Name: Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a técnica de rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente em tecido de camundongo embebido em parafina. Este método permite visualizar todas as regiões intestinais em um único bloco com resultados reproduzíveis.

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Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) concede K01 DK121869 à ACE e esta publicação foi apoiada em parte pelo T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) e as concessões fundamentais do HCS para SAD & RS. Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais da Universidade Médica da Carolina do Sul (MUSC) para ACE e foi apoiado pelo MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) e pelo COBRE em Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). A imagem foi realizada usando o núcleo de imagem celular e molecular no MUSC.

Método eficiente de rolo suíço para imunocoloração de alta qualidade do tecido intestinal

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
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<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
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<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
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<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
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<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
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<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um método otimizado para fixação tecidual usando a técnica de rolo suíço para preservar a arquitetura intestinal e promover imunocoloração precisa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para investigar uma ampla variedade de questões de pesquisa envolvendo fisiologia intestinal e biologia celular19. Vários métodos de laminação suíços otimizados foram publicados e são muito úteis20,21. Uma vantagem dessa técnica é a facilidade de abrir com precisão o intestino em papel de filtro. Isso permite que o tecido seja fixado de forma plana, evitando que o tecido se enrole para dentro ao rolar, o que é especialmente útil ao analisar o tecido inflamado com muscular espessada. Além disso, é essencial destacar o papel crítico da secção de tecidos na obtenção de resultados confiáveis. A secção adequada garante a preservação da arquitetura do tecido e facilita a imunomarcação precisa, contribuindo para o sucesso das análises a jusante11. A abordagem otimizada é menos difícil em comparação com outros protocolos, produzindo resultados consistentes entre diferentes indivíduos. A técnica apresentada neste artigo também fornece arquitetura de tecido bem preservada, versatilidade e imunocoloração altamente reprodutível usando diversos anticorpos.
Um aspecto crítico deste protocolo é o tempo de fixação e processamento. A fixação e o processamento inadequados do tecido podem prejudicar as análises histoquímicas. O tecido que está superfixado torna-se quebradiço, enquanto o tecido subfixado permanece muito mole. Tanto os tecidos sobrefixados quanto os subfixados são difíceis de seccionar e comprometem a imunocoloração. Uma vez dissecado em papel de filtro, o tecido deve ser imediatamente colocado em formol para reduzir as alterações post-mortem22. Neste protocolo, o tecido murino é fixado em formalina durante a noite. Vários estudos têm utilizado esse tempo de fixação20,23,24. No entanto, Boenisch et al. mostraram que a imunomarcação é consistente no tecido fixado em formalina por até 4 dias25. A otimização do tempo de fixação e fixador é necessária dependendo das análises desejadas. Por exemplo, o fixador de Carnoy é frequentemente preferido para coloração de muco26. A escolha dos fixadores e a duração do tempo de fixação devem ser otimizadas por cada pesquisador, dependendo de sua abordagem experimental. O uso de um processador de tecidos automatizado é recomendado para garantir tempos de processamento precisos e consistentes. Nosso laboratório usa pequenos pinos para manter o tecido intestinal no lugar como rolos. Sem alfinetes, o tecido pode se desenrolar durante o processamento. Como esses pinos são muito pequenos e afiados, precauções devem ser tomadas. Aconselhamos o uso de alicates para remover a ponta afiada do pino antes do processamento do tecido. Alguns núcleos histológicos não aceitam tecido com pinos; portanto, é melhor verificar antes de usar. Uma abordagem alternativa é usar ágar para ancorar o tecido antes do processamento27 ou esponjas de podem ser usadas em para ajudar a manter os rolos.
A imunocoloração é um protocolo que requer otimização para cada anticorpo. O uso de anticorpos validados por nocaute é recomendado sempre que possível. Este método para fixação e processamento de tecidos resulta em coloração clara, permitindo fácil identificação da ligação de anticorpos em comparação com o sinal de fundo quando anticorpos não validados estão sendo utilizados. A escolha do fixador, a recuperação do antígeno e a diluição do anticorpo podem afetar a especificidade do anticorpo. Recomendamos que os pesquisadores avaliem e otimizem cuidadosamente o protocolo, ajustando a fixação, a recuperação do antígeno e o tempo de incubação para cada anticorpo. Para obter os melhores resultados, os anticorpos devem ser testados em várias diluições para determinar a concentração ideal e em diferentes tampões de recuperação de antígenos. A recuperação de epítopos melhora a imunocoloração quebrando as pontes de metileno formadas durante a fixação. Neste protocolo, a recuperação de epítopos induzida por calor é usada em vez da recuperação de epítopos induzida por proteolíticos porque a digestão enzimática tem maior probabilidade de interromper a morfologia do tecido28. Os tampões de recuperação de epítopos induzidos por calor mais comuns são tampão citrato, tris-HCl e tris-EDTA, sendo o tampão citrato o mais suave na morfologia do tecido29. A escolha do tampão varia e deve ser determinada para cada anticorpo. Muitos tampões de recuperação de antígenos, soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos estão disponíveis comercialmente. No entanto, essas soluções podem ser extremamente caras e de custo proibitivo. Fornecemos receitas de soluções comuns de recuperação de antígenos e soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos para garantir a relação custo-benefício. 
Uma limitação desse método é que a fixação e o processamento podem alterar o tecido e mascarar epítopos. Uma abordagem alternativa é imunocorar o tecido fresco congelado. O tecido fresco congelado é congelado, permitindo evitar a exposição a fixadores tóxicos, preservando a estrutura da proteína e melhorando a acessibilidade de alguns epítopos. No entanto, a arquitetura e a morfologia do tecido são mais pobres do que as do tecido fixo e embebido em parafina. Outros desafios do tecido fresco congelado incluem os materiais e a logística necessários para seccionar e armazenar blocos e lâminas congelados. A análise de rolos suíços versus tiras de tecido intestinal mostra diferenças na altura e largura das vilosidades e diferenças nas células imunes na lâmina própria, conforme descrito em um relatório anterior30. Esses resultados sugerem que os rolos suíços intestinais alteram algumas características intestinais, que devem ser consideradas no planejamento de experimentos. Além disso, a revalidação de anticorpos é necessária, pois muitos anticorpos que se ligam especificamente ao tecido embebido em parafina fixado em formalina não se coram bem em tecido fresco congelado31.
A imunocoloração do tecido intestinal pode ser usada para responder a uma ampla variedade de perguntas sobre biologia e fisiologia das células gastrointestinais. Essa técnica é amplamente utilizada para identificar alterações epiteliais no contexto da inflamação intestinal, após infecção bacteriana e durante a progressão do câncer. O método aqui apresentado é ideal para a preservação do tecido intestinal porque é econômico, não é tecnicamente desafiador e altamente reprodutível. Para garantir os melhores resultados, incentivamos a otimização das etapas descritas neste protocolo com base no desenho experimental e na hipótese que está sendo testada.

A arquitetura celular do intestino representa um desafio único na manutenção de sua integridade estrutural quando o tecido intestinal está sendo preservado para imunocoloração. O intestino delgado é composto de estruturas alongadas semelhantes a dedos conhecidas como vilosidades1. Essas vilosidades geralmente ficam malformadas durante os processos de incorporação. Garantir que os pesquisadores tenham técnicas para incorporar adequadamente os intestinos para obter seções transversais, permitindo a visualização de todas as regiões do intestino, bem como das camadas que compõem o intestino (ou seja, muscular própria, mucosa e serosa), é crucial para uma análise experimental robusta2. A fixação inadequada, a fixação excessiva e o manuseio inadequado do tecido comprometerão a integridade do tecido, resultando em danos inadvertidos ao epitélio intestinal 3,4. Danificar o epitélio intestinal durante essas etapas pode diminuir significativamente a qualidade das análises subsequentes, como a imunofluorescência, independentemente da eficácia dos protocolos de imuno-histoquímica e dos anticorpos empregados.
A imunocoloração, como a fixação adequada do tecido, é uma parte importante da pesquisa biomédica. Quando bem feita, a imunocoloração pode iluminar aspectos anteriormente desconhecidos da estrutura e função celular. A coloração por imunofluorescência de cortes de parafina pode ser desafiadora devido a modificações físico-químicas resultantes do processo de fixação e inclusão de parafina5. A fixação e a inclusão em parafina resultam em mascaramento de antígenos que podem interferir na detecção de imunofluorescência de epítopos de interesse6. A fixação tardia pode induzir degradação proteolítica, o que resulta em coloração enfraquecida ou ausente de epítopos críticos7. Além disso, os anticorpos costumam ser imprecisos com altos níveis de fundo. Protocolos de imunocoloração que promovem a ligação consistente e específica de anticorpos e uma alta relação sinal-ruído podem fornecer informações valiosas para os pesquisadores. 
Aqui, fornecemos um protocolo abrangente projetado para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, preparação de rolo suíço8 e imunocoloração. Enfatizando diretrizes para preservar a integridade do intestino, o protocolo visa fornecer aos pesquisadores uma metodologia robusta para melhorar a qualidade e a confiabilidade dos estudos de imagem de imunofluorescência. Também procuramos usar recursos econômicos, incluindo papel de filtro e recuperação caseira de antígenos, soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos para tornar o protocolo mais acessível a laboratórios que podem ter fundos restritos. Como para todos os protocolos experimentais, os pesquisadores devem otimizar o protocolo atual com base em sua abordagem experimental e áreas de interesse.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de celulose</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Papel Whatman grosso</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro carregadas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de dissecação tamanho 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de freezer</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Aquecedor de slides</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>64111-04</td><td>Reagente de limpeza</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>grandes</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pinos</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloqueador de mouse sobre mouse</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Bloco de mouse com mouse</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Panela de Pressão</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong antifade de ouro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>Pinça de ação reversa</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coloração deslizante</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Pratos resistentes a solventes e estrutura de metal</td></tr><tr><td>pequenos</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>Fisher Bioreagentes</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Toalhetes Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

O intestino é um órgão complexo composto pelos intestinos delgado e grosso. O intestino delgado pode ser dividido em duodeno, jejuno e íleo. Cada região anatômica do intestino tem uma função única que se reflete nas diferenças na estrutura celular. Investigar alterações no intestino requer uma análise aprofundada de diferentes regiões teciduais e alterações celulares. Para estudar o intestino e visualizar grandes pedaços de tecido, os pesquisadores costumam usar uma técnica conhecida como rolos suíços intestinais. Nesta técnica, o intestino é dividido em cada região anatômica e fixado em uma orientação plana. Em seguida, o tecido é cuidadosamente enrolado e processado para inclusão em parafina. A fixação e orientação adequadas do tecido são uma técnica laboratorial frequentemente negligenciada, mas são extremamente importantes para a análise a jusante. Além disso, o enrolamento inadequado do tecido intestinal pode danificar o epitélio intestinal frágil, levando à má qualidade do tecido para imunocoloração. Garantir um tecido bem fixado e devidamente orientado com estruturas celulares intactas é uma etapa crucial que garante a visualização ideal das células intestinais. Apresentamos um método simples e econômico para fazer rolos suíços para incluir todas as seções do intestino em um único bloco embebido em parafina. Também descrevemos a coloração otimizada por imunofluorescência do tecido intestinal para estudar vários aspectos do epitélio intestinal. O protocolo a seguir fornece aos pesquisadores um guia abrangente para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, técnica de rolo suíço e imunocoloração. O emprego dessas abordagens refinadas preserva a intrincada morfologia do epitélio intestinal e promove uma compreensão mais profunda da fisiologia intestinal e da patobiologia.

Foi realizada coloração de hematoxilina e eosina (H&amp;E), conforme descrito anteriormente12. Usando o método otimizado, os rolos suíços intestinais incluíram todos os três segmentos do intestino delgado e do intestino grosso em uma única lâmina. Ter todo o intestino acomodado em uma lâmina permite que os pesquisadores analisem as alterações em todas as partes do intestino e economize custos com seccionamento e coloração de reagentes (Figura 1). Além disso, expor todos os segmentos intestinais às mesmas soluções simultaneamente durante a imunocoloração ajuda a garantir resultados precisos. A micrografia de H&amp;E demonstra a arquitetura intestinal preservada de todas as porções do intestino delgado e do intestino grosso (Figura 2). A medição das vilosidades duodenais não mostrou diferença significativa na altura das vilosidades no tecido intestinal fechado em comparação com este método de rolo suíço, sugerindo que a abertura do intestino não perturba a arquitetura do tecido (Figura 2D). A imunocoloração de rolos suíços intestinais mostra as várias camadas do intestino, bem como todo o eixo da cripta das vilosidades. As imagens fluorescentes mostram baixos níveis de fundo da coloração de anticorpos primários e secundários e retratam claramente as células individuais presentes no epitélio. A Figura 3 mostra a morfologia dos diferentes segmentos intestinais e a coloração das células caliciformes (células positivas para MUC2)13, da membrana apical (γ-ACTINA)14, da membrana lateral das células epiteliais (E-CADHERIN)15 e dos núcleos. Este protocolo é adequado para identificar muitos compartimentos celulares diferentes, incluindo células proliferativas (PCNA)16, interstício (LAMININA; Figura 4A) 17, o domínio lisossômico (LAMP1)14 e o epitélio (β-CATENINA; Figura 4B) 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho para preparação e processamento de rolos suíços intestinais. (A) Os segmentos intestinais são lavados com uma seringa contendo PBS e depois lavados em PBS. (B) O tecido intestinal úmido é então colocado em papel de filtro seco. (C) O intestino é aberto longitudinalmente em papel de filtro e (D) suavemente espalhado. (E) Um pedaço de papel de filtro é colocado em cima do intestino aberto, e o intestino é suavemente imprensado entre o papel de filtro e grampeado. Os segmentos intestinais são fixados durante a noite e (F) é enrolado com fórceps. (G) O intestino é suavemente desalojado da pinça de ação reversa e (H) tem uma aparência de roseta. (I, J) O tecido intestinal é fixado e colocado em um grande. (K) Todos os quatro segmentos intestinais são colocados no mesmo para processamento e incorporação de tecidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Figura 2: Coloração de hematoxilina e eosina de todos os quatro segmentos do intestino. (A) A digitalização de ladrilhos demonstra a capacidade de visualizar todo o intestino em uma única lâmina com rolos suíços individuais do duodeno, jejuno, íleo e cólon. (B) Micrografia de um rolo suíço intestinal e (C) inserção de maior ampliação para mostrar a arquitetura das vilosidades e criptas. (D) A quantificação do comprimento das vilosidades do intestino delgado no não mostra diferença significativa entre o tecido enrolado suíço e o tecido fechado. Barras de escala = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Figura 3: Coloração por imunofluorescência de todos os quatro segmentos do intestino. Camundongos controle C57BL/6J adultos foram imunomarcados para núcleos (ciano), o marcador de membrana lateral, E-CADHERIN (verde), células caliciformes identificadas por MUC2 (amarelo) e o marcador de borda em escova apical, γ-ACTIN, (magenta). Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Figura 4. Coloração de imunofluorescência do intestino. (A) Uma micrografia representativa da coloração por imunofluorescência do intestino de camundongo destaca núcleos (ciano), células proliferativas, PCNA (verde) e lâmina própria, LAMININA (magenta). (B) Imagem de imunofluorescência identificando núcleos (ciano), o marcador de membrana celular β-CATENINA (verde) e o marcador de lisossomo LAMP1 (magenta) no intestino. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

O intestino é vital para a digestão e absorção. Cada região - duodeno, jejuno, íleo, cólon - tem funções distintas devido a estruturas celulares únicas. Estudar a fisiologia intestinal exige uma análise meticulosa do tecido. Este protocolo descreve a fixação e o processamento do tecido usando a técnica do rolo suíço, garantindo uma imunocoloração precisa por meio da preservação e orientação adequadas do tecido.

Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo ilustra um método baseado em imunofluorescência para visualizar células de tufo intestinal em criossecções de jejuno de camundongo flutuantes. Dentro das vilosidades intestinais, a co-localização da fluorescência verde na ponta luminal com uma massa radicular vermelha estendida indica a presença de células de tufo.

Um método baseado em imunofluorescência para visualização de células de tufo em criosseções de jejuno

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Células-tronco do epitélio intestinal (ISC) são misturados com células de Paneth. Estas células são diferenciadas progênie do ISC, que suportam o ISC e fornecer proteção antibacteriana. Aqui demonstramos como nós usamos modelos de ratos transgénicos condicionais para estabelecer que as células de Paneth desempenham um papel crucial na manutenção dos epitélio intestinal.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Models

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Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

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Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

Kuga et al descobriram que anticorpos específicos de fosforilação-estatuto contra a ligação actina proteína girdin fosforilado em tirosina 1798 (pY1798) podem ser usados para rotular o topete células (TCs). Este protocolo permite visualização robusta de SCT usando coloração imunofluorescente de jejuno flutuantes cryosections com anticorpos pY1798.

Uso de anticorpos Antifosfo-girdin Visualizar células intestinais topete no Mouse flutuante Jejunum Cryosections

A pontuação sistemática da inflamação intestinal usando um sistema gratuito assistido por computador é uma ferramenta poderosa para comparar quantitativamente alterações histopatológicas em modelos de colite caracterizados pela presença de úlceras e alterações inflamatórias. A avaliação do escore da colite histológica fortalece as observações clínicas e facilita a interpretação dos dados.

Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran

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Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

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Mapeamento Espacial Aprimorado das Camadas de Músculo Gástrico de Camundongos usando uma técnica modificada do Swiss Roll

Aprenda a técnica de rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente em tecido de camundongo embebido em parafina. Este método permite visualizar todas as regiões intestinais em um único bloco com resultados reproduzíveis.

Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina

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