Name: Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Aprenda a detectar amplificação gênica em amostras FFPE usando hibridização in situ por fluorescência. Este método otimizado melhora a qualidade dos dados para estudar oncogenes em câncer.

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SW é um estudioso e é apoiado pelo Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (RR210034)

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia.
1. Preparação de reagentes e materiais
<ol><li>Preparar a solução de cloreto de sódio (HCl) 0,2 N numa hotte adicionando lentamente 8,212 ml de HCl (37% p/p ou 12,1 N) a 491,788 ml de ddH2O. Conservar à temperatura ambiente (RT). CUIDADO: Adicione ácido lentamente à água. Não adicione água ao ácido.</li>
	<li>Prepare a solução de ácido cítrico 10 mM (pH 6,0) dissolvendo 1,47 g de citrato trissódico (di-hidratado) em 400 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar para pH 6,0 e, em seguida, aumente o volume final para 500 mL com ddH2O. Armazene o tampão em RT.</li>
	<li>Prepare a solução de Tween-20 a 10% adicionando 100 μL de Tween-20 a 900 μL de ddH2O. Armazene-o em RT.</li>
	<li>Prepare a solução de IGEPAL a 10% adicionando 5 mL de IGEPAL CA-630 a 45 mL de ddH2O. Armazene-o em RT.</li>
	<li>Prepare a solução 20x SSC (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M Citrato de Sódio) dissolvendo 44,1 g de citrato trissódico (di-hidratado) e 87,65 g de cloreto de sódio (NaCl) em 900 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar para pH 7,0 e, em seguida, leve o volume final para 1000 mL com ddH2O. Armazene o tampão em RT.</li>
	<li>Prepare a solução 2x SSC adicionando 100 mL de 20x SSC a 900 mL de ddH2O. Se necessário, adicione 0,5 mL de conservante (Tabela de Materiais). Armazene-o no RT.</li>
	<li>Prepare o tampão de hibridização da sonda misturando 910 μL de ddH2O, 500 μL de 20x SSC, 50 μL de 10% Tween-20, 40 μL de RNase A, 1 mL de sulfato de dextrano a 50% e 2,5 mL de formamida. Alíquota em 1 mL e armazene-os a -20 °C.</li>
	<li>Prepare o SSC 0,4x com solução IGEPAL a 0,3% misturando 100 mL de 2x SSC, 15 mL de IGEPAL a 10% e 385 mL de ddH2O. Armazene-o em RT.</li>
	<li>Prepare o 2x SSC com solução de IGEPAL a 0,1% adicionando 5 mL de IGEPAL a 10% a 495 mL de solução 2x SSC. Armazene-o no RT.</li>
	<li>Prepare o tampão de digestão da proteinase K antes de usar, adicionando 1 μL de proteinase K a 99 μL de tampão Tris-EDTA.</li>
	<li>Prepare 1 mg/mL de DAPI dissolvendo 1 mg de DAPI em 1 mL de ddH2O. Armazene-o a -20 °C e longe da luz. Prepare a solução de trabalho DAPI adicionando 1 μL do estoque de armazenamento DAPI a 999 μL de solução 2x SSC. Mantenha longe da luz até o uso.</li>
</ol>2. Pré-tratamento da amostra
NOTA: O slide usado aqui contém a amostra.
<ol><li>Envelheça o slide a 60-90 ° C por 20 min ou durante a noite (Figura 1). NOTA: Esta etapa facilita o derretimento da parafina. Normalmente, 20 minutos de aquecimento são suficientes. Pode ser estendido para durante a noite para acomodar a programação.</li>
	<li>Desparafinize a lâmina mergulhando-a em xileno ou seus substitutos em um frasco de Coplin por 10 min. Repita esta etapa com xileno fresco ou seus substitutos. Execute todas as etapas de pré-tratamento e lavagem a seguir em um frasco Coplin. NOTA: Os substitutos do xileno são alternativas seguras e ecológicas ao xileno. Um dos substitutos (ver Tabela de Materiais) tem um desempenho tão bom quanto o xileno, se não melhor. Embora os substitutos do xileno produzam menos odor do que o xileno, recomenda-se usá-lo dentro de uma capela de exaustão. Se os substitutos do xileno não estiverem acessíveis, todos os procedimentos são compatíveis com a desparafinização à base de xileno sem nenhuma alteração.</li>
	<li>Lave o substituto de xileno com etanol 100% por 5 min.</li>
	<li>Reidrate a lâmina com imersão em etanol a 70% por 5 min.</li>
	<li>Mergulhe a lâmina em ácido clorídrico (HCl) 0,2 N em RT por 20 min. NOTA: O HCl extrai efetivamente proteínas solúveis em ácido, como proteínas nucleares básicas, para melhorar a acessibilidade do DNA às sondas FISH11.</li>
	<li>Mergulhe a lâmina em 10 mM de solução quente de ácido cítrico e incube a 90-95 °C por 20 min. NOTA: O tratamento com ácido cítrico sob altas temperaturas extrai de forma semelhante as proteínas solúveis em ácido. Acredita-se que ambos os tratamentos ácidos extraiam proteínas da matriz extracelular para diminuir a autofluorescência12. Recomenda-se que a solução cítrica seja pré-aquecida até a faixa de temperatura desejada antes de ser aplicada na lâmina. O micro-ondas pode ser uma maneira conveniente de fazer isso. Um banho-maria, como um fogão sous vide, é a solução mais eficaz e econômica para incubação em alta temperatura.</li>
	<li>Enxágue a lâmina brevemente em 2x SSC para neutralizar o pH.</li>
	<li>Digerir o tecido adicionando 100-200 μL (o suficiente para cobrir completamente o tecido, dependendo do tamanho da seção) de tampão de digestão da proteinase K e incubar em RT por 1 min. NOTA: A digestão da proteinase K aumenta ainda mais a acessibilidade das sondas FISH e reduz a autofluorescência. O tempo de digestão deve ser otimizado com base nos tipos de tecido. Na maioria dos casos, 1 minuto de digestão é suficiente. A digestão excessiva leva à morfologia dos núcleos em forma de halo, e o tempo de digestão deve ser reduzido.</li>
	<li>Pare imediatamente a digestão da proteinase K e desidrate a lâmina imergindo-a em etanol a 70% por 2 min, seguido de tratamento com etanol a 85% e 100% por 2 min cada.</li>
</ol>3. FISH e imagens
<ol><li>Prepare a mistura de hibridização FISH diluindo 2 μL de estoque de sonda FISH com 8 μL de tampão de hibridização e, em seguida, aplique-o na lâmina. Cubra a amostra com uma lamínula. NOTA: O estoque total de sonda FISH usado varia de 0,5 a 4 μL, dependendo da qualidade da imagem. Se o sinal estiver muito baixo, aumente a entrada da sonda. Reduza a entrada da sonda FISH se o fundo for muito alto, especialmente quando forem observados detritos fluorescentes fora dos núcleos. O tampão de hibridização pode ser aquele fornecido com as sondas adquiridas comercialmente ou preparado como na seção 1.</li>
	<li>Coloque as lâminas em uma placa quente, como um sistema de hibridização de fosso de lâminas, para desnaturar o DNA a 75 ° C por 2-5 min. Em seguida, transfira a corrediça para outra placa de aquecimento regulada a 37 °C para hibridizar durante a noite. NOTA: Se a placa de aquecimento tiver uma bandeja ou reservatório de água para manter a umidade durante a hibridização, é desnecessário selar a lamínula com cimento de borracha.</li>
	<li>Após a hibridização, mergulhe a lâmina em 40-60 °C aquecido 0,4x SSC com 0,3% de tampão de lavagem IGEPAL CA-630 e, em seguida, remova cuidadosamente a lamínula. Continue a lavagem duas vezes por 5 minutos cada no escuro, com agitação nos primeiros 10-15 s. NOTA: Mergulhar a corrediça no tampão de lavagem ajuda a liberar suavemente a lamínula.</li>
	<li>Lave a lâmina em SSC com 0,1% IGEPAL CA-630 por 5 min em RT no escuro, com agitação nos primeiros 10-15 s.</li>
	<li>Para extinguir a autofluorescência, trate a lâmina com o kit de têmpera de autofluorescência (consulte a Tabela de Materiais) aplicando 150 μL de reagente (50 μL + 50 μL + 50 μL de reagentes A, B, C) por 2-5 min e, em seguida, lave-o com 2x SSC por 5 min. NOTA: Esta é uma etapa opcional. A autofluorescência tecidual origina-se principalmente de componentes da matriz extracelular, como colágeno e elastina. Também é significativamente influenciado por lisossomos e mitocôndrias devido ao seu conteúdo de lipofuscina, NADPH e flavina coenzima. A fixação de aldeídos e a presença de células sanguíneas também podem aumentar bem a autofluorescência13,14.</li>
	<li>Manchar a lâmina com DAPI durante 10 min. Enxágue a lâmina com 2x SSC tampão por 5 min. NOTA: Se a lâmina não for tratada pelo kit de têmpera de autofluorescência, a coloração DAPI pode ser reduzida para 2 min.</li>
	<li>Mergulhe rapidamente a lâmina em água deionizada por não mais de 1 s e, em seguida, seque-a rapidamente absorvendo a umidade extra com uma toalha de papel. NOTA: Esta é uma etapa opcional. O tratamento de água deionizada evita efetivamente a deposição de cristais de sal do tampão SSC na lâmina e melhora a qualidade da imagem. No entanto, sob condições de íons tão baixos, as ligações de hidrogênio entre a sonda FISH e o DNA alvo são enfraquecidas, levando à dissociação da sonda e perda de sinal. Portanto, manter a etapa de tratamento da água por um tempo muito curto é crucial.</li>
	<li>Seque o slide e monte-o com mídia de montagem antidesbotamento. Sele a lamínula com esmalte antes de fazer a imagem. NOTA: Se a lâmina for tratada com reagente de têmpera de autofluorescência, monte a lâmina com um meio de montagem antidesbotamento de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, dependendo do tipo de meio de montagem, endurecimento ou não, a amostra deve ser curada por 1-24 h antes da selagem e imagem. Recomenda-se que a amostra seja curada pelo menos durante a noite para obter o melhor índice de refração para imagem.</li>
	<li>Use uma lente de óleo de 60× para capturar o sinal de fluorescência. Use o canal DAPI para ajustar o foco. Certifique-se de obter várias pilhas Z. Normalmente, 5-10 pilhas z com um intervalo de 1 μm são suficientes. Realize uma projeção 3D máxima para obter a melhor resolução. Aplique algoritmos de deconvolução ou outros algoritmos de limpeza de fundo para melhorar ainda mais a qualidade da imagem.</li>
</ol>

Aprimorando a análise de FISH para drivers oncogênicos em amostras de tecido cancerígeno

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. é membro do conselho consultivo científico da Dimension Genomics Inc.

A FISH é uma opção rápida e acessível para o diagnóstico citogenético. Especialmente para determinar se o ecDNA está presente no câncer, a evidência de FISH continua sendo o padrão-ouro1. O FISH no tecido FFPE permite a determinação rápida do status do gene nas amostras de biópsia de um paciente, permitindo um diagnóstico mais rápido e rastreando as alterações ao longo do progresso da doença. Esta técnica é particularmente valiosa para testar amostras clínicas que já foram coletadas para patologia.
Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro passo é a desparafinização completa. A parafina residual pode interromper a hibridização de FISH. Se a amostra ainda parecer cerosa após a etapa 2, ela deve ser tratada novamente com xileno fresco ou seus substitutos.
Em segundo lugar, a extração e a digestão de proteínas são críticas. Esses processos não apenas aumentam a acessibilidade do DNA à sonda FISH, mas também reduzem significativamente a autofluorescência. Este protocolo inclui três etapas de desproteinização. Embora o tratamento com HCl 0,2 N e ácido cítrico 10 mM seja simples, a digestão da proteinase K pode exigir otimização. A digestão excessiva é o erro mais comum ao usar a proteinase K, resultando em núcleos em forma de halo. Encurtar o tempo de digestão melhorará a morfologia dos núcleos. Além disso, recomenda-se não digerir mais de quatro amostras simultaneamente para minimizar a diferença de tempo entre a primeira e a última amostra. É importante notar que mesmo um núcleo intacto pode aparecer como um halo sob microscopia de alta ampliação e alta resolução. Isso ocorre porque o núcleo não está no mesmo plano focal. Portanto, sugere-se pegar várias pilhas Z e realizar uma projeção máxima para inspecionar a morfologia nuclear.
Por fim, recomenda-se a autofluorescência de têmpera. Embora a extração ácida e a digestão da proteinase K possam reduzir significativamente o fundo derivado de proteínas, os metabólitos fluorescentes ainda podem afetar a qualidade da imagem.
Embora o FISH ofereça resolução espacial incomparável na identificação da amplificação focal de genes, ele tem limitações. Primeiro, o conteúdo e o rendimento são baixos em comparação com as abordagens baseadas em PCR ou sequenciamento de próxima geração (NGS). Normalmente, uma a três sondas FISH de cores diferentes podem ser aplicadas a uma única lâmina sem equipamento especializado. No entanto, os avanços nas tecnologias de automação tornaram viável o FISH de alto conteúdo e alto rendimento, como o sequenciamento in situ 21. Em segundo lugar, o projeto da sonda FISH requer informações prévias. Os esforços contínuos para identificar eventos recorrentes de amplificação focal no câncer permitiram a criação de painéis FISH pré-projetados para aplicações laboratoriais e clínicas. Por exemplo, os oncogenes da família MYC são frequentemente amplificados como ecDNA no câncer de pulmão de pequenas células para mediar a resistência à quimioterapia. Portanto, um painel FISH direcionado aos genes MYC, MYCL e MYCN pode acelerar a determinação das respostas ao tratamento em biópsias. Em comparação, o NGS permite uma triagem mais imparcial dos genes de interesse. No entanto, entre as tecnologias baseadas em NGS, apenas o sequenciamento do genoma completo com análise computacional cara22 pode caracterizar o ecDNA.
Em resumo, apresentamos instruções robustas e abrangentes para investigar a amplificação de genes focais em amostras FFPE. Ao examinar o padrão de sinal FISH, torna-se inequivocamente claro se e como um locus gênico é amplificado. Prevemos a integração do aprendizado de máquina na análise de imagens23 de núcleos interfásicos para extrair informações citogenéticas sobre o número de cópias e a forma de amplificação (cromossomo ou ecDNA), simplificando assim o processo de diagnóstico molecular e aprimorando nossa compreensão dos mecanismos patogenéticos no câncer.

O estudo da amplificação de oncogenes focais é crucial, pois impulsiona a formação, progressão e resistência à terapiado câncer 1. É importante ressaltar que oncogenes e genes imunorreguladores podem se amplificar como DNAs extracromossômicos (ecDNA), cuja herança assimétrica promove heterogeneidade genética no câncer 2,3. O ecDNA tem sido associado à resistência à terapia e a resultados clínicos desfavoráveis 4,5,6.
Amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) representam um vasto recurso de arquivo em laboratórios de patologia, oferecendo informações abundantes para estudos retrospectivos. No entanto, a extração de dados moleculares de amostras FFPE por meio de PCR ou sequenciamento é um desafio devido à fragmentação, degradação e reticulação de ácidos nucleicos durante a fixação7. Entre a variedade de técnicas disponíveis para análise molecular de tecidos FFPE, a hibridização in situ fluorescente (FISH) provou ser eficaz na visualização de sequências específicas de DNA8.
Apesar do avanço das técnicas modernas de diagnóstico molecular, a capacidade do FISH de visualizar e quantificar a amplificação gênica no nível de uma única célula fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à tumorigênese e aos resultados clínicos. Ao usar sondas marcadas com fluorescência complementares ao gene alvo de interesse, o FISH pode resolver convenientemente a localização de um oncogene e pode inferir a forma de amplificação do oncogene (como o ecDNA) dentro de células individuais, o que de outra forma seria impossível ou caro por meio de outras tecnologias. Portanto, o FISH oferece uma maneira econômica de avaliar a heterogeneidade do tumor e a evolução clonal9. Além disso, os avanços na automação, imagem e análise computacional facilitaram a análise de alto rendimento dos dados FISH, permitindo a quantificação robusta da amplificação gênica em grandes coortes de tecidos10.
No entanto, a aplicação de FISH ao tecido FFPE apresenta desafios inerentes, incluindo artefatos de reticulação e autofluorescência de fundo. A superação desses obstáculos requer uma otimização cuidadosa de cada procedimento para garantir resultados precisos e reprodutíveis. Este artigo fornece um protocolo passo a passo totalmente otimizado para a aplicação de FISH para investigar a amplificação gênica em amostras de tecido FFPE. Usando uma sonda direcionada ao locus do gene ERBB2 (HER2), demonstramos que o FISH pode detectar de forma robusta o status de amplificação de ERBB2 em amostras FFPE de pacientes com câncer de mama. É até possível estimar se o ERBB2 é amplificado como ecDNAs. Ao sintetizar a literatura existente e nossas descobertas experimentais, elucidamos as considerações metodológicas, os desafios técnicos e as possíveis armadilhas da análise baseada em FISH. Também discutimos a relevância clínica do perfil de amplificação gênica em vários tipos de câncer, destacando seu significado prognóstico e potencial para estratégias terapêuticas personalizadas.
Em resumo, este artigo ressalta a importância do FISH como uma ferramenta valiosa para estudar a amplificação gênica em amostras de tecido FFPE, oferecendo insights incomparáveis sobre a biologia do tumor e orientando a tomada de decisões clínicas em oncologia. Com refinamento e integração contínuos com ensaios moleculares complementares, a análise baseada em FISH está pronta para aprimorar ainda mais nossa compreensão da patogênese do câncer e melhorar os resultados dos pacientes na era da medicina de precisão.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>Coloração do núcleo</td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano 50% solução</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>Sonda tampão de hibridização</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) FISH Sonda</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>Sonda FISH</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Tecido desidratante e hidratante</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Thermo Scientific Produtos químicos</td><td>205821000</td><td>Tampão de hibridização de sonda</td></tr><tr><td>Fórmula 83 (Substituto de xileno)</td><td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>Removendo parafina</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td>Amostra de pré-tratamento</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Produtos Químicos Thermo Scientific</td><td>J19628K2</td><td>Lavagem de lâminas</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>Conservante para tampão SSC (opcional)</td></tr><tr><td>Proteinase K (800 unidades/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>Digestão de proteínas</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>Sonda de hibridização buffer</td></tr> Sistema <tr><td>de Hibridização</td> <td>Slide MoatBoekel Scientific</td><td>280001</td><td>Desnaturação e hibridização de amostras. Placas quentes alternativas são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Tampão Fisher Chemical</td><td>S2713</td><td>SSC</td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>Fisher BioReagents</td><td>FLBP3271</td><td>Tampão SSC e pré-tratamento de amostra</td></tr><tr><td>Tampão Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2473500</td><td>Tampão de digestão de proteinase K</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td>Tampão de hibridização de sonda</td></tr><tr><td>Vectashield mídia de montagem anti-desbotamento</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H190010</td><td>Montagem deslizante</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>Kit de têmpera de autofluorescência</td> <td>SP8400</td></tr></tbody></table>

detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

A amplificação focal de genes, como o DNA extracromossômico (ecDNA), desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer e na resistência à terapia. Embora as metodologias baseadas em sequenciamento permitam uma identificação imparcial do ecDNA, as técnicas baseadas em citogenética, como a hibridização in situ fluorescente (FISH), permanecem econômicas e de tempo para identificar o ecDNA em amostras clínicas. A aplicação de FISH em amostras de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) oferece um caminho único para detectar genes amplificados, particularmente quando amostras viáveis não estão disponíveis para exame de cariótipo. No entanto, faltam procedimentos de consenso para essa técnica. Este protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes, totalmente otimizadas para a realização de FISH para detectar amplificação gênica, incluindo ecDNA, em amostras de tecido FFPE que apresentam desafios únicos que este protocolo visa superar e padronizar. Seguindo este protocolo, os pesquisadores podem adquirir de forma reprodutível dados de imagem de alta qualidade para avaliar a amplificação gênica.

Usamos amostras FFPE de cânceres de mama HER2-positivos e negativos para demonstrar o resultado da imagem FISH. A amplificação do HER2 (codificado pelo gene ERBB2 ) é um marcador favorável devido à disponibilidade e eficácia das terapias de direcionamento molecular do HER2. Pelo contrário, pacientes com câncer de mama triplo-negativo, que não têm expressão de HER2, receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR), enfrentam resultados ruins devido a opções terapêuticas limitadas. Portanto, determinar o status de HER2 é crucial na pesquisa e tratamento do câncer de mama15.
Na amostra de câncer de mama triplo-negativo, a maioria dos núcleos exibe dois pontos distintos representando sinais FISH2 / ERBB2 . Alguns núcleos podem ter apenas um ponto devido ao viés de seccionamento (Figura 2, à esquerda). Em contraste, as amostras positivas para HER2 apresentam sinais abundantes de FISH com dois padrões diferentes. Um padrão mostra pontos espalhados por todo o núcleo (Figura 2, meio). Esse padrão é uma característica da morfologia do ecDNA, pois os ecDNAs podem não ocupar um território nuclear único e organizado16. Além disso, a segregação assimétrica dos ecDNAs durante a mitose leva à variação do número de cópias, levando à heterogeneidade do sinal entre os núcleos17. Alguns núcleos podem apresentar aglomerados ocasionais, indicativos de hubs de ecDNA18 (Figura 2, à direita). O outro tipo de amplificação HER2 exibe principalmente agregados condensados em forma de haste. Essa morfologia provavelmente indica amplificação baseada em cromossomos, como regiões de coloração homogênea (HSR) 19 ou através do ciclo de quebra-fusão-ponte (BFB)20 . Notavelmente, a amplificação de ecDNA, HSR e BFB podem coexistir no mesmo núcleo. Portanto, o exame de múltiplos núcleos é recomendado para inferir a forma de amplificação focal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para FISH em amostras FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> Figura 2: Imagem FISH representativa em amostras FFPE de câncer de mama. Ampliação: 600x; Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Este protocolo fornece um método reprodutível para visualizar a amplificação gênica em amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

O objetivo deste vídeo é para demonstrar como executar extração de DNA automatizado a partir de linhas fixas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de referência padrão de células e de gotículas digital de análise de PCR (ddPCR) para detectar mutações raras em um ambiente clínico. Detecção de mutações em amostras de FFPE demonstra a utilidade clínica de ddPCR em amostras FFPE.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Hibridação in situ de fluorescência (FISH) é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular para seleção da terapia na medicina personalizada. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol romance que permite alta qualidade morfológica, molecular e análises de peixes do mesmo espécime por adição de uma etapa pós-fixação antes de peixes é apresentado.

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a detectar amplificação gênica em amostras FFPE usando hibridização in situ por fluorescência. Este método otimizado melhora a qualidade dos dados para estudar oncogenes em câncer.

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

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