca Estereotáxica de Alta Velocidade</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Metacam Solution (Meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5-GFAP-iCre</td><td>Vector Builder</td><td>P190924-1001suq</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Polyderm USP</td><td>TARO</td><td>2181908</td><td></td></tr><tr><td>SOMNI Scientific&trade; &nbsp; A Almofada de Aquecimento de Temperatura</td> Animal <td>Fisher Scientific</td><td>04-777-177</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos Estereotáxicos</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de Microscópio, branco</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>tdTomato Reporter Mice&nbsp;</td><td>O Laboratório Jackson 007914</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-1 Sistema de Anestesia Animal de Laboratório de Mesa</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr></tbody></table>

sistemas aav e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-avc isquêmico

AAV Systems and Mouse Models for Investigating Ectopic Expression of Neurod1 in Transduced Cells at Subacute and Chronic Times Post-Ischemic Stroke

Examinar os resultados celulares da expressão ectópica de Neurod1 conduzida por promotor GFAP curto (gfaABC (1) D) em cepas repórter de tipo selvagem (C57BL / 6J) e em cepas repórter tdTom-Cre transgênicas (especificamente, B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 22 dois sistemas baseados em AAV5 foram utilizados em camundongos com lesão por AVC ET-1 ( Figura 1A-C ). Em um modelo subagudo de AVC, o Neurod1 foi empacotado no sistema Cre-Flex AAV e entregue a camundongos do tipo selvagem no dia 7 após o AVC (Figura 1B). O segundo vetor Flex contém a sequência invertida para GFP impulsionada pelo promotor CAG que é flanqueado por locais de recombinação heterotípicos e antiparalelos do tipo loxP (Figura 1B). Ambas as construções virais são injetadas juntas ao mesmo tempo após o AVC. Uma vez que Cre é expresso em células transduzidas, a GFP é invertida e excisada em locais de recombinação, orientando a sequência na direção sensorial, o que permite a expressão de GFP. Portanto, as células que expressam Cre serão GFP positivas, indicando que foram transduzidas pelos vetores Cre-Flex. No modelo subagudo, os camundongos foram sacrificados 21 dias após a transdução (ou seja, 28 dias após o AVC), e o número de células transduzidas (GFP+), bem como o número de células NeuN+GFP+ (células transduzidas expressando células NeuN), foram contados no parênquima dos cérebros lesionados por AVC. Como visto na Figura 2A, os neurônios são perdidos no local da lesão isquêmica. A quantificação de células transduzidas no paradigma subagudo usando o sistema Cre-Flex AAV revela significativamente mais neurônios marcados (células NeuN + GFP + / GFP +) nos camundongos tratados com Neurod1 em comparação com camundongos de controle Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% vs. 18,43 +/- 3,03% de células NeuN + GFP + / GFP +, em Stroke-Neurod1 vs. Camundongos tratados com Stroke-Cre (controle), respectivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B, C).
Em um conjunto separado de experimentos, a conversão de AtN foi realizada em um modelo crônico de AVC (Figura 1B, C). O fator de transcrição Neurod1 foi entregue a camundongos repórteres tdTom-Cre com lesão por AVC ET-1 no dia 21 pós-AVC (Figura 1C). Idêntico ao sistema Cre-Flex usado em camundongos do tipo selvagem, a expressão de Neurod1 foi impulsionada pelo promotor GFAP curto. No entanto, neste sistema, uma única construção AAV foi usada com Cre recombinase após Neurod1 (Figura 1B). Assim, as células que expressam GFAP produzirão Cre recombinase, induzindo o repórter tdTom, indicando células que foram transduzidas por AAV. Os camundongos foram sacrificados 77 dias após o AVC (8 semanas pós-AAV) (Figura 1C). Como visto na Figura 3A, uma lesão cortical é observada no dia 77 pós-AVC em camundongos tdTom-Cre. O número de células transduzidas que expressam o marcador neuronal, NeuN+, foi quantificado (porcentagem relativa de células (NeuN+tdTom+/tdTom+) no estágio crônico pós-AVC e descobriu que os camundongos que receberam Stroke-Neurod1 tinham significativamente mais neurônios marcados em comparação com os camundongos de controle Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% de células NeuN+tdTom+/tdTom+ em Stroke-Neurod1vs. Camundongos tratados com Stroke-Cre (controle), respectivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).
No geral, os resultados demonstram a transdução basal de neurônios e um maior número de células transduzidas expressando NeuN + com entrega de Neurod1 nas fases subaguda e crônica pós-AVC em camundongos repórteres do tipo selvagem e tdTom-Cre, com dois sistemas diferentes baseados em AAV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig01.jpg"> 
Figura 1: Expressão ectópica de Neurod1, vetores e linhas do tempo. (A) Representação gráfica da indução de AVC por injeção de endotelina-1 (ET-1) no córtex motor do camundongo. Vírus Adeno-Associado (AAV) administrado em 3 locais, no local da injeção de ET-1, bem como nos locais ao redor da lesão, 1 mm anterior e posterior. Painel ampliado mostrando células transduzidas com AAV-Neurod1 no córtex motor. (B) Esquema dos dois vetores AAV no sistema Cre-Flex entregues a camundongos do tipo selvagem (painel superior). O vetor AAV5 1 contém o promotor GFAP curto, o fator de transcrição Neurod1 e a sequência Cre recombinase flanqueada por um sítio loxP (triângulo preto) e por um sítio lox2272 (triângulo branco). O vetor AAV5 2 carrega a sequência repórter do gene GFP invertida ladeada por um par de locais loxP e lox2272. A transdução de ambos os vetores nas células resulta em excisão e inversão mediadas por Cre, permitindo que a expressão de GFP rotule as células transduzidas. O Neurod1 também foi entregue a camundongos tdTom-Cre usando um vetor AAV5 (painel inferior). No vetor AAV5 1, o promotor GFAP curto, o fator de transcrição Neurod1 e a sequência Cre recombinase são empacotados. A expressão de Cre em células transduzidas impulsiona a excisão do códon Stop em locais loxP (triângulo preto), permitindo a expressão de tdTomato. (C) O sistema Cre-Flex foi testado em camundongos do tipo selvagem com AAVs injetados no período subagudo pós-AVC (dia 7 pós-AVC). Camundongos do tipo selvagem foram sacrificados 21 dias após a transdução do AAV (28 dias após o AVC). O AAV foi entregue a camundongos tdTom-Cre no período crônico pós-AVC (Dia 21 Pós-AVC), e os camundongos foram sacrificados 56 dias após a transdução de AAV (77 dias após o AVC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig02v4.jpg"> 
Figura 2: A entrega ectópica de Neurod1 usando AAVs Cre-Flex na fase subaguda pós-AVC leva ao aumento do número de células transduzidas que expressam NeuN. (A) Imunocoloração de seções cerebrais coronais através do córtex motor no dia 28 pós-AVC de camundongos Stroke-Cre control (esquerda) e Stroke-Neurod1 (direita). A perda neuronal é observada no local da lesão (linhas tracejadas brancas). Células transduzidas (GFP+, verde), neurônios (NeuN+, vermelho) e células NeuN+GFP+ (laranja) colocalizadas são vistas no córtex. Barras de escala: 250 μm. (B) Imagens representativas do tecido cerebral de controle Stroke-Cre (superior) e Stroke-Neurod1 (inferior) mostrando neurônios (NeuN+, vermelho) e AAV transduzido GFP+ (verde). As inserções delineadas em branco mostram um close-up das células para cada canal individual. As pontas das setas brancas indicam células transduzidas por AAV (GFP+). As setas brancas indicam células NeuN+GFP+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) Quantificação de células NeuN + GFP + / GFP + em camundongos Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . N = 3 camundongos por grupo. Os dados são representados como média ± EPM. Teste de Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Teste t não pareado, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig03.jpg"> 
Figura 3: A entrega ectópica de Neurod1 em camundongos repórteres tdTom-Cre na fase crônica pós-AVC leva ao aumento do número de células transduzidas que expressam NeuN. (A) Imunocoloração de seções cerebrais coronais através do córtex motor no dia 77 pós-AVC de camundongos Stroke-Cre control e Stroke-Neurod1 . A perda neuronal é observada no local da lesão isquêmica (linhas tracejadas brancas). As células transduzidas são marcadas com tdTom (vermelho) no peri-infarto. NeuN+tdTom+ (laranja) são células transduzidas que expressam marcadores neuronais. Barras de escala: 250 μm. (B) Imagens representativas do tecido cerebral de controle Stroke-Cre (superior) e Stroke-Neurod1 (inferior) mostrando neurônios (NeuN+, verde) e células transduzidas por AAV (tdTom+, vermelho). As inserções delineadas em branco mostram um close-up das células para cada canal individual. As setas brancas indicam células transduzidas por AAV (tdTom+). As setas brancas indicam células NeuN+tdTom+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) A quantificação de células NeuN + tdT + / tdTom + no paradigma crônico mostra significativamente mais células transduzidas expressando NeuN + (células NeuN + tdTom + / tdTom +) nos camundongos tratados com Neurod1 . N = 3 camundongos por grupo. Os dados são representados como média ± EPM. Teste de Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Teste t não pareado, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

Ectopic expression of neurogenic factors in vivo has emerged as a promising approach for replacing lost neurons in disease models. The use of neural basic ...

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Neurociência

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Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico (Vídeo) | JoVE Journal

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

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