Name: Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Aprenda a identificar produtos naturais para biocontrole de fungos usando cromatografia em camada delgada e bioautografia direta. Este método permite avaliar extratos microbianos contra patógenos como Sclerotinia sclerotiorum de forma eficiente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos à Agriculture and Agri-Food Canada pelo financiamento sob o qual esta pesquisa foi possível (projetos J-001843 e J-002021). Agradecemos a Brett van Heyningen por filmar o conteúdo do vídeo para este protocolo. Também gostaríamos de agradecer aos ex-alunos de pós-graduação (Jennifer Vacon e Mark Nabuurs) por suas percepções sobre os métodos descritos neste manuscrito.

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Seleção dos candidatos de biocontrole microbiano
<ol><li>Usando ensaios de placa de competição, selecione isolados microbianos que exibem antagonismo contra o patógeno de interesse. NOTA: Nove isolados de Bacillus que exibiram antagonismo contra S. sclerotiorum foram selecionados, incluindo as espécies Bacillus atrophaeus, mojavensis e subtilis , para demonstrar este protocolo.</li>
</ol>2. Preparação de mídia
<ol><li>Prepare o ágar dextrose de batata (PDA) dissolvendo 39 g de meio por litro de água.</li>
	<li>Prepare o ágar Pseudomonas F adicionando 45 g de meio por litro de água.</li>
	<li>Prepare o caldo de batata dextrose (PDB) com 1% de ágar adicionando 24 g de meio e 0,24 g de ágar por litro de água.</li>
	<li>Prepare o caldo de levedura-glicose-manganês (YGM). Crie uma solução tampão consistindo de 2,5 g de KH2PO4 e 2,5 g K2HPO4 em 100 mL de água e uma solução salina consistindo de 0,58 g de MnSO4. H20, 0,5 g de NaCl e 0,05 g de FeSO4,7H 20 em 100 mL de água.<ol><li>Em seguida, adicione 1 g de extrato de levedura, 1,25 g de dextrose, 400 mL de água, 5 mL da solução tampão, 5 mL da solução salina e 90 mL de água para garantir que os sais metálicos não precipitem na solução.</li>
	</ol></li>
	<li>Esterilize em autoclave o meio, despeje o ágar em placas de Petri de 100 x 15 mm e deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.</li>
</ol>3. Preparação de patógenos
<ol><li>Cultivar cinco placas de Sclerotinia sclerotiorum em BDA (preparadas no passo 2.1) e incubar a 25 °C durante 3 dias.</li>
</ol>4. Preparação natural do extrato do produto
<ol><li>Cultivar cada isolado bacteriano em ágar Pseudomonas F (preparado no passo 2.2) e crescer até que sejam observadas colónias individuais.</li>
	<li>Subcultive colônias bacterianas únicas em 25 mL de meio YGM em centrífuga ou tubos de cultura e incube com agitação por 3 dias.</li>
	<li>Transferir 5 ml de alíquotas de cada extracto para 1 L de YGM e incubar nas mesmas condições durante mais 3 dias.</li>
	<li>Centrifugue cada cultura a 3000 x g por 15 min a 25 ° C para granular as células.</li>
	<li>Transvasar e lavar o sobrenadante três vezes com acetato de etilo para extrair os metabolitos do meio de cultura.</li>
	<li>Combinar e secar a camada de acetato de etilo de cada um por evaporação rotativa.</li>
	<li>Dissolva novamente o extrato em metanol mínimo, transfira-o para um pequeno frasco de cintilação e seque-o novamente por evaporação rotativa. NOTA: Se o extrato secar em um material oleoso ou resinoso, liofilize o material para obter um pó seco que possa ser pesado com precisão.</li>
</ol>5. Preparação da placa TLC
<ol><li>Prepare a placa TLC de 20 cm x 20 cm desenhando uma linha a 2 cm da parte inferior e a 2 cm da parte superior da placa. Na linha inferior, coloque nove pontos separados por 2 cm. Acima da linha superior, coloque quatro pontos separados por 4 cm.</li>
	<li>Dissolver 5 mg de cada extracto em 15 μL de metanol e aplicar 5 μl de cada extracto nos nove pontos marcados na linha inferior com uma pipeta. Deixar secar cada ponto de extracto na placa de TLC e aplicar mais 5 μL de alíquota no mesmo local. Repita até que todo o material esteja carregado na placa TLC.</li>
	<li>Desenvolver a placa TLC num tanque de revelação utilizando uma solução 1:2 de diclorometano e metanol até que o solvente atinja a linha marcada a 2 cm do topo da placa (aproximadamente 45 min).</li>
	<li>Uma vez desenvolvida, remova a placa TLC e aplique uma série de controles positivos nos quatro pontos marcados acima da linha de solvente. Utilizam-se quatro concentrações do mesmo controlo. Para S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL e 500 μg/mL de higromicina B são controles positivos.</li>
	<li>Antes que todo o solvente evapore da placa, coloque-o em uma caixa de placa TLC esterilizada com etanol.</li>
</ol>6. Ensaio de bioautografia direta
<ol><li>Autoclave os materiais a serem usados no ensaio (componentes de vidro do pulverizador de cromatografia, espátula de metal, quatro folhas de papel toalha, celulose ou papel de filtro, água e meio) em um copo grande coberto com papel alumínio. NOTA: Os materiais de papel (papel toalha, papel de celulose) devem ser embrulhados em papel alumínio para evitar que se molhem na autoclave.</li>
	<li>Conecte uma fonte de ar, manômetro e pulverizador de cromatografia usando tubulação de PTFE esterilizada com etanol. Conecte um filtro HEPA entre o pulverizador de cromatografia e o manômetro.</li>
	<li>Colete o tapete micelial das cinco placas de patógenos usando a espátula de metal estéril em um tubo de centrífuga de 50 mL usando uma espátula estéril. NOTA: Use um pequeno volume de caldo líquido para ajudar a desalojar os micélios, se necessário, e transfira com uma pipeta estéril.</li>
	<li>Adicione 25 mL de PDB corrigido com ágar e esferas de vidro estéreis ao tubo de centrífuga de 50 mL e vórtice por 5 min para quebrar o tapete micelial.</li>
	<li>Transfira a suspensão micelial para um pulverizador de cromatografia usando uma seringa estéril com ponta de agulha para garantir que grandes pedaços de micélio não entupam o pulverizador de cromatografia.</li>
	<li>Coloque as placas TLC desenvolvidas anteriormente em toalhas de papel estéreis em uma capa de fluxo laminar para reduzir o contato da mão com a placa durante a aplicação da suspensão do meio.</li>
	<li>Aumente a pressão do ar para aproximadamente 4 bar e aplique três camadas da suspensão na placa TLC, permitindo que a placa seque completamente entre as aplicações. NOTA: Três camadas foram consideradas a quantidade ideal. Menos do que isso, e o patógeno não tem meio suficiente para crescer. Mais do que isso, o meio é muito espesso, o que pode não permitir o contato do patógeno com metabólitos ativos.</li>
	<li>Adicione 500 mL de água estéril em uma caixa de plástico esterilizada e coloque folhas de celulose dobradas esterilizadas ou papel de filtro em cada lado para reter a umidade.</li>
	<li>Coloque a placa de ensaio concluída em quatro placas de Petri vazias na caixa.</li>
	<li>Incube o ensaio por 3 dias a 1 semana ou até que uma camada uniforme de micélios cresça uniformemente na placa de TLC, exceto em torno dos controles positivos e da zona de inibição (ZOIs).</li>
</ol>7. Análise por espectrometria de massa por cromatografia líquida
<ol><li>Fotografe o ensaio concluído usando fotografia.</li>
	<li>Calcule o fator de retenção para cada zona de inibição dividindo a distância da linha inferior ao ZOI pela distância da linha inferior à linha superior.</li>
	<li>Raspe a sílica das zonas de inibição e coloque-a em tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Adicione 500 μL de metanol a cada tubo e vórtice para extrair os metabólitos da sílica.</li>
	<li>Centrifugue a 8.500 x g a 20 °C por 10 min e transfira o sobrenadante para um pequeno frasco.</li>
	<li>Evaporar até à secura por evaporação rotativa ou sob uma corrente de azoto.</li>
	<li>Ressuspenda o extrato em 50 μL de metanol em um frasco para injetáveis LC.</li>
	<li>Analisar os metabólitos na zona de inibição por LC-MS e compará-los com os metabólitos do extrato bruto para determinar quais metabólitos do extrato bruto são responsáveis pela inibição do patógeno16.</li>
	<li>Utilizando o gênero e as espécies do microrganismo fonte e as massas identificadas na ZOI, busque na literatura e em bases de dados relevantes como Antibase e o Dicionário de Produtos Naturais para identificar os metabólitos.</li>
</ol>

Usando o ensaio de bioautografia direta TLC para identificar produtos naturais para biocontrole

<ol><li>Fisher, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+fungal+threats+to+animal%2C+plant+and+ecosystem+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health.</a> Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).</li>
<li>Savary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+pathogens+and+pests+on+major+food+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">The global burden of pathogens and pests on major food crops.</a> Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).</li>
<li>Lin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilience+in+agriculture+through+crop+diversification%3A+Adaptive+management+for+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22BioSci%22%5BJournal%5D)">Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change.</a> BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).</li>
<li>Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+crop+disease+resistance%3A+Lessons+from+research+on+arabidopsis+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato.</a> Front Plant Sci. 5, 671(2014).</li>
<li>Damalas, C., Koutroubas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+recent+developments+in+biopesticide+use%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Current status and recent developments in biopesticide use.</a> Agriculture. 8 (1), 13(2018).</li>
<li>Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+microbial+biocontrol+strategies+for+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens.</a> Plant Sci. 267, 102-111 (2018).</li>
<li>Tudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+routes+and+health+risks+associated+with+pesticide+application%5BTitle%5D)+AND+%22Toxics%22%5BJournal%5D)">Exposure routes and health risks associated with pesticide application.</a> Toxics. 10 (6), 335(2022).</li>
<li>Santos, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+thuringiensis%3A+From+biopesticides+to+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents.</a> Biochimie. 192, 83-90 (2022).</li>
<li>Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+some+biopesticides+and+their+importance+in+plant+protection+for+commercial+acceptance%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance.</a> Plants. 10 (6), 1185(2021).</li>
<li>Marrone, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticidal+natural+products+-+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Pesticidal natural products - status and future potential.</a> Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).</li>
<li>Ayilara, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopesticides+as+a+promising+alternative+to+synthetic+pesticides%3A+A+case+for+microbial+pesticides%2C+phytopesticides%2C+and+nanobiopesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides.</a> Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).</li>
<li>Abdelaziz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+soil+borne+diseases+by+plant+growth+promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trop.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria.</a> Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).</li>
<li>Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanism+of+Bacillus+amyloliquefaciens+SC-B15+and+its+application+in+cereal+mildewproof+and+grape+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Biosci%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation.</a> Food Biosci. 56, 103287(2023).</li>
<li>Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-directed+screening+of+bacillus+lipopeptide+extracts+via+hyphenated+high-performance+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography.</a> J Chromatogr A. 1605, 460366(2019).</li>
<li>Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of natural products.</a> Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).</li>
<li>De Souza, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+lipopeptide+isoforms+by+UPLC-MS+in+the+fermentation+broth+from+Bacillus+subtilis+CNPMS22%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22.</a> Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).</li>
<li>Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioautography+and+its+scope+in+the+field+of+natural+product+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Anal%22%5BJournal%5D)">Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry.</a> J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).</li>
<li>Choma, I., Jesionek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-direct+bioautography+as+a+high+throughput+method+for+detection+of+antimicrobials+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatography%22%5BJournal%5D)">TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants.</a> Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).</li>
<li>Attia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography-bioautographic+method+for+the+detection+of+arginase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors.</a> J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).</li>
<li>Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-bioautography+as+a+fast+and+cheap+screening+method+for+the+detection+of+alpha-chymotrypsin+inhibitors+in+crude+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts.</a> J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).</li>
<li>Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+thin-layer+chromatography+linked+with+%28bio%29assays+and+FTIR-ATR+spectroscopy+as+a+method+for+discovery+and+quantification+of+bioactive+components+in+native+Australian+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants.</a> J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).</li>
<li>Hilaire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+screening+anti-leishmania+compounds+in+plants+extracts+by+HPTLC-bioautography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography.</a> J Chromatogr B. 1188, 123061(2022).</li>
<li>Stankovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPTLC-direct+bioautography-guided+isolation+of+isogeranic+acid+as+the+main+antibacterial+constituent+of+Artemisia+santonicum+essential+oil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Serb+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil.</a> J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).</li>
<li>Su, Y., Qi, Y., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+sporulation+in+plant+pathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Mycology%22%5BJournal%5D)">Induction of sporulation in plant pathogenic fungi.</a> Mycology. 3, 195-200 (2012).</li>
<li>Wedge, E., Nagle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).</li>
</ol>

A Dra. Susan Boyetchko faleceu antes da apresentação deste trabalho (8 de fevereiro de 2023). Todos os outros autores declararam não ter conflitos de interesse.

O TLC-DB é uma ferramenta de pesquisa NP valiosa e bem estabelecida e uma alternativa simples e barata aos métodos de isolamento guiados por bioensaio de microplacas17. Requer tempo e recursos materiais mínimos em comparação com os ensaios de microplacas, que requerem separação de metabólitos usando técnicas de cromatografia líquida. É um ensaio altamente versátil que pode ser usado para detectar NPs antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários e antioxidantes, além de inibidores enzimáticos 18,19,20,21,22,23. Embora mais comumente usado para detectar e identificar fitoquímicos bioativos, o mesmo método pode ser aplicado para NPs bacterianas, conforme explorado neste protocolo18. Além disso, o protocolo pode ser otimizado para uso com uma variedade de fontes de NP e patógenos-alvo para auxiliar na descoberta e avaliação de novos NPs bioativos.
O meio usado para o crescimento bacteriano e o solvente usado para extração podem afetar muito os resultados da descoberta de produtos naturais. O meio utilizado neste protocolo é otimizado para bactérias produtoras de lipopeptídeos cíclicos, incluindo Pseudomonas e Bacillus spp. mas outros meios e fontes de nutrientes devem ser considerados ao explorar outros gêneros. Pode-se optar por completar o TLC-DB usando o mesmo microrganismo cultivado em uma variedade de meios para avaliar toda a amplitude da diversidade de metabólitos de um isolado ou usar condições de crescimento idênticas para uma gama mais ampla de isolados. A escolha do solvente de extração também afeta os produtos naturais detectados. É geralmente entendido que a maioria dos NPs bioativos tem polaridade baixa a moderada, tornando o acetato de etila uma escolha adequada devido ao seu baixo ponto de ebulição, o que facilita a remoção. No entanto, se também se deseja examinar as frações polares e apolares, podem ser realizadas múltiplas extrações com outros solventes. Alternativamente, o extrato livre de células pode ser liofilizado e usado no ensaio para ver todos os metabólitos liberados no meio. No entanto, muitas vezes será necessário carregar mais material na placa de TLC para contabilizar os componentes de mídia seca no material liofilizado. Da mesma forma, se este método for usado com um patógeno diferente, como inóculo, o meio usado e as condições de incubação devem ser otimizados para obter as 5 placas de ágar de micélio usadas para o ensaio TLC-DB.
O TLC-DB é vantajoso em comparação com a bioautografia de contato e imersão, pois utiliza a camada mais fina de ágar e inóculo, minimizando a dependência da difusão de metabólitos na camada de ágar, o que pode permitir que quantidades menores de produtos naturais induzam a inibição do patógeno17. Achados publicados anteriormente usando métodos bioautográficos de TLC usaram uma suspensão de esporos do patógeno para completar o ensaio17. Embora isso permita um controle preciso sobre a concentração da suspensão, pode ser extremamente difícil e demorado induzir a esporulação de certos fungos24. Essa modificação simplifica muito o ensaio e permite a conclusão do ensaio usando patógenos fúngicos que são difíceis de esporular e podem ter sido evitados anteriormente para este método.
A massa de extrato bacteriano usada no ensaio pode afetar os resultados. Se muito pouco extrato for aplicado à placa TLC, é possível que a concentração inibitória mínima de um composto ativo não seja ultrapassada e a bioatividade não seja detectada. Como resultado, em alguns casos, e como visto na Figura 1 e na Figura 2, vale a pena sobrecarregar a placa de CCD, comprometendo a separação para a capacidade de detectar facilmente a atividade. Da mesma forma, a carga de patógenos pulverizada na placa não deve ser muito baixa, pois não haverá meio suficiente aplicado para suportar o crescimento do patógeno. Este método pode ser facilmente ajustado para acomodar uma variedade de extratos bacterianos e patógenos, e as quantidades de extrato microbiano e inóculo descritas no protocolo garantiram que a bioatividade possa ser detectada para vários patógenos e extratos microbianos. Se não forem observadas zonas de inibição após a conclusão do ensaio, pode indicar uma das seguintes situações. Primeiro, os metabólitos ativos podem não estar presentes no extrato aplicado devido ao uso de meios incompatíveis para o crescimento bacteriano ou devido à atividade da bactéria não ser resultado da produção de NP. Um ensaio de difusão em disco com o extrato pode ser concluído para confirmar ou negar a existência de NPs ativos no extrato. Se o ensaio de difusão em disco não mostrar supressão de patógenos, outros meios podem ser testados para determinar se outras condições produzem NPs bioativas. Se o ensaio de difusão em disco indicar que o extrato suprime o patógeno, pode ser necessário aplicar uma massa maior do extrato bacteriano à placa de TLC, caso em que outro ensaio pode ser tentado.
A comparação de metabólitos no ZOI com o extrato bruto é essencial para a identificação de NPs ativos. No ensaio, os metabólitos do extrato bruto podem ser metabolizados ou modificados pelo patógeno, o que pode ser observado via LC-MS. Assim, apenas os metabólitos que ocorrem tanto no extrato bruto quanto no ZOI podem ser considerados como NPs produzidos pela bactéria em estudo. Se não for possível correlacionar os metabólitos extraídos do ZOI com os metabólitos do extrato bruto, uma placa de TLC pode ser preparada, conforme descrito na etapa 5. Sem completar o ensaio de bioautografia, extrair os metabolitos da placa TLC com o mesmo tempo de retenção observado no ensaio concluído. Isso deve permitir uma correlação mais fácil entre os metabólitos nos ZOIs e o extrato bruto, causando supressão de patógenos.
Uma desvantagem do TLC-DB é que a resolução do TLC é consideravelmente menor do que a alcançada ao usar técnicas tradicionais de triagem de micropoços, que requerem cromatografia líquida para separação. Assim, é comum que existam múltiplos metabólitos na zona de inibição, onde alguns metabólitos podem não estar contribuindo para a bioatividade. Esse problema pode ser causado ainda mais pela prática de sobrecarregar a placa TLC para observar a bioatividade com mais clareza. Trabalhos recentes foram publicados usando TLC de alto desempenho (HP-TLC), que melhora muito a resolução e pode permitir a automação do desenvolvimento de TLC que de outra forma seria impossível ao usar TLC convencional 14,21,22,23. Além disso, as placas podem ser desenvolvidas em uma segunda dimensão (2D-TLC) para separar ainda mais os metabólitos com tempos de retenção semelhantes. Dito isto, deve-se avaliar se o aumento do tempo e do custo do material é um compromisso que vale a pena para o aumento da resolução obtida com HP- e 2D-TLC25.

Os patógenos agrícolas fúngicos causam perdas significativas na qualidade e na produtividade das culturas em todo o mundo, contribuindo para os desafios econômicos e de abastecimento de um sistema global estável de produção de alimentos 1,2. Os danos causados por patógenos podem ser evitados com o melhoramento de cultivares resistentes à infecção e o uso de sistemas integrados de manejo de culturas, incluindo rotações de culturas e práticas de manejo da terra para suprimir a proliferação de patógenos 3,4. Embora esses métodos reduzam os danos às plantações, os pesticidas químicos são geralmente usados em conjunto para matar ativamente as estruturas reprodutivas fúngicas no campo e evitar danos e reduções de rendimento. Embora eficaz, o uso de pesticidas químicos tem muitas desvantagens, incluindo danos aos ecossistemas circundantes, declínio na fertilidade do solo, riscos associados à saúde humana e o desenvolvimento de resistência a patógenos, este último causando a necessidade de doses mais altas de pesticidas a cada ano 5,6,7.
Os produtos de controle de pragas e patógenos de base microbiana há muito são considerados alternativas potenciais ou complementares aos pesticidas sintéticos. Desde o início dos anos 1900, o Bacillus thuringiensis tem sido amplamente utilizado para controlar pragas e patógenos agrícolas como tratamento de sementes, pulverização foliar e tratamento direto do solo8. Esses produtos foram denominados biopesticidas e são caracterizados como microrganismos ou bioquímicos naturais que podem matar, suprimir ou reduzir o vigor de uma praga ou patógeno alvo. Os biopesticidas podem controlar o crescimento de um patógeno por meio de vários mecanismos, mas mais comumente o fazem por meio da secreção de metabólitos secundários9. Os metabólitos secundários, muitas vezes chamados de produtos naturais, não estão envolvidos no metabolismo primário, mas são produzidos como uma vantagem evolutiva para superar outros microrganismos10.
Os biopesticidas oferecem muitas vantagens sobre seus equivalentes sintéticos. Eles representam um baixo risco de toxicidade para o meio ambiente, fauna e humanos em comparação com produtos sintéticos de manejo de pragas 9,10. Como a maioria dos biopesticidas existe naturalmente no meio ambiente há milênios, existem vias de biodegradação para metabólitos microbianos no meio ambiente, limitando a possibilidade de contaminação do solo ou do ecossistema e reduzindo os tempos de residência que contribuem para que os pesticidas sintéticos sejam tão destrutivos para o meio ambiente11. Além disso, muitos biopesticidas usados para mitigar a infecção por patógenos também exibem propriedades promotoras do crescimento das plantas, o que pode aumentar a biodisponibilidade de nutrientes e induzir a resistência sistêmica das plantas12.
Mais comumente, os biopesticidas são aplicados na forma de inóculo microbiano e os NPs são secretados por microrganismos vivos in situ12,13. Nesse caso, identificar a fonte da atividade de um biopesticida é de grande valia. Isso fornece informações sobre o mecanismo de ação do biopesticida, ajuda na construção de um caso para a proteção de um microrganismo com patente e pode ter um impacto científico significativo se suas estruturas forem novas. Mais importante, no entanto, a identificação da fonte bioativa informa as possibilidades de formulação de um produto biopesticida a jusante. Se o próprio NP estiver ativo, pode-se usar o microrganismo como uma fábrica de biomoléculas para a produção de biopesticidas em larga escala. Além disso, muitos NPs que foram explorados para biocontrole também têm aplicações potenciais na medicina humana, tornando-os ainda mais valiosos economicamente8.
Os ensaios de bioautografia direta por cromatografia em camada delgada (TLC-DB) são um método barato e direto para o isolamento guiado por bioatividade e identificação de metabólitos biopesticidas. Embora a técnica seja comumente utilizada para separar o teste de bioatividade de fitoquímicos de extratos vegetais brutos, ela também tem grande potencial para a análise de extratos microbianos14. O TLC fornece separação rápida e barata de NPs em um extrato microbiano bruto e, após o revestimento com uma suspensão de patógeno de meio, as zonas que contêm metabólitos ativos são facilmente visualizadas. Essas zonas podem ser raspadas da placa e extraídas para análise química por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) para identificar metabólitos conhecidos. Os metabólitos que não correspondem aos compostos relatados anteriormente podem ser isolados em maiores quantidades por cromatografia líquida para serem submetidos a estudos de elucidação da estrutura usando técnicas como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios-X15.
Este artigo descreve um sistema modelo para descoberta e identificação de NPs de biopesticidas usando TLC-DB com Bacillus spp. e o patógeno agrícola Sclerotinia sclerotiorum. A Figura 1 fornece uma visão geral esquemática do procedimento TLC-DB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática das etapas 4-7 do procedimento do TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Pipeta monocanal de 0,5-5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-004</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador de cromatografia de camada fina de 10 mL</td><td>VWR</td><td>KT422530-0010</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>89038-970</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L pipeta monocanal</td><td>VWR</td><td>76169-240</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 15 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 1 L</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS13951L</td><td>Deve ser seguro para autoclave</td></tr><tr><td>Seringa estéril de 1 mL com agulha</td><td>Thomas Scientific</td><td>8935L75</td><td>Recomenda-se agulha destacável</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de 5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-008</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de 7 mL</td><td>VWR</td><td>76538-962</td><td></td></tr><tr><td>Etanol a 95%</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-01850-34</td><td>8 L, 115 VAC</td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>bin</td><td>Thomas Scientific</td><td>1216H91</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1123-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>VWR</td><td>CA28297-846</td><td></td></tr><tr><td>Esferas de desbaste</td><td>VWR</td><td>12621-148</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>VWR</td><td>CA80501-074</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de ferro heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td><td>CleanTech</td><td>1000-6-A</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>Waters</td><td>LITR10064178</td><td>sistema UPLC/MS/MS TQD</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>700201000</td><td>Coletor de temperatura&nbsp;-50 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidrato de Sulfato de Manganês</td><td>VWR</td><td>CAAA10807-14</td><td></td></tr><tr><td>Metanol &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH2018-5GLP</td><td></td></tr><tr><td>Toalha de papel</td><td>VWR</td><td>89402-824</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Batata Dextrose</td><td>VWR</td><td>CA90000-758</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Batata Dextrose</td><td>VWR</td><td>CA90003-494</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico</td><td>VWR</td><td>470302-246</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>VWR</td><td>470302-252</td><td></td></tr><tr><td>Manômetro de Pressão 6mm União Reta 0-10 bar (0-145 psi)</td><td>Tameson</td><td>F25U6</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas F Agar</td><td>VWR</td><td>90003-352</td><td>Também conhecido como Tubulação PTFE Flo Agar</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>58697-U</td><td>1/16 polegada de diâmetro interno&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td></td></tr><tr><td>Alças de inoculação estéreis com agulha</td><td>VWR</td><td>76534-512</td><td></td></tr><tr><td>Folha de estanho</td><td>Thomas Scientific</td><td>1086F24</td><td>Pode ser comprado no supermercado</td></tr><tr><td>TLC Sílica Gel 60 RP-18 F254S 25 Placas de Vidro 20 X 20 cm</td><td>Thomas Scientific</td><td>1205Q12</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Labconco</td><td>1472100</td><td>98 L/min</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>76549-928</td><td>Deve acomodar tubos de centrífuga de 15 mL e 50 mL Whatman</td></tr><tr><td>HEPA-VENT em linha</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA67235000</td><td>10 filtros, entrada/saída de 1/4 a 3/8 polegadas</td></tr><tr><td>VWR</td><td>97063-370</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

A bioautografia direta por cromatografia em camada delgada (TLC-DB) é um bioensaio bem estabelecido usado para separar e identificar produtos naturais (NPs) que são antagônicos contra um patógeno alvo. É uma opção rápida, barata e simples para o isolamento guiado por bioensaio e identificação de NPs que depende da separação por TLC juntamente com a aplicação direta de um patógeno alvo para examinar a bioatividade. É normalmente usado para a análise de extratos de plantas bioativas, detectando atividade inibitória contra bactérias, fungos e enzimas. Dito isto, tem um grande potencial na descoberta de NPs bacterianas, particularmente para avaliar NPs bacterianas contra patógenos agrícolas pertinentes, o que é valioso para descobrir e desenvolver novos biopesticidas para a indústria agrícola. Além disso, é um protocolo sintonizável que pode ser aplicado a outros patógenos alvo ou fontes de NPs em programas de pesquisa relacionados à descoberta e identificação de compostos bioativos. Aqui, descrevemos um sistema modelo para descoberta e identificação de NPs de biopesticidas usando TLC-DB com Bacillus spp. e o patógeno agrícola Sclerotinia sclerotiorum.

Após a separação dos extratos microbianos por TLC, os metabólitos devem ser dispersos ao longo da placa TLC verticalmente. Sob luz visível, pode ser difícil visualizar metabólitos que não absorvem na faixa de luz visível. Assim, a imagem sob luz ultravioleta pode ajudar a visualizar a separação de metabólitos, como visto na Figura 2A, B. Após o período de incubação, o patógeno deve parecer crescer uniformemente em toda a placa, exceto nos controles positivos e nas zonas de inibição onde residem os metabólitos ativos, ilustrados na Figura 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> Figura 2: Separação de extratos microbianos por TLC. (A) Placa TLC desenvolvida contendo nove extratos de Bacillus fotografados sob luz visível e (B) sob luz UV de 320 nm antes da aplicação de inóculo fúngico. (C) Ensaio de bioautografia concluído com crescimento de patógenos observado em toda a placa, exceto onde o crescimento é inibido em torno dos controles positivos, e ZOI de cada extrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os metabólitos extraídos das zonas de inibição são analisados por LC-MS e comparados ao extrato bruto para determinar as NPs responsáveis pelo antagonismo contra o patógeno. Os metabólitos correspondentes devem ter o mesmo tempo de retenção e espécies de íons moleculares para serem considerados compatíveis. Uma vez identificados os metabólitos ativos, a cultura bacteriana pode ser cultivada a granel para isolar os metabólitos ativos de interesse para a química estrutural ou estudo biológico.

Descrevemos o uso de cromatografia em camada delgada, ensaio de bioautografia direta e cromatografia líquida-espectrometria de massa para identificar produtos naturais microbianos que apresentam antagonismo contra patógenos fúngicos usando o patógeno Sclerotinia sclerotiorum e isolados de Bacillus biopesticidas como sistema modelo.

Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

bioassay-guided-identification-natural-products-for-biocontrol-thin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto...

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Métodos são descritos para-cromatografia em camada delgada (TLC) separação de extratos de plantas e contatar bioautografia para identificar metabólitos antibacterianos. Os métodos são aplicados para o rastreio de compostos fenólicos de trevo vermelho que inibem bactérias produtoras de amoníaco hiper (HAB) nativas para o rúmen de bovinos.

Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

A neurotoxina botulínica é uma das toxinas mais potentes entre os agentes de risco biológico da Categoria A, mas uma terapêutica pós-exposição não está disponível. A abordagem de imagem de alto conteúdo é uma metodologia poderosa para identificar novos inibidores, pois permite a triagem multiparamétrica usando neurônios motores biologicamente relevantes, o principal alvo dessa toxina.

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

Um método para a identificação de espécies de material botânico por análise directa em espectrometria de massa de alta resolução de tempo-real e análise estatística multivariada é apresentada.

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

Apresentado aqui é um protocolo para identificação de campo de Matricaria chamomilla usando um sistema portátil qPCR. Este protocolo de fácil desempenho é ideal como um método para confirmar a identidade de uma espécie botânica em locais onde o acesso a equipamentos de laboratório e expertise é limitado, como fazendas e armazéns.

Identificação de campo de matricaria chamomilla usando um sistema portátil qPCR

Os produtos naturais representam pontos de partida promissores para o desenvolvimento de novas drogas e agentes terapêuticos. No entanto, devido à alta diversidade química, encontrar novos compostos terapêuticos das plantas é uma tarefa desafiadora e demorada. Descrevemos uma abordagem simplificada para identificar moléculas antimicrobianas e antibiofilmes a partir de extratos e frações vegetais.

Abordagem Sistemática para Identificar Novas Moléculas antimicrobianas e antibiofilmes de extratos e frações de plantas para prevenir cárie dentária

Uma estratégia rápida-multidisciplinar para detecção precoce de flores cianobacterianas e cianotoxinas associadas é descrita aqui. Permite a detecção de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas em amostras de água e em matrizes orgânicas, como amostras de bivalve, em 24 h.

Detecção precoce de Flores Cianobacterianas e Cianotoxinas Associadas usando estratégia de detecção rápida

Apresentamos um método para anotação e classificação rápida baseada em espectrometria de massa (MS) / espectrometria de massa (MS) de alcalóides tropanos, útil tanto para a desreplicação preliminar de amostras contendo tropano quanto para a descoberta de novos alcalóides para isolamento.

Aplicações da Espectrometria de Massa em Tandem por Cromatografia Líquida na Pesquisa de Produtos Naturais: Alcalóides Tropânicos como Estudo de Caso

Aprenda a identificar produtos naturais para biocontrole de fungos usando cromatografia em camada delgada e bioautografia direta. Este método permite avaliar extratos microbianos contra patógenos como Sclerotinia sclerotiorum de forma eficiente.

Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta

Explorar mais vídeos