Name: Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a usar transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9 para estudar a diferenciação Th17. Este protocolo de edição gênica com CRISPR-Cas9 permite investigar funções específicas de genes na resposta imunológica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Transdução retroviral de RNA guia para edição de genes na diferenciação Th17

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células e tecidos de 100 mm</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (Ácido livre, estéril)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células e tecidos de 24 poços</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células e tecidos de 48 poços</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Uma solução (1.000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD4 anti-camundongo Brilliant Violet 650 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD3e (145-2C11), Grau funcional, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) Anticorpo monoclonal (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu; m)</td> <td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células (70 &mu; m)</td><td><a name="INTERVALO! Centrífuga B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425&nbsp; Centrífuga R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Células competentes</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4 + Kit de isolamento de células T</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Corante de viabilidade fixável eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini Kit de Plasmídeo II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfection Reagent</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse FITC anti-mouse IL-17A anticorpo (TC11-18H10.1)</td> <td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>solução de formaldeído</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix para qPCR? + limpador de gDNA?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Maokang Biotecnologia</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Mouse GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Meio Sérico Reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>meio sérico reduzido</td></tr><tr><td>Pacific Blue anticorpo CD4 de camundongo (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Anticorpo (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Anticorpo (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Ratos Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9&nbsp;</td><td>Nº</td><td>NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Proteína humana recombinante TGF-beta 1 (expressa em CHO), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de Células de Pesquisa Recombinante Murine IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de Células de Pesquisa</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termociclador Sistema de PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticorpo anti-camundongo CD28 purificado (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purificado anti-camundongo IFN-&gama; Anticorpo (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IL-4 de camundongo purificado por Ultra-LEAF (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo purificado por IL-12/IL-23 p40 (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

direcionamento de genes mediados por crispr/cas9 retroviral para o estudo da diferenciação th17 in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

No estudo, clonamos o alvo de sgRNA para Rorc e sequências codificantes sem direcionamento de sgRNA no vetor pMX-U6-MCS com proteína fluorescente mCherry (Figura 1A, B). A produção de retrovírus foi realizada de acordo com o protocolo descrito na Figura 2. A transfecção foi iniciada no dia 0 e a colheita retroviral ocorreu no dia 2. A eficiência da transfecção pode ser testada pela intensidade de fluorescência mCherry (Figura 1C). Antes da colheita do vírus, células T CD4 + virgens foram classificadas e ativadas. Essas células T CD4+ ativadas foram então infectadas usando infecção por spin, seguida pela continuação das etapas de diferenciação conforme descrito. Por fim, a eficiência da transdução e os resultados da diferenciação foram avaliados por meio de análise de citometria de fluxo e análise de qPCR.
A Figura 3 ilustra a estratégia de gating aplicada para classificar células T CD4 + virgens. Depois de selecionar a população de células principal e as células singlete (conforme mostrado nas duas primeiras portas da Figura 3), as células FVD-CD4 + foram fechadas para distinguir as células T CD4 em células polarizadas para Th17 daquelas em APCs. Finalmente, a IL-17A produzida por células T CD4 representa a eficiência de diferenciação Th17, o que indicou a eficiência de nocaute. A porcentagem de células positivas para mCherry reflete a eficiência da infecção retroviral, enquanto a eficiência do nocaute é indicada pela porcentagem de células positivas para IL-17A. Para aumentar a viabilidade celular e minimizar a duração da triagem, os esplenócitos foram enriquecidos usando um kit de isolamento de células T CD4+ de camundongo, resultando em uma eficiência de enriquecimento superior a 90%.
A eficiência da infecção por retrovírus, indicada pela presença de células positivas para mCherry, é tipicamente em torno de 40% (Figura 4A). Embora a eficiência da infecção possa ser aumentada por meio da concentração do vírus, essa abordagem ocorre às custas de uma duração experimental prolongada e custos mais altos. Em nossos experimentos, células infectadas cultivadas sem o coquetel de diferenciação celular Th17 serviram como controle negativo de diferenciação Th17, designado como Th0. Um sgRNA não direcionado foi usado como controle positivo, referido como sgNT. Para a edição de genes, empregamos gRNA direcionado ao gene RORγt (sgRNA-Rorc), que reduziu significativamente a eficiência de diferenciação Th17 ( Figura 4A ). Essa intervenção também levou a uma diminuição substancial nos níveis de expressão de Rorc e IL-17a (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
Figura 1: Exemplo de sgRNA subclonado em um vetor retroviral e eficiência de transfecção. O vetor pMX-U6-MCS foi usado como construção inicial. O andaime de gRNA, juntamente com as sequências de sgRNA (a parte laranja) direcionadas ao local (A) embaralhado e (B) Rorc, foram inseridos a jusante do promotor U6 (a parte verde como uma seção para sequenciamento com primers U6). As localizações dos primers contendo sgRNA e os locais dos primers de sequenciamento são indicados abaixo do vetor circular Os nomes completos das abreviaturas no plasmídeo são os seguintes. Abreviaturas: AmpR = resistência à ampicilina, carpenicilina e antibióticos relacionados; LTR = repetição terminal longa; MMLVψ = sinal de empacotamento do vírus da leucemia murina de Moloney; gag = gene gag truncado do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV) sem o códon de início. (C) Imagem microscópica de mCherry em células Plat-E transfectadas com DNA plasmidial. Barra de escala: 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
Figura 2: Ilustração esquemática do protocolo. No dia anterior à transfecção, a densidade das células Plat-E precisa ser ajustada para uma faixa adequada. No dia seguinte (dia 0), realizar a transfecção e substituir o meio 12 h depois. No dia 1, classifique e ative as células T virgens de camundongos que expressam Cas9. Subsequentemente (dia 2), colher o sobrenadante de cultura contendo vírus e combinar com as células T ativadas para transdução retroviral. As células infectadas são então diferenciadas em células Th17 por 3 a 4 dias e analisadas usando FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
Figura 3: Estratégia de bloqueio para classificar as células T CD4 virgens. A coloração superficial foi realizada nas células T CD4 enriquecidas para marcar CD4, CD25, CD44 e CD62L. A estratégia de gating empregada foi a seguinte: inicialmente, os linfócitos foram fechados com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral. Posteriormente, células únicas foram identificadas usando FSC-H e FSC-W. As células CD4 + CD25- foram então bloqueadas para excluir células T reguladoras (Tregs). Finalmente, foram identificadas células T CD44CD62Laltas virgens. As células T CD4+ virgens isoladas foram coletadas para experimentos subsequentes. Abreviaturas: FSC = dispersão direta; SSC = dispersão lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
Figura 4: Exemplo de transdução bem-sucedida de células T ativadas e diferenciação Th17. (A) A eficiência de diferenciação de Th17 é reduzida significativamente, o que é editado por RORγt gRNA (gating em mCherry + IL-17a + população). (B) Expressão relativa de mRNA de Rorγt e IL-17a em Th0 (células infectadas cultivadas sem coquetel de diferenciação de células Th17), sgNT (sgRNA não direcionado) e sgRNA-Rorc (sgRNA direcionado ao gene RORγt ). p &lt; 0,001 (teste t de Student bicaudal não pareado; os dados são apresentados como média ± EPM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Componentes da reação de PCR</td>
			<td colspan="4">Programa de PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Volume (μL)</td>
			<td>Passo</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Corante Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Primer-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 min 30 s</td>
			<td>Vá para a Etapa 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modelo (~ 30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Componentes de reação de PCR e programa de PCR para construção de vetores de gRNA.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

retroviral-crisprcas9-mediated-gene-targeting-for-study-th17

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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