Name: Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Explore circuitos imunometabólicos na infecção por Leishmania major usando circuitos sintéticos controlados por tetraciclina. Este método demonstra eliminação de parasitas e modulação de citocinas para terapias direcionadas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Diretor do Conselho de Pesquisa e Inovação em Biotecnologia - Centro Nacional de Ciência Celular (BRIC-NCCS), Pune, por apoiar nossa pesquisa e o BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

Projetando circuitos sintéticos controlados por tetraciclina para terapia de leishmaniose

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<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
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<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+type+II+dehydrogenase+is+essential+for+parasite+viability+irrespective+of+the+presence+of+an+active+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
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<li>Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+the+design+of+synthetic+gene+networks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells.</a> FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
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<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os resultados obtidos ressaltam a eficiência do duto, que foi canalizado para o projeto e implementação de um circuito sintético. A construção desse circuito sintético foi um passo para o desenvolvimento da medicina de precisão para doenças infecciosas como a leishmaniose. Através da montagem in silico de partes genéticas e simulação determinística, o efeito modulatório diferenciado do sistema TetON foi monitorado. O efeito do circuito, notavelmente, pode ter levado à expressão biestável recíproca de TetR e SDHA / GFP. A expressão de SDHA foi periódica, o que pode indicar que apenas na presença de doxiciclina sua expressão foi aumentada. Para observar possíveis mudanças nos padrões de expressão ao longo de um período, uma unidade de tempo de 100 foi selecionada. Os resultados identificam que o circuito sintético apresentou comportamento periódico para TetR e SDHA/GFP, provavelmente atribuível à sua natureza ortogonal21. A montagem de partes genéticas do registro de peças iGEM desempenhou um papel fundamental, pois forneceu componentes genéticos necessários para a construção de circuitos sintéticos22. O arranjo modular das partes genéticas é essencial, pois a tradução e o funcionamento do circuito podem ser afetados, o que pode levar a uma expressão ineficiente e efeito modulatório nas células23.
O tamanho da inserção do circuito sintético foi de aproximadamente 1,3 kb para garantir que o tamanho do vetor não seja muito grande, o que pode potencialmente reduzir a eficiência da transformação24. A seleção de um vetor apropriado é uma etapa crítica, pois ele deve possuir partes genéticas, que são essenciais para aumentar o número de cópias no sistema bacteriano e produzir alta cópia de plasmídeo, e sua maquinaria de expressão deve se adaptar bem no sistema de mamíferos25. O vetor pEGFP-N1 é bem caracterizado na linhagem RAW264.7 e possui uma estrutura plasmidial compacta com um sítio de clonagem múltipla26. Soluções tampão padronizadas em laboratório foram empregadas para isolamento de plasmídeo para garantir a produção de plasmídeo altamente concentrado e puro, que foi validado por meio de estimativa espectrofotométrica e AGE. A inserção do circuito sintético no vetor pEGFP-N1 foi validada por meio de digestão por restrição, e as amostras foram analisadas em AGE e sequenciamento. Os resultados do AGE representaram uma banda de inserção de 1,3 kb, uma banda de 4,7 kb do vetor pEGFP-N1 e uma banda de 6 kb de todo o circuito sintético. 
A transfecção usando proporções de DNA: PEI de 1:1, 1:2 e 2:1 foi realizada, onde a proporção observada de 1:1 funcionou melhor sem interromper a morfologia celular (dados não mostrados). Recomenda-se o uso da concentração de 400 μg/mL - 1000 μg/mL de G418 para seleção de células transfectadas27. Um 500 μg/mL de G418 foi usado para a seleção de células transfectadas, pois suprimiu efetivamente o crescimento de células não transfectadas sem comprometer o crescimento celular ou a morfologia das células transfectadas (dados não mostrados). Dada a importância do fenótipo celular na eficiência da transfecção, particularmente em linhagens celulares de macrófagos, que podem sofrer diferenciação e se tornar difíceis de transfectar, um baixo número de passagem da linhagem celular RAW264.7 foi usado para transformação28. O número de passagens celulares também pode ser um fator crítico na eficiência da transfecção. Um alto número de passagens pode levar a uma transfecção ineficiente29. Dox é o indutor preferido para o sistema de indução Tet-ON devido à sua alta eficiência de ligação ao TetR, distribuição tecidual favorável, baixa toxicidade e meia-vida de 24 h30. Após a transfecção, as células foram induzidas com dox por 24 h, e foram observadas quanto à expressão de GFP. Para células RAW264.7, a concentração de dox usada para indução de circuito sintético foi de 1 μg / mL, que cai na faixa recomendada de 1-2 μg / mL31 (dados não mostrados). No entanto, a regulação da concentração de SDHA pós-indução foi indeterminada. No geral, a determinação e padronização do número de passagem celular, DNA: concentração de PEI, concentração de marcador de seleção de transfecção de mamíferos e concentração de indução de doxiciclina são fatores cruciais no processo de transfecção.
Após a indução do circuito sintético pós-infecção em diferentes momentos, foi observada uma redução significativa na carga parasitária intracelular. Uma comparação das cargas parasitárias entre amostras infectadas e IMTI revelou uma carga menor nas células induzidas com o circuito sintético, provavelmente atribuível à expressão de SDHA. Como a expressão de SDHA está associada à produção de NO, observou-se que as células IMTI têm uma forma morfológica irregular e rugosa, que ocorre na linhagem celular RAW264.7 quando o NO é produzido32. Os níveis de IL-10 e IL-12 após a infecção de 6 h foram mais altos, pois ambas as citocinas foram relatadas como reguladas positivamente neste momento, que sofre modificação fenotípica para produzir IL-10 mais do que IL-1219. Como os níveis de IL-10 e IL-12 não alteraram significativamente a pós-transfecção e nas amostras de IMTI, o perfil de citocinas foi realizado para detectar respostas de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. 
Os níveis de expressão de TNF-α, IFN-γ e TGF-β foram identificados em amostras de infecção de 6 h, IMT e IMTI de 24 h. Para eliminar parasitas intracelulares, TNF-α e IFN-γ são essenciais principalmente, pois induzem explosões oxidativas através da produção de NO. Os macrófagos polarizados M2 expressam TGF-β, que regula negativamente as citocinas pró-inflamatórias33. A amostra IMTI de 24 h mostrou maior expressão de TNF-α e IFN-γ do que TGF-β, o que sugere que os macrófagos, após transfecção e infecção por L. major, podem ter polarizado para fenótipo de expressão de citocinas pró-inflamatórias. O estudo, portanto, fornece informações sobre as alterações fenotípicas induzidas na transfecção com um circuito sintético e destaca a dinâmica da infecção. O efeito dos circuitos sintéticos como terapêuticos pode ser investigado, pois sua indução aumentou significativamente a expressão de citocinas pró-inflamatórias em comparação com a citocina anti-inflamatória. Assim, o estudo não apenas estabeleceu o pipeline de construção e entrega de circuitos sintéticos, mas também demonstrou seu potencial terapêutico em um modelo de leishmaniose por meio da regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias em células hospedeiras desafiadas por Leishmania.

O avanço da medicina holística e integrativa é uma ligação significativa que foi identificada entre alterações metabólicas nas células imunes e sua capacidade de modular o fenótipo das células imunes em doenças infecciosas. O imunometabolismo oferece novas perspectivas para elucidar a patogênese das doenças infecciosas prevalentes em humanos. Além disso, fornece técnicas promissoras para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos, identificando novos alvos para intervenção1. A reprogramação metabólica das células imunes é identificada em várias doenças infecciosas, incluindo a leishmaniose. Leishmania spp. é responsável por causar leishmaniose, sendo que Leishmania major (L. major) causa leishmaniose tegumentar (LC). Os parasitas L. major provocam um impacto significativo no metabolismo das células hospedeiras, particularmente em macrófagos, para proliferação e sobrevivência como parasitas intracelulares2. Os macrófagos podem normalmente polarizar em subconjuntos classicamente ativados (M1) ou alternativamente ativados (M2), onde as células M1 possuem alta secreção de citocinas pró-inflamatórias e produção de óxido nítrico (NO) através do metabolismo de espécies de nitrogênio. As células M2 exibem níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e exibem alta atividade de arginase através do metabolismo do nitrogênio3. Assim, ambos os fenótipos diferem não apenas por sua resposta imune, mas também por suas vias metabólicas.
A biologia de sistemas da leishmaniose visa identificar alvos moleculares para o design de novas terapêuticas por meio do design e desenvolvimento de medicamentos. A reconstrução de redes de sinalização e vias metabólicas auxilia na compreensão da leishmaniose como um modelo holístico e extrai insights para a identificação do principal componente que impulsiona o estado de doença. A modelagem matemática é uma das abordagens analíticas aplicadas mais favorecidas para a compreensão das complexidades da leishmaniose4. Redes imunometabólicas e modelos matemáticos permitiram a identificação da succinato desidrogenase (SDHA) como um componente chave do fenótipo M1, que é expresso para eliminar o parasita5. A biologia sintética tem aplicações em diagnósticos, desenvolvimento de vacinas e terapêutica na leishmaniose. O metabolismo direcionado à modulação da resposta imune pode ser alcançado por meio de ferramentas de biologia sintética. Para a modulação da inositol fosforil ceramida sintase, que regula o metabolismo esfingolipídico e altera a sinalização imune do hospedeiro, um circuito genético que possuía comportamento biestável foi usado para ajustar sinteticamente a robustez intrínseca do modelo de infecção por L. major 6,7. Assim, os sistemas e a biologia sintética podem fornecer uma plataforma de engenharia genética baseada em modelo para o desenvolvimento da medicina de precisão no sistema modelo de Leishmania.
O fenótipo M1 é marcado pela expressão de redes de sinalização imunometabólica onde a produção de citocinas inflamatórias e vias metabólicas aumenta sinergicamente a eliminação do parasita. A polarização M1 significa a produção de citocinas pró-inflamatórias, como Interleucina-12 (IL-12), interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). As vias metabólicas altamente enriquecidas no fenótipo M1 incluem glicólise, via da pentose fosfato e ciclo truncado do ácido tricarboxílico (ciclo TCA)5. O ciclo truncado do TCA direciona o maquinário de eliminação de parasitas por meio do aumento dos níveis de succinato e citrato, que orientam a produção de NO3. O acúmulo de succinato pelo SDHA leva à ativação do fator de transcrição induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-1α), que induz a produção de IL-1β8. No fenótipo M2, observa-se oxidação de ácidos graxos, aumento da utilização de glutamina e aumento da fosforilação oxidativa da glicose, juntamente com a produção de citocinas anti-inflamatórias, como Interleucina-10 (IL-10), Fator de crescimento transformador beta (TGF-β), Interleucina-4 (IL-4) e Interleucina-13 (IL-13)3. M2 exibe mitocôndrias alongadas como uma característica distintiva, levando a uma maior eficiência na geração de energia. Eles utilizam ácidos graxos, glicose e glutamina como substratos para alimentar o ciclo do TCA, gerando ATP por meio da fosforilação oxidativa a uma taxa mais alta para promover o crescimento e a proliferação do parasita9. A enzima SDHA responsável pelo acúmulo de succinato por meio de TCA truncado pode não apenas promover a produção de NO, mas também iniciar um consumo de oxigênio dependente de succinato por meio do transporte de elétrons10. Em macrófagos infectados por Leishmania, o SDHA é regulado negativamente em 2,17 vezes, indicando que a respiração aeróbica também pode ser regulada negativamente11. Para aumentar o consumo de succinato para induzir a produção de NO mediada por citocinas pró-inflamatórias e promover a eliminação do parasita, a expressão de SDHA é essencial.
O circuito sintético oferece terapias direcionadas com precisão que podem alterar o sistema doente para alcançar uma oscilação biestável que pode restaurar o fenótipo saudável no nível espaço-temporal. A entrega e expressão do circuito sintético tornam o sistema dinâmico e robusto. Um fator fundamental que contribui para o avanço da biologia sintética reside na capacidade de montar partes e elementos genéticos de forma modular para permitir a geração de arquiteturas intrincadas e funcionalidades personalizadas12. As restrições associadas às técnicas tradicionais de expressão estimularam o surgimento de circuitos sintéticos de plasmídeo induzíveis baseados em operon de tetraciclina, permitindo assim uma avaliação rápida do plasmídeo e fácil entrega em vários tipos de células13. A proteína repressora responsiva à tetraciclina (TetR), quando existente como dímero, exibe forte afinidade de ligação ao operon tet (TetO), suprimindo efetivamente a transcrição. No entanto, após a interação de seu ligante, a doxiciclina (dox), o TetR sofre uma alteração estrutural, resultando em sua dissociação do TetO, consequentemente permitindo que a transcrição prossiga sem impedimentos. Este circuito pode exibir controle de tradução de proteínas14. Portanto, por meio da metodologia definida, o circuito sintético de plasmídeo induzível baseado em operon de tetraciclina projetado foi habilitado a expressar SDHA no vetor pEGFP-N1. A avaliação da eficiência de transformação do circuito e seu rendimento forneceu informações sobre a competência de entrega. Através da digestão restrita do vetor, a determinação da eficiência de clonagem foi confirmada. Além disso, uma linha celular de macrófagos de camundongo RAW264.7 transfectada derivada de macrófagos peritoneais de camundongos Balb / c foi observada para a expressão da proteína fluorescente verde dependente da dose de doxiciclina (GFP) em células transfectadas. Além disso, o efeito de eliminação do parasita em células transfectadas foi corroborado com uma expressão do circuito sintético. Além disso, foram observadas indução e expressão de citocinas pró-inflamatórias, que foi direcionada por um aumento no momento da infecção no circuito sintético transfectado e induzido pelas células, o que foi diretamente associado ao funcionamento do circuito sintético.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; Pontas L</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X tampão de restrição</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Digestão de restrição</td></tr><tr><td>1mL pontas</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L dicas</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 frasco</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>coloração nuclear</td></tr><tr><td>50mL tubo</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm placas</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Ciano/Laranja Buffer</td> <td>de carregamentoThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Carregando amostras para</td></tr><tr><td>placa inferior de lamínula de 96 poços</td><td>AGE ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Para imagens confocais e transfecção</td></tr><tr><td>de 96 poços de fundo plano de placa de microteste de 96 poços</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Para montagem de</td></tr><tr><td>eletroforese em gel de agarose</td> AGE <td>GeNei</td><td>93</td><td>Para AGE</td></tr><tr><td>Fluxo laminar bacteriano</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Para transformação</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Tampão /Preparação de reagentes</td></tr><tr><td>Fluxo de ar laminar de cultura de células</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Espalhador de células Fischer</td><td> Centrífuga</td><td>12822775</td><td></td>científica</tr><tr><td>para tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para falcão de 50 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>Para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Para cubeta</td></tr> <tr><td></td><td>de cultura de célulasEppendorf</td><td>6138000018</td><td>Estimativa da concentração de plasmídeos</td></tr><tr><td>Gerador de imagens em gel CYTIVA IQ 500</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Para AGE</td></tr><tr><td>DEPC TREATED H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Para indução de células transfectadas</td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento seco</td><td>Labnet</td><td></td><td>Para transformação e inativação de enzimas de restrição</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Centro nacional de ciência</td><td></td> celular <td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Tampão / Preparação de reagentes</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Para AGE</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Tampão / Microscópio</td></tr> de <tr><td>campo claro Evos</td> para preparação de reagentes <td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>para construção de circuito sintético</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>FV31S-SW software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Aquisição de imagem</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Método de montagem de Gibson para clonagem</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Construção de circuito sintético</td></tr><tr><td>Prisma Graphpad</td><td></td><td></td><td>Análise estatística</td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFischer 4368814</td><td></td><td>científico para síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Preparação de tampão / reagente</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Para transformação e seleção de colônias</td></tr><tr><td>Caldo Luria Bertini</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Para cultivo E.coli</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Preparação de tampão / reagente</td></tr><tr><td>Micro Filt Fluxo de ar laminar vertical</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tira MicroAmp Fast de 8 tubos, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips ThermoFischer</td><td>Scientific</td><td>4323032</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>sondas Taqman</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>sondas Taqman</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman sondas</td></tr><tr><td>Mouse ELISA Kit IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>para ELISA</td></tr><tr><td>Mouse ELISA Kit IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>para ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky com tela sensível ao toque + &mu; Placa de queda</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>para misturadores de microplacas ELISA</td></tr><tr><td>MX-M Misturador de placas de cultura de células de 96 poços Agitador de laboratório ajustável de 0-1500 rpm</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>para construção de circuito sintético</td></tr><tr><td>Câmara de Neubauer</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>Frasco não ventilado de 25cm2 </td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Para cultura de parasitas</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Preparação de reagentes</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Processamento de imagens</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Para imagem confocal</td></tr><tr><td>Mídia OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Vetor pEGFP-N1 clonado com circuito sintético</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>ThermoFischer 15070063 Científica</td><td></td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Polietileninina</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Fischer Preparação de</td><td>tampão / reagente</td><td>da Scientific YBP364500</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Preparação de buffer / reagente</td></tr><tr><td>Monobásico de fosfato de potássio</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Preparação de buffer / reagente</td></tr><tr><td>Pacote de fonte de alimentação</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Registro de peças biológicas padrão</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>para construção de circuito sintético</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>Para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>Preparação de tampão/reagente</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Centro nacional de ciência</td><td></td> celular <td>Para cultura de parasitas</td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Para cultura E.coli</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Preparação de tampão/reagente</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Preparação de tampão/reagente</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Tampão/Reagente de</td></tr> preparação <tr><td>de fosfato de sódio Dibásico</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Tampão/reagente preparação</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Estimativa da concentração de plasmídeo</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Sistema de PCR em tempo real</td><td>Tecnologias de vida</td><td>272006777</td><td>Para qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne software versão 2.3</td><td>Tecnologias</td><td></td> de vida <td>Para qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), não AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker cell</td><td></td><td></td><td>Construção e simulação de circuitos sintéticos</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus Escada de DNA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>For AGE</td></tr><tr><td>Cloridrato de tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Preparação de tampão/reagente</td></tr><tr><td>Tris-acetato-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Gel</td></tr><tr>azul <td>Sigma</td><td>T8154</td> de<td>Trypan da</td> preparação do tampão /Reagent <td>para a contagem de pilha</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Enzima da limitação</td></tr></tbody></table>

circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

O imunometabolismo é um determinante fundamental na progressão da leishmaniose. A abordagem baseada na biologia sintética atraiu atenção significativa como um passo em direção à intervenção terapêutica direcionada aos fatores associados ao hospedeiro que impulsionam a leishmaniose. A biologia sintética envolve a engenharia de componentes genéticos de maneira ortogonal e modular para modular com precisão No estudo apresentado, a elucidação de um pipeline sistemático para o desenvolvimento de um circuito sintético controlado por tetraciclina induzível (TetON) teve como objetivo fornecer succinato desidrogenase como agente terapêutico para facilitar a eliminação de parasitas intracelulares de Leishmania . O protocolo descrito descreve o projeto de um circuito sintético e sua posterior validação. A estratégia proposta também se concentra na incorporação de circuitos sintéticos no esqueleto do plasmídeo como veículo de entrega. Além disso, máquinas de entrega empregando nanopartículas baseadas em poliplexos para a entrega de circuitos sintéticos foram usadas em linhagens celulares de macrófagos murinos sem comprometer a morfologia celular. A padronização do método foi conduzida para selecionar células transfectadas e determinar a concentração de indução ótima para a expressão do circuito sintético. As observações revelam uma redução distinta na carga parasitária intracelular em células transfectadas em comparação com células infectadas. Citocinas pró-inflamatórias foram expressas pós-infecção em células transfectadas e induzidas em circuito sintético como um mecanismo para promover a eliminação do parasita. Isso ressalta o método baseado em biologia sintética como uma abordagem potente na leishmaniose, visando os fatores do hospedeiro associados à progressão da doença.

O arranjo das partes genéticas que formam o circuito sintético para expressar o circuito sintético é mostrado na (Figura 1A). As partes correspondentes foram clonadas no vetor pEGFP-N1 de forma ortogonal e modular, que é representada na Figura 1B. A simulação do circuito sintético revelou dinâmica oscilatória tanto no SDHA quanto no repressor de tetraciclina. Esta observação sugere um padrão de expressão recíproca caracterizado por funções de onda periódicas. O aumento na concentração de SDHA pode ser atribuído à indução de doxiciclina, enquanto a expressão de TetR pode resultar do declínio dos níveis de doxiciclina (Figura 1C). Dada a expressão oscilatória induzível de SDHA e TetR observada in silico, uma estratégia de entrega de circuito sintético através do vetor plasmídeo pEGFP-N1 foi projetada e implementada.
As partes iGEM identificadas para o estudo incluem BBa_K1493803 para TetO, BBa_K4344028 para a sequência Kozak, BBa_C0040 para TetR e BBa_K1537016 para P2A, respectivamente. O ID de acesso do NCBI para SDHA é NM_025848. Esses componentes foram montados para construir um circuito sintético TetON induzível por doxiciclina, abrangendo um total de 1317 pares de bases (Arquivo Suplementar 1). Como o TetO funciona como um elemento regulador do DNA, sua sequência não foi traduzida. A sequência a jusante da sequência de Kozak, estendendo-se de 5' TetR até a extremidade 3' de P2A, posicionada a jusante de SDHA, foi escolhida para validação in silico da tradução. A observação revelou a ausência de códons de parada internos, garantindo tradução ininterrupta em todo o comprimento da sequência (Arquivo Suplementar 2). As partes regulatórias de um circuito sintético compreendendo 1317 pb foram inseridas entre os locais de restrição NotI e XhoI, que estão 5 'a montante do EGFP (Figura 1B). Os resultados do sequenciamento destacam que a sequência de inserção foi clonada no plasmídeo (Arquivo Suplementar 3).
A introdução de um circuito imunometabólico na cepa de E. coli DH5α levou ao crescimento de colônias transformadas exibindo resistência à canamicina, o antibiótico empregado como marcador seletivo durante a transformação bacteriana. A presença abundante de colônias transformadas na placa de seleção foi maior, o que sugere que as células competentes apresentaram alto potencial de transformação, indicativo da eficiência do protocolo de transformação utilizado (Figura 1D).
Uma única colônia foi isolada e semeada em 10 mL de LB suplementado com canamicina para isolamento do plasmídeo. O rendimento do plasmídeo derivado de uma cultura de 10 mL é detalhado na Tabela 1. Um método padrão para isolamento de plasmídeo foi empregado para este procedimento. As soluções tampão foram preparadas recentemente no dia anterior ao isolamento do plasmídeo e as condições de incubação foram otimizadas para maximizar o rendimento do plasmídeo. A concentração plasmídica obtida excedeu 1 μg/μL, com razões 260/280 e 260/230 superando 1,8 e 2,0, respectivamente. Esses achados indicam que os plasmídeos isolados eram de alta pureza e desprovidos de contaminantes como proteínas, EDTA, carboidratos e fenol.
O deslocamento da mobilidade eletroforética para o circuito sintético isolado foi avaliado. A digestão de restrição foi realizada usando enzimas de restrição NotI e XhoI, pois esses eram os locais de restrição onde o circuito sintético foi inserido. Duas bandas foram observadas no gel de agarose a 1%, uma banda próxima a 1500 pb e outra entre 4 kb e 5 kb. Dado que o tamanho do inserto é de 1317 pb, a banda a 1500 pb provavelmente corresponde ao inserto. O vetor pEGFP-N1 tem um tamanho de 4,7 kb. Portanto, presume-se que a banda próxima a 5 kb seja o vetor pEGFP-N1. Consequentemente, foi feita uma inferência de que um circuito sintético completo e intacto estava presente dentro do vetor de entrega. Além disso, uma banda de aproximadamente 6 kb foi detectada para o circuito sintético intacto não digerido, indicando que o vetor pEGFP-N1 abriga uma inserção de quase 1,3 kb dentro do vetor plasmidial (Figura 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Figura 1: Projeto e validação de circuito sintético. (A) Representação de circuitos sintéticos pela montagem de partes genéticas e componentes regulatórios. (B) Gráfico de simulação determinística mostrando a expressão periódica de SDHA e TetR em unidades de tempo de 100. (C) Colônias transformadas em circuito sintético de E. coli DH5α resistentes à canamicina. A unidade é uma unidade de 100 vezes, pois é uma simulação determinística. (D) Eletroforese em gel de agarose de circuito sintético intacto e digerido de restrição usando enzimas de restrição NotI e XhoI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentração de plasmídeo (μg/ml)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Rendimento da construção do circuito sintético obtido após o isolamento do plasmídeo. A tabela mostra a concentração de plasmídeo em μg/mL, sua proporção de 260/280 e 260/230.
Nas células controle e infectadas, a intensidade de fluorescência observada foi baixa para GFP. No entanto, observou-se que a transfecção do circuito sintético com uma proporção de 1:1 de plasmídeo e PEI com 500 μg/mL G418 e a indução com 1 μg/μL de dox induziram alta expressão de GFP em células IMT. Em células IMTI de 6 h, a expressão de GFP também foi significativamente maior, embora a expressão de GFP tenha sido menor do que na amostra IMT ( Figura 2A, B ). Além disso, um aumento na expressão de GFP foi observado em amostras de IMTI de 12 h, IMTI de 18 h e IMTI de 24 h. Esse aumento pode ser devido a um aumento no tempo de infecção, o que pode ter induzido maiores alternâncias metabólicas em macrófagos pelo parasita residencial17. Os níveis intracelulares de SDHA podem ser afetados devido ao aumento do tempo de infecção18. Como o dox foi suplementado a essas amostras de IMTI, os níveis de SDHA por meio de circuitos sintéticos podem ter aumentado, levando a um aumento na expressão de SDHA.
A coloração DAPI foi feita para identificar o número de parasitas residenciais nos macrófagos. Em 6 h de macrófagos infectados por L. major , o número observado de parasitas intracelulares foi de 6 células por macrófago, o que é maior em comparação com a amostra de 6 h IMTI, que tinha 1-2 parasitas intracelulares por macrófago. Após a transfecção e indução dox, foi observada uma redução significativa na carga parasitária intracelular em diferentes momentos de infecção (Figura 2C). As observações sugeriram que os circuitos sintéticos podem ter induzido efeitos de eliminação do parasita, estimulando a expressão de SDHA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Figura 2: Microscopia confocal de varredura a laser. Imagens de amostras de controle, infectados, IMT e IMTI. (A) Análise da expressão de GFP em todas as amostras experimentais com uma barra de escala de 50 μm para controle, 6 h infectado e IMT, 20 μm para 6 h IMTI, 10 μm para 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI respectivamente. Os canais usados foram DIC, DAPI, GFP e imagens mescladas de todos os canais. (B) ANOVA de uma via com teste de correção de Tukey de todas as amostras experimentais (n = 3) para expressão de GFP (p &lt; 0,05 é considerado significativo) As barras de erro representam o desvio padrão. (C) ANOVA de uma via com análise do teste de correção de Tukey da carga parasitária em 100 células de macrófagos para amostras de (A) (n = 3) foi realizada (p &lt; 0,05 é considerado significativo). As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A detecção dos níveis de IL-10 e IL-12 no meio de todas as amostras revelou que as concentrações de IL-10 e IL-12 foram maiores em 6 h pós-infecção, com regulação negativa nos níveis de citocinas após 24 h de infecção. Não houve diferença significativa nos níveis de IL-10 e IL-12 após a transfecção e indução de circuitos sintéticos. Além disso, houve uma diferença não significativa nos níveis de IL-10 e IL-12 nas amostras de IMTI (Figura 3). A amostra infectada de 6 h já foi relatada como apresentando expressão de IL-10 e IL-1219,20, observando uma diferença não significativa em IL-10 e IL-12 nos fez investigar o efeito do circuito sintético em outras citocinas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Figura 3: ELISA de IL-10 e IL-12 para identificar seus níveis secretores em meios de diferentes amostras. As amostras (n=2) incluem controle, 6 h infectados, 24 h infectados, IMT, 6 h IMTI, 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI. Foi realizada ANOVA de duas vias com análise do teste de correção de Tukey (p &lt;,05 é considerado significativo). As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A detecção dos níveis de transcritos de TNF-α, IFN-γ e TGF-β em amostras de 6 h infectadas, IMT e 24 h IMTI revelou que um aumento significativo no TNF-α para 2,5 vezes foi observado em amostras de IMTI de 24 h em comparação com amostras de infecção e IMT (Figura 4). Na amostra de IMTI de 24 h, foi observado um aumento de 35 vezes nos níveis de IFN-γ em comparação com as amostras de infecção e IMT. Os níveis de TGF-β, embora tenham mostrado uma regulação positiva significativa para 1,5 vezes na amostra IMTI de 24 h, a mudança relativa da dobra foi menor em comparação com TNF-α e IFN-γ, sugerindo que as citocinas pró-inflamatórias são significativamente reguladas positivamente na amostra IMTI de 24 h.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Figura 4: Análise de citocinas qRT-PCR. (A) TNF-α, (B) IFN-γ e (C) TGF-β para amostras infectadas por 6 h, IMT e IMTI de 24 h (n = 2). Foi realizada ANOVA one-way com teste de correção de Tukey (p &lt; 0,05 é considerado significativo). As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Sequência de nucleotídeos de partes genéticas montadas para formar o circuito sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Sequência traduzida do circuito sintético expressando TetR, P2A e SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Resultado do sequenciamento do circuito sintético clonado no plasmídeo pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, é apresentado um protocolo para projetar, construir e fornecer circuito sintético induzível baseado em tetraciclina controlado. O efeito dos circuitos sintéticos na eliminação do parasita e na expressão de citocinas pode ser estudado canalizando o pipeline apresentado. Este protocolo é relevante para pesquisadores que estudam a terapêutica baseada em circuitos sintéticos em doenças infecciosas.

Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

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Bioengineering

Bioengenharia

Os monócitos são componentes integrais do sistema imunológico inato humano que dependem do metabolismo glicolítico quando ativados. Descrevemos um protocolo de citometria de fluxo para medir a expressão do transportador de glicose e a captação de glicose por monócitos totais e subpopulações de monócitos em sangue total fresco.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Este artigo descreve um método versátil para criar anéis de células derivadas do tecido celular por auto-montagem. Células musculares lisas semeadas em forma de anel-agarose agregado poços e contrato de forma robusta em três dimensões (3D) tecidos dentro de 7 dias. Anéis milímetro escala de tecido são conducentes a testes mecânicos e servem como blocos de construção para a montagem dos tecidos.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Este protocolo demonstra métodos utilizados para estabelecer ambientes 2D e 3D em câmaras de design personalizado electrotactic, que pode acompanhar...

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

Explore circuitos imunometabólicos na infecção por Leishmania major usando circuitos sintéticos controlados por tetraciclina. Este método demonstra eliminação de parasitas e modulação de citocinas para terapias direcionadas.

Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

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