Name: Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação em substrato poroso com monitoramento de impedância elétrica transepitelial para biologia celular. Este método avança a compreensão dos estágios intermediários do processo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Método TEEI para análise de eletroporação e previsão de entrega em células A431

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

A eletroporação é uma técnica na qual as células são expostas a um campo elétrico, criando poros temporários na membrana celular através dos quais cargas, incluindo proteínas, RNA e DNA, podem passar 1,2. A versão mais utilizada é a eletroporação em massa (BEP). A BEP é realizada enchendo uma cubeta com um eletrólito contendo milhões de células, expondo o eletrólito a alta voltagem e permitindo que a carga entre nas células por difusão ou endocitose1. Há muitas vantagens no BEP, incluindo alto rendimento e vários sistemas disponíveis comercialmente. No entanto, há limitações para a entrega do BEP. O posicionamento inconsistente da célula em relação aos eletrodos e à blindagem do campo elétrico das células adjacentes causa variabilidade significativa na exposição ao campo elétrico durante o BEP 3,4. A alta voltagem necessária para BEP também tem um impacto negativo significativo na viabilidade celular5. Desde a sua criação em 20116, tem havido um interesse crescente em um método de eletroporação chamado eletroporação por substrato poroso (PSEP), embora às vezes seja referido por outros nomes, incluindo eletroporação localizada e nano ou microeletroporação 1,7,8. Em contraste com a suspensão celular do BEP, o PSEP é conduzido em células aderentes a um substrato poroso. Não apenas um estado aderente é preferido para a maioria das linhagens celulares humanas9, mas os poros do substrato também se concentram na corrente elétrica, localizando o potencial elétrico transmembrana (TMP) em regiões específicas da membrana celular10,11. Essa localização permite uma redução significativa na tensão aplicada, diminuindo os danos e aumentando a viabilidade celular. Essa combinação de efeitos ajuda a controlar o desenvolvimento dos poros da membrana celular, resultando em uma entrega mais consistente e eficiente 1,5,12.
Um estudo recente introduziu um dispositivo PSEP com um feixe de eletrodos banhados a ouro de seis poços para segurar inserções de membrana porosa disponíveis comercialmente13 (Figura 1A, B), uma prática que foi introduzida pela primeira vez por Vindis et al.14. O dispositivo pode aplicar pulsos e medir a impedância elétrica através da monocamada da célula, conhecida como impedância elétrica transepitelial (TEEI), em tempo real13. A interface do usuário do dispositivo permite controle completo sobre a forma de onda e polaridade do eletroporation. É importante ressaltar que as medições de impedância em tempo real podem ser usadas para prever os resultados da entrega sem a necessidade de reagentes caros ou marcadores fluorescentes, um conceito conhecido como entrega sem rótulo15.
A plataforma PSEP consiste em dois componentes elétricos personalizados principais: o corpo principal do dispositivo, que abriga o gerador de pulsos e o equipamento de medição TEEI, e o feixe de eletrodos, onde os substratos porosos são inseridos e ocorre a eletroporação. Diagramas para todos os componentes eletrônicos personalizados e impressos em 3D podem ser encontrados no GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Além da eletrônica personalizada, também é necessário um computador para que a plataforma funcione corretamente. O software personalizado requer o MATLAB (versão 2021a ou posterior) para ser executado e o Microsoft Excel para armazenar e acessar dados para análise. O programa controla a eletrônica personalizada e fornece a interface gráfica do usuário (GUI) para ajustar as configurações. Esses programas também foram disponibilizados no GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.
Dados preliminares sugerem que esse processo é possível para diferentes tipos de células aderentes (Figura 1C), mas este artigo discutirá apenas a preparação de células A431 usando parâmetros que foram considerados ideais para essa linhagem celular por Brooks et al.13. Além disso, como a carga de iodeto de propídio (PI) é citotóxica, dois experimentos são realizados, o primeiro com um meio de transfecção de PI de alta concentração para quantificar a eficiência de entrega e o segundo apenas com meios de cultura de células para medir o TEEI em escalas de tempo mais longas. Esses experimentos usam formas de onda de eletroporação idênticas, permitindo que os resultados sejam correlacionados (Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de montagem do feixe de eletrodos e dados fundamentais. (A) Modelo CAD de um inserto dentro de um poço do feixe de eletrodos. (B) Modelo CAD do feixe de eletrodos. (C) Aumento da impedância devido ao PSEP para linhagens celulares selecionadas, n = 3 por linhagem celular. Barra de erro: erro padrão da média. (D) Eficiência de entrega vs. TEEI aumenta os dados de correlação. A eficiência de entrega foi calculada dividindo o número de células marcadas nas imagens de PI e calceína dos experimentos de entrega pelo número total de células identificadas com Hoechst. A contagem de células foi determinada usando um pipeline personalizado do CellProfiler, n = 6 por tensão. Barra de erro: (eixos x e y) erro padrão da média. Esta figura é reproduzida de Brooks et al.13 com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro descartável de 2 chips</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2</td> frasco de cultura de tecidos <td>fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança Tipo II Tipo A2</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>Componentes Personalizados</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga Descartável (50 mL)</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td> Sistema de Aspiração de <td></td></tr><tr><td>Fluidos</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de Plasma Humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente Invertido</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR 200 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (0.2-2 &micro; L)</td> Pipeta <td>de FBE00002</td><td></td> <td>Elite da marca Fisherbrand</td></tr><tr><td>(100-1000 &micro; L)</td> Pipeta <td>Elite FBE01000</td><td></td> <td>da marca Fisherbrand</td></tr><tr><td>(20-200 &micro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (2-20 &micro; L)</td> <td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Reação de Iodeto de Propídio</td><td>Invitro</td><td>P1304MP</td><td></td>gen</tr><tr><td>1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24 poços)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0,4 &micro; m diâmetro dos poros, 2x106 cm-2 densidade dos poros,</td></tr><tr><td>transparente Placa de cultura de tecidos PET (24 poços)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

eletroporação baseada em substrato poroso com monitoramento de impedância elétrica transepitelial

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

O protocolo fornecido estabelece um método para usar medições TEEI para examinar os processos intermediários de eletroporação e fazer previsões de entrega, especificamente para a linha celular A431 e carga PI. Embora a modificação deste protocolo seja discutida mais adiante no artigo, é importante observar agora que, embora os valores específicos possam mudar, as tendências gerais na resposta permanecem consistentes. Por exemplo, os dados TEEI que caem abaixo da linha de base inicial correspondem à morte celular, enquanto o aumento máximo no valor TEEI acima do mínimo corresponde à eficiência de entrega13. Essas tendências gerais e suas implicações são exploradas abaixo.
Conforme mostrado na Figura 2A, uma variedade de tendências de medição TEEI e imagem celular pode surgir durante o uso da plataforma PSEP. O resultado ideal deste protocolo é produzir uma curva semelhante aos dados saudáveis otimizados mostrados na Figura 2Ai. Isso é caracterizado como o resultado ideal, pois não há queda abaixo da linha de base, indicando muito pouca ou nenhuma morte celular. Além disso, a curva saudável otimizada tem o maior aumento no TEEI do mínimo, indicando um alto grau de eficiência de entrega13. Essas inferências são apoiadas pela imagem pós-PSEP da monocamada celular, que revela morte celular insignificante e uma monocamada celular saudável e totalmente confluente (Figura 2Aiii). Além disso, um experimento de entrega bem-sucedido usando formas de onda PSEP idênticas pode ser caracterizado pelas imagens mostradas na Figura 2B. A aplicação adequada da forma de onda de eletroporação e a concentração de carga resultam em um alto grau de consistência de entrega e viabilidade celular.
A saúde e a confluência da monocamada celular são críticas para a aplicação bem-sucedida das previsões de entrega baseadas em TEEI16,17. Mesmo com uma forma de onda otimizada, uma monocamada celular não saudável ou incompleta resulta em uma resposta TEEI diminuída, conforme ilustrado pelos dados não saudáveis otimizados na Figura 2Aii. No entanto, note-se que as imagens para esse desfecho (Figura 2Avi) ainda correspondem à interpretação da resposta TEEI dada por Brooks et al.13. Não há queda abaixo da linha de base, indicando morte celular próxima de zero (Figura 2C, D). Além disso, o aumento reduzido do mínimo corresponde a um impacto negativo na eficiência de entrega, pois menos células na monocamada reduzem a entrega total de IP (Figura 2C, D).
Se uma forma de onda não otimizada for aplicada, é possível ver reduções ainda mais significativas na resposta TEEI. Dependendo da energia total e do período de tempo em que é aplicada, as formas de onda não otimizadas podem produzir resultados que variam de diminuição da eficiência à aniquilação quase total da monocamada celular (Figura 2Ai, iii, v). Ambas as curvas não otimizadas e muito não otimizadas mostram uma diminuição significativa da linha de base, indicando morte celular substancial. No entanto, formas de onda cada vez mais não otimizadas impedem a recuperação celular, resultando em menor eficiência de entrega.
A eficiência de entrega foi calculada dividindo o número de células marcadas nas imagens de PI e calceína dos experimentos de entrega pelo número total de células identificadas com Hoechst. A morte foi calculada tomando as células marcadas com PI em experimentos de medição TEEI e dividindo pelo número total de células identificadas com Hoechst. A contagem de células foi determinada usando um pipeline personalizado do CellProfiler para ambas as métricas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> Figura 2: Curvas de resposta TEEI e imagens para condições comuns. (A) (i) Dados de resposta TEEI ilustrando a variação percentual de TEEI para condições otimizadas e não otimizadas. (ii) Comparação da resposta TEEI entre monocamadas saudáveis e não saudáveis sob condições de forma de onda otimizadas. (iii-v) Imagens representativas de resultados potenciais para condições de forma de onda otimizadas e não otimizadas mostrando morte celular (vermelho) e células vivas (verde). (vi) Imagem representativa de monocamada não saudável após a aplicação de condições de forma de onda otimizadas mostrando células vivas de morte celular (vermelho) (verde). (B) Imagens mostrando a entrega bem-sucedida de IP (vermelho), células vivas (verde) e localizações de núcleos (azul). Todas as imagens foram iluminadas para maior clareza. Barras de escala: 1000 μm. (C) Diminuição do TEEI da linha de base pré-PSEP para o mínimo pós-PSEP e aumento do mínimo pós-PSEP para o pico pós-PSEP para determinadas tensões. (D) Eficiência de entrega e porcentagens de morte celular para determinadas tensões. As barras de erro representam o SEM (n = 6). (C,D) reproduzido de Brooks et al.13 com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

porous-substrate-based-electroporation-with-transepithelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.

Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Este protocolo usa modelagem computacional para quantificar limiares de eletroporação reversíveis e irreversíveis usando a distribuição espacial de células transfectadas dentro de uma imitação de tecido tridimensional para análise de alto rendimento de protocolos de eletroporação.

Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar um dispositivo microfluídico exclusivo de duas camadas para estudar a regulação eletromecânica da homeostase do tecido epitelial. O dispositivo aplica correntes elétricas fisiológicas estáticas perpendiculares ao plano do tecido, impactando a adesão, proliferação e extrusão célula-célula. Imagens de células vivas e medições de estresse mecânico revelam mecanismos desses processos.

Revelando o controle eletromecânico da homeostase tecidual usando um dispositivo microfluídico de duas camadas

Aprenda a técnica de eletroporação em substrato poroso com monitoramento de impedância elétrica transepitelial para biologia celular. Este método avança a compreensão dos estágios intermediários do processo.

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Explorar mais vídeos