Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

Estamos explorando a expressão ectópica mediada por AAV de fatores de transcrição neurogênicos como um tratamento potencial para AVC isquêmico. Nosso foco é ver se a expressão de Neurod1 em células que expressam GFAP durante as fases subaguda e crônica após um acidente vascular cerebral aumenta os neurônios transduzidos e se correlaciona com melhorias na função motora. Descobertas recentes mostram que a expressão gênica no córtex varia de acordo com a região com o mesmo AAV Nossa pesquisa descobriu que o promotor GFAP é mais ativo no córtex pré-frontal medial do que no córtex motor, indicando que as células transduzidas respondem de maneira diferente a promotores específicos.

Assim, as terapias que envolvem fatores de transcrição neurogênicos devem ser adaptadas à região cerebral alvo. Os desafios atuais incluem a variabilidade no tamanho da lesão do AVC devido a variáveis como as taxas de injeção de ET-1 e as eficiências de transdução entre as regiões do cérebro. Os títulos de AAV e o tropismo em regiões cerebrais e cepas de camundongos podem afetar a eficiência da transdução, afetando a avaliação celular da expressão ectópica de Neurod1 após o AVC.

O principal desafio na conversão de astrócitos em neurônios é distinguir os neurônios reprogramados dos preexistentes. Nosso laboratório visa confirmar que essa reprogramação ocorre in vivo desenvolvendo novas ferramentas. Em última análise, procuramos entender como a expressão ectópica do fator de transcrição neuronal aumenta a recuperação em animais com lesão cerebral.

Para começar, remova o animal anestesiado da câmara e coloque-o em uma superfície limpa. Depois de limpar a área cirúrgica do mouse, coloque o nariz no cone estereotáxico do nariz e estabilize o crânio usando barras auriculares. Usando uma lâmina de bisturi número 10, faça uma incisão vertical paralela ao plano sagital por trás do ponto médio dos olhos até o osso parietal.

Em seguida, retraia suavemente a pele para expor o crânio. Em seguida, use um cotonete para romper a fáscia do crânio e permitir que o crânio seque para expor totalmente o bregma. Usando uma broca estereotáxica de alta velocidade, faça três furos nas coordenadas do córtex sensório-motor direito.

Em seguida, substitua a broca por uma seringa de calibre 26 equipada com uma agulha medindo 0.375 polegadas de comprimento. Coloque 1,5 microlitros de solução de endotelina-1 400 micromolar dissolvida em PBS estéril na seringa. Libere um pequeno volume de endotelina-1 para observar uma queda na ponta da agulha, garantindo um bom fluxo.

Abaixe a ponta da agulha além do crânio no orifício da rebarba do meio sem perfurar a dura-máter. Uma vez alinhada, abaixe a agulha um milímetro no cérebro. Usando a seringa Hamilton, dispense 0,1 microlitro de cada vez e aguarde um minuto antes de injetar o próximo 0,1 microlitro.

Para evitar que a agulha fique bloqueada entre e após as injeções, libere um pequeno volume de endotelina-1 até que uma gota apareça na ponta da agulha. Usando um cotonete estéril, limpe o excesso de endotelina-1 antes da injeção. Finalmente, suture a pele sobrejacente no crânio usando uma sutura estéril 4-0 para fechar a ferida.

Depois de anestesiar o camundongo tratado com endotelina-1, transfira o camundongo para o quadro estereotáxico. Usando uma tesoura cirúrgica, corte as suturas da ferida. Com uma pinça, remova a crosta e retraia a pele para expor o crânio.

Em seguida, use um cotonete estéril para secar a superfície do crânio e localizar os orifícios das rebarbas. Montar os braços manipuladores do aparelho estereotáxico. Coloque um porta-agulha carregando uma seringa de calibre 26 com uma agulha medindo 0.375 polegadas de comprimento.

Agora, coloque 3,4 microlitros de solução AAV na seringa. Abaixe a ponta da agulha além do crânio até o primeiro orifício de rebarba mais anterior. Certifique-se de que a agulha não perfure a dura-máter e, em seguida, abaixe um milímetro no cérebro.

Usando a seringa Hamilton, injete um microlitro de solução de AAV dispensando 0,1 microlitro de cada vez, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, suture a pele sobrejacente no crânio para fechar a ferida usando uma sutura de poliéster Polysorb 4-0. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma gaiola limpa e pré-aquecida na área de recuperação.