Name: Implantação de dispositivos optoeletrônicos na medula espinhal de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprenda a implantar sondas neurais optoeletrônicas na medula espinhal de roedores usando técnicas de laminectomia lateral ou medial. Este protocolo acessível permite pesquisadores explorarem circuitos medulares sem experiência prévia em cirurgia.

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SS é parcialmente financiado por uma bolsa de doutorado de quatro anos da Universidade da Colúmbia Britânica. AM é parcialmente apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Canadá - mestrado do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR). DS reconhece o financiamento do Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo New Frontiers in Research Fund - Transformation do Governo do Canadá (NFRFT-2020-00238). O esquema da Figura 1 foi gerado usando Biorender.com e o modelo 3D foi obtido com permissão de sketchfab.com.

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e supervisionados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Colúmbia Britânica. Ratos fêmeas da raça Long-Evans, pesando 350-450 g e com idade entre 6 e 8 meses, foram alojadas em grupo (21 °C; ciclo de luz de 12 h:12 h) e receberam acesso ad libitum a uma dieta padrão para roedores antes e após a cirurgia. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparo pré-operatório
<ol><li>Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave.</li>
	<li>Anestesiar o animal com isoflurano (5% para indução e 2% para manutenção) administrado em oxigênio a uma vazão de 1 L/min.</li>
	<li>Transfira o animal da câmara de indução para uma almofada de aquecimento e conecte imediatamente o cone nasal de isoflurano. Verifique se o animal está sob um plano cirúrgico de anestesia, garantindo uma perda completa do reflexo de pinça do dedo do pé em ambas as pernas.</li>
	<li>Raspe a parte de trás do rato começando pela base das orelhas, conforme mostrado na Figura 2A.</li>
	<li>Aplique uma quantidade generosa de pomada estéril sobre os olhos e injete buprenorfina (diluída a 0,03 mg/kg) e 10 mL de ringues com lactato por via subcutânea (aquecida à temperatura corporal).</li>
	<li>Limpe a área depilada com esfoliante cirúrgico anti-séptico (clorexidina) seguido de álcool isopropílico em movimentos circulares, começando do centro da área depilada e alargando o diâmetro do círculo. Repita o processo de sabão / álcool mais duas vezes.</li>
	<li>Prenda o animal em uma estrutura estereotáxica, posicionando a cabeça usando barras auriculares lubrificadas para estabilidade (Figura 2A). NOTA: Durante todo o procedimento, forneça suporte térmico de forma consistente, verifique a profundidade da anestesia por meio do reflexo de pinça do dedo do pé e monitore os sinais vitais.</li>
	<li>Coloque uma cortina cirúrgica estéril em cima do animal.</li>
</ol>2. Exposição da medula espinhal cervical
<ol><li>Usando uma pinça estéril, comece palpando a base do crânio. Sinta um processo espinhoso proeminente que se estende rostrocaudalmente perto da base do crânio; este é C214 (Figuras 1B e Figura 2B).</li>
	<li>Prossiga com a palpação caudal a C2 para encontrar um processo espinhoso notavelmente agudo e pontiagudo, identificável como T215 (Figuras 1B e Figura 2C).</li>
	<li>Com o bisturi, fazer uma incisão na pele, partindo de C2 e estendendo-se caudalmente por cerca de 1,5 cm (Figura 2D). NOTA: O tamanho da incisão pode variar entre animais de diferentes tamanhos. Garanta a identificação dos pontos de referência anatômicos com antecedência e proceda de acordo.</li>
	<li>Corte cuidadosamente a camada adiposa subcutânea com o bisturi para expor a musculatura dorsal subjacente intacta.</li>
	<li>Uma vez que os músculos dorsais estejam expostos, faça a dissecção romba, separando-os da linha média usando duas pinças Adson (Figura 2E). NOTA: É importante realizar uma dissecção romba (separando as fibras musculares) em vez de cortar os músculos para minimizar o sangramento. A exposição adequada da musculatura dorsal deve revelar um músculo em forma de bola (Figura 2G). Este músculo cobre completamente C2 e cobre parcialmente C3.</li>
	<li>Usando rongeurs e pinças estéreis, levante um retalho de pele imediatamente caudal à área incisada. Use rongeurs para criar uma pequena bolsa subcutânea - este será o local do dispositivo (Figura 2F). NOTA: A bolsa subcutânea deve ser maior que o próprio dispositivo. Recomenda-se que o(s) cirurgião(s) se reposicione(m) para ficar de frente para o animal anteriormente para melhorar o controle e a visibilidade ao abrir a bolsa subcutânea.</li>
	<li>Coloque um afastador para expor a coluna vertebral (Figura 2G).</li>
	<li>Usando rongeurs, remova todos os músculos ou tecidos restantes que cobrem as vértebras e comece a identificar os segmentos da medula espinhal. Imediatamente caudal ao músculo em forma de bola está C4, seguido por C5 e C6 (Figura 2G-I). Depois de concluído, enxágue a área cirúrgica com solução salina estéril e seque com gaze estéril. NOTA: O músculo em forma de bola envolve totalmente C2 e se estende parcialmente sobre C3. O segmento da medula espinhal diretamente caudal a ele, com contato mínimo, é designado como C4.</li>
	<li>Realize laminectomias dependendo da finalidade pretendida da sonda.<ol><li>Para uma sonda sob a lâmina, realize uma laminectomia lateral em C5 e C6, criando uma abertura lateralizada na lâmina para futura colocação da sonda (Figura 2H, Figura Suplementar 1A).</li>
		<li>Para uma sonda sobre a lâmina, realize uma laminectomia medial de C5, certificando-se de não remover os aspectos laterais do processo espinhoso - apenas expondo uma via medial para a colocação da sonda (Figura 2I, Figura Suplementar 1B).</li>
		<li>Após a laminectomia, enxágue a região com solução salina estéril e seque com gaze estéril para remover quaisquer detritos ósseos. NOTA: Ao realizar a laminectomia, é fundamental empurrar os rongeurs contra o osso e evitar movimentos descendentes para evitar danos ao cordão.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Colocação peridural do dispositivo
<ol><li>Segure o dispositivo estéril com pinça estéril de ponta de plástico (Figura 3A) e coloque-o dentro da abertura subcutânea feita anteriormente na etapa 2.9. NOTA: É fundamental evitar tocar no dispositivo com luvas/ferramentas não estéreis para manter a esterilidade do dispositivo. Use uma pinça estéril designada para colocação e posicionamento do dispositivo sob a pele.</li>
	<li>Suture ou cole o dispositivo na camada muscular vizinha para mantê-lo seguro (Figura 3B). NOTA: Use suturas não absorvíveis se suturar o dispositivo aos músculos. Caso contrário, o dispositivo é propenso a movimentos após a absorção da sutura no corpo. Se estiver usando cola, garanta a estabilidade e a biocompatibilidade a longo prazo da cola/adesivo. Evite prender o dispositivo à camada subcutânea de gordura/adiposo para garantir pontos de ancoragem confiáveis.<ol><li>Planeje a posição do corpo do dispositivo antes de prosseguir com esta etapa. Como o dispositivo será fixado permanentemente, podem surgir problemas com o posicionamento da sonda (etapa 3.4) se o dispositivo estiver localizado muito perto ou muito longe do nível desejado na medula espinhal.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o retrator ao redor da medula espinhal e abra uma janela adequada para colocar a sonda na medula espinhal.</li>
	<li>Posicionamentos de sonda:<ol><li>Colocação da sonda sob a lâmina: Insira cuidadosamente a sonda usando uma pinça de ponta plástica sob as lâminas (C5 e C6), deslizando-a através dos canais lateralizados feitos na etapa 2.9.1 (Figura 3D).</li>
		<li>Colocação da sonda sobre a medula espinhal:<ol><li>Ajuste a sonda usando uma pinça de ponta de plástico para alinhar e coloque a ponta da sonda no topo da janela medial criada em C5 na etapa 2.9.2 (Figura 3C).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Em um recipiente estéril, pequeno e de preferência de cerâmica, prepare o cimento misturando uma colher de pó de cimento dental, 3 gotas de graxa de alta tecnologia e uma gota de catalisador. Misture com palitos estéreis até obter uma consistência viscosa. NOTA: É altamente recomendável que uma pessoa que não esteja realizando a cirurgia prepare o cimento para que o cirurgião possa segurar a sonda no lugar e secar a área desejada imediatamente antes de aplicar o cimento. Esta etapa é sensível ao tempo. Certifique-se de que o cirurgião posicione a sonda antes de preparar o cimento. Uma vez que o catalisador é aplicado, o cimento engrossa demais para se ligar efetivamente ao osso se houver um atraso. Pratique com o cimento antes da cirurgia para garantir a consistência adequada antes de colocá-lo na sonda/osso.</li>
	<li>Seque completamente a área de cimentação pretendida nas vértebras para obter um ponto de ancoragem confiável. Aplique 1-2 gotas de cimento dentário na ponta da sonda, que deve ser colocada em cima do nível vertebral pretendido, neste caso, C4 (Figura 3C,D). NOTA: É fundamental que as vértebras estejam o mais secas possível antes da cimentação. Caso contrário, o cimento não aderirá e a sonda não será fixada.</li>
	<li>Faça uma pausa de 30 s e toque suavemente no cimento para verificar se está curado.</li>
	<li>Se o cimento não estiver completamente curado, espere mais 20 s e reaplique o cimento recém-feito até que a sonda esteja firmemente presa ao osso. NOTA: O cimento aderiu corretamente quando se tornou duro e rígido ao toque. CUIDADO: Aplicar o cimento enquanto ele está muito líquido pode fazer com que ele penetre no tecido da medula espinhal entre as vértebras. Se isso ocorrer, aguarde aproximadamente 10 s para que o cimento engrosse até obter uma consistência mais parecida com uma goma antes de usar suavemente uma pinça para remover o cimento que entrou em contato com a medula espinhal.</li>
</ol>4. Procedimentos pós-cirúrgicos
<ol><li>Quando a cirurgia estiver concluída, suture o local da incisão usando suturas de vicryl 5-0. Remova cuidadosamente o animal do aparelho estereotáxico e transfira-o para uma câmara de recuperação aquecida. Nos primeiros 3-5 dias após a cirurgia, forneça ao animal ração macia e umedecida, guloseimas e água em hidrogel.</li>
	<li>Monitore minuciosamente o animal duas vezes ao dia durante a primeira semana após a cirurgia. Administre buprenorfina e injeções de Ringer com lactato aquecido duas vezes ao dia nos 2 dias subsequentes ou mais se os sinais de dor persistirem. Continue as verificações diárias até que o animal não apresente problemas clínicos de saúde. Depois disso, verifique o animal pelo menos uma vez por semana.</li>
	<li>(Opcional) Delineie o perímetro do dispositivo na pele após a cirurgia e o fechamento da incisão para uma indicação visual da localização do dispositivo no corpo (Figura 4A). NOTA: Esta etapa é particularmente útil quando o dispositivo requer acesso externo, como dispositivos que precisam ser alimentados sem fio por meio de um transmissor externo onde o acoplamento da antena é crítico ou bombas de administração de medicamentos que devem ser recarregadas através da pele 16,17,18.</li>
</ol>

Cirurgia da medula espinhal e implante de haste óptica em roedores

<ol><li>Osseward, P. J., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+circuit+modules+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cell type and circuit modules in the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 56, 175-184 (2019).</li>
<li>Alilain, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rescue+of+breathing+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 28 (46), 11862-11870 (2008).</li>
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<li>Agrawal, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformal+phased+surfaces+for+wireless+powering+of+bioelectronic+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Conformal phased surfaces for wireless powering of bioelectronic microdevices.</a> Nat Biomed Eng. 1 (3), 0043(2017).</li>
<li>Park, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretchable+multichannel+antennas+in+soft+wireless+optoelectronic+implants+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (50), E8169-E8177 (2016).</li>
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<li>Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rating+scale+for+open-field+evaluation+of+behavioral+recovery+after+cervical+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats.</a> J Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nat Neurosci. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

A neuromodulação e as intervenções terapêuticas da medula espinhal geralmente requerem a colocação de sondas em segmentos precisos e direcionados 3,4,7,13. Dada a mobilidade inerente da medula espinhal, a sonda deve ser protegida de forma confiável para permitir estudos crônicos. Com base na aplicação específica, pode ser importante controlar se a sonda está em contato físico com a medula espinhal ou se o contato pode ser reduzido para diminuir a resposta inflamatória do tecido quando possível. Portanto, as etapas cirúrgicas para cada um dos dois métodos são descritas. O protocolo detalha especificamente como colocar uma sonda no segmento cervical da medula espinhal em C5. No entanto, usando o ponto de referência descrito para T2 ou T10 da medula espinhal, a sonda pode ser colocada de forma semelhante em um local preciso sobre a região torácica ou lombar, contando as vértebras de T2 ou T10, respectivamente, uma vez expostas. Além disso, para minimizar os danos ao tecido da medula espinhal, prendemos o corpo do dispositivo, que geralmente é maior e mais rígido em comparação com a sonda conectada, em um espaço subcutâneo longe da medula espinhal.
Existem alguns pontos críticos para implantar o dispositivo que é acoplado à sonda. Primeiro, é fundamental decidir sobre a localização do corpo do dispositivo antes de cimentar a sonda. Isso garante que a distância entre a ponta da sonda e o corpo do dispositivo seja otimizada para reduzir a tensão na sonda, bem como evitar o comprimento extra da sonda, o que pode, por exemplo, causar torção ou deslocamento da sonda. Essencialmente, o objetivo é garantir que o comprimento da sonda seja semelhante à distância do espaço subcutâneo onde o corpo do dispositivo é colocado até a região da medula espinhal alvo onde a sonda é cimentada. Ao realizar procedimentos de cirurgia terminal nos quais vários comprimentos de sonda são testados, o tamanho ideal pode ser determinado para um segmento alvo.
Para manter a esterilidade, o dispositivo deve ser manuseado com cuidado para evitar o contato com a camada externa da pele durante a inserção na bolsa subcutânea. Esse contato pode comprometer a esterilidade do dispositivo, podendo levar à infecção pós-operatória. Além disso, é importante minimizar a quantidade de força aplicada ao dispositivo ao segurá-lo com fórceps para evitar danos ao seu revestimento, que normalmente é uma fina camada protetora, isolante e estéril20,21. A remoção do revestimento pode reduzir drasticamente a vida útil do dispositivo, por exemplo, encurtando o circuito, causando choque elétrico ao animal e/ou provocando uma resposta inflamatória no corpo. O manuseio do dispositivo com pinça de ponta de plástico pode ajudar a reduzir essas complicações.
Ao suturar o dispositivo em tecidos moles, é importante evitar a sutura em tecido adiposo subcutâneo. Conforme observado em ensaios preliminares, as camadas de gordura não são um ponto de ancoragem confiável para suturas, pois são propensas a ruptura. Em vez disso, o corpo do dispositivo foi suturado a uma camada muscular adjacente no espaço subcutâneo usando suturas não absorvíveis para a colocação permanente do dispositivo no corpo. Por outro lado, ao prender a sonda aos processos espinhosos, é importante garantir que o local ao qual a sonda está sendo fixada esteja seco antes de aplicar o cimento. O osso/sonda úmido prolonga o tempo de cura e pode resultar na falha completa do processo.
Existem algumas considerações críticas associadas a um dispositivo implantável que precisam ser cuidadosamente abordadas antes da cirurgia de implantação. (1) As partes eletricamente ativas do dispositivo devem ser encapsuladas por uma camada de passivação isolante. Qualquer privação na camada de passivação pode causar falha funcional do dispositivo. (2) O implantável deve ser completamente esterilizado de acordo com o protocolo animal da instalação. (3) A junção entre o dispositivo e as sondas neurais ou as hastes estimulatórias deve ser formada com segurança. A conexão passará por estresse mecânico repetível devido aos movimentos constantes dos animais. (4) As sondas neurais ou hastes estimuladoras conectadas ao dispositivo devem ser flexíveis e elásticas o suficiente para evitar quedas em vários pontos.
O protocolo descrito pode ser estendido para implantes em modelos animais de diferentes tamanhos. Depois de identificar os pontos de referência anatômicos, os métodos cirúrgicos descritos podem ser metodicamente personalizados para proteger quaisquer sondas neurais ou hastes estimulatórias em segmentos específicos da medula espinhal e implantar seus módulos de controle associados. No entanto, dependendo da aplicação, diferentes dispositivos podem ter tamanhos, materiais e espessuras diferentes daquele implantado neste artigo; Por exemplo, dispositivos conectados a um módulo de controle externo requerem considerações adicionais. Além disso, deve-se notar que, embora este protocolo seja adaptado para estimulação optogenética, outras aplicações neuromoduladoras, como administração de medicamentos ou estimulação/gravação elétrica, requerem procedimentos cirúrgicos ligeiramente diferentes. Especificamente, essas aplicações precisam de implante subdural para garantir o contato direto com a medula espinhal abaixo da dura-máter7. No entanto, para a optogenética, o contato íntimo com o tecido é tipicamente desnecessário, pois a dura-máter do roedor não impede significativamente a penetração da luz, o que permite que as fontes de luz sejam colocadas por via peridural10.

A medula espinhal facilita uma série de funções essenciais do sistema nervoso central, desde a coordenação de comportamentos motores até a regulação de processos homeostáticos, como a respiração 1,2. Elucidar o papel da sofisticada rede de circuitos através da medula espinhal requer interfaces, seja para estimulação elétrica, gravação, administração de medicamentos ou estimulação óptica para áreas específicas 3,4,5,6. Embora dispositivos tenham sido desenvolvidos para permitir tais interrogatórios 7,8,9,10,11, técnicas cirúrgicas especializadas são necessárias para sua implantação crônica na medula espinhal4. Em particular, a medula espinhal e as vértebras associadas têm maior suscetibilidade a deformações mecânicas causadas por movimentos naturais, como extensão e flexão 8,12,13. Essas características únicas da medula espinhal tornam intrinsecamente desafiador garantir que as sondas implantadas permaneçam estáveis, funcionais e seguras em um segmento específico por longos períodos de tempo.
Aqui, um protocolo cirúrgico é descrito para inserir e prender uma haste óptica em um segmento alvo da medula espinhal (Figura 1A). Uma vez que a interface com a região cervical, em particular, demonstrou introduzir desafios únicos9, as etapas de implantação são especificamente demonstradas sobre a região cervical C5. Postula-se que a complexidade da coluna cervical surge de seu posicionamento mais profundo e da abundância de musculatura, uma característica não tão proeminente ao longo do resto da medula espinhal. Independentemente disso, os procedimentos descritos neste protocolo são projetados para serem adaptáveis para cirurgias em várias regiões da medula espinhal. Instruções passo a passo são fornecidas para localizar e identificar segmentos da medula espinhal usando "pontos de referência" anatômicos pronunciados identificáveis sobre a pele (Figura 1B). O protocolo então elucida duas técnicas para implantação cirúrgica: uma adaptada para sondas que requerem contato direto com a medula espinhal e outra para sondas que podem não exigir contato direto. As etapas descritas são projetadas para serem reproduzidas por qualquer pesquisador com treinamento em cirurgia de sobrevivência de roedores.
Este protocolo engloba instruções passo a passo para a implantação de um dispositivo optoeletrônico (18 mm x 13 mm) com uma haste óptica flexível acoplada sobre o nível cervical C5. O dispositivo implantável é fixado subcutaneamente caudal a C5 e consiste em um indicador de diodo emissor de luz em microescala (μLED), que acende quando ocorre estimulação óptica da medula espinhal, fornecendo feedback ao vivo da funcionalidade do dispositivo. O efeito da haste óptica implantada na função motora natural foi avaliado em roedores que receberam implantes e foi comparado a roedores com cirurgias simuladas. Os resultados indicam que as sondas não afetam adversamente a função natural dos membros posteriores e anteriores do animal sete dias após a implantação.

<table><tbody><tr><td>Pinça Adson&nbsp;</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Alm 3 Pontos Retrator</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>17010-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina / Vetergésica&nbsp;</td><td>CDMV</td><td>124918</td><td>O fabricante fornece a 0,3 mg/mL, mas deve ser diluído para 0,03 mg/kg para uso em ratos</td></tr><tr><td>Solução de clorexidina a 2%</td><td>Partnar</td><td>PCH-020;</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Longa Curvada para Hemostático</td><td>KaamKaaj Tools</td><td>14.5</td><td>Pinça Longa Curvada para Hemostático com uma Pinça de Aço Inoxidável com Trava de Catraca</td></tr><tr><td>CVD Máquina de Parileno: SCS Labcoter 2</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>PDS 2010</td><td></td></tr><tr><td>Cimento Dental - Catalisador&nbsp;</td><td>Cimento Dental Parkell, Inc</td><td>S371</td><td></td></tr><tr><td>- Metabond</td><td>Parkell, Inc</td><td>Cimento Dental S398</td><td></td></tr><tr><td>- Pó&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>S396</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps com Pontas de Plástico Substituíveis</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11980-13</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Fresenius Kabi&nbsp;</td><td>CP0406V2</td><td>Fornecido a 5% para indução e 2% para manutenção através de vaporizador de precisão&nbsp;</td></tr><tr><td>Álcool Isopropílico 70%</td><td>McKesson</td><td>350600</td><td></td></tr><tr><td>Lacri-Lube Pomada Estéril para os Olhos&nbsp;</td><td>Atualizar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Evans Rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Solda de baixa temperatura Chip</td><td>Quik Inc.</td><td>11.38</td><td></td></tr><tr><td>Ímãs Ímãs</td><td>radiais, Inc.</td><td>0.53</td><td>Ímã Neodímio Ferro Boro (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm)</td></tr><tr><td>Porta-agulhas Olsen-Hegar com Cortadores de Sutura&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PDMS: SYLGARD&nbsp; Lâminas</td> de Bisturi <td>761036</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td> 184</tr><tr><td>- #15</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi - #3</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Chip de fluxo de solda</td><td>Quik Inc.</td><td>14.25</td><td></td></tr><tr><td>Quadro Estereotáxico&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Estéril Kwik-Sil World</td><td>Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL-S</td><td></td></tr><tr><td>UV Lanterna</td><td>Vansky</td><td>19.99</td><td></td></tr><tr><td>Carregador sem fio</td><td>Nilkin</td><td>NKT06</td><td></td></tr><tr><td>Bobina de carregamento sem fio</td><td>TDK Corporation</td><td>WT202012-15F2-ID</td><td></td></tr></tbody></table>

implantação de dispositivos optoeletrônicos na medula espinhal de roedores

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

A neuromodulação pode fornecer aplicações diagnósticas, modulatórias e terapêuticas. Embora um extenso trabalho tenha sido realizado no cérebro, a modulação da medula espinhal permanece relativamente inexplorada. O tecido da medula espinhal inerentemente delicado e móvel impõe restrições que tornam desafiadora a implantação precisa de sondas neurais. Apesar dos recentes avanços em dispositivos de neuromodulação, particularmente bioeletrônica flexível, as oportunidades para expandir seu uso na medula espinhal têm sido limitadas pelas complexidades cirúrgicas da implantação de dispositivos. Aqui, fornecemos uma série de protocolos cirúrgicos adaptados especificamente para a implantação de um dispositivo optoeletrônico personalizado que faz interface com a medula espinhal em roedores. As etapas para colocar e ancorar uma haste óptica em um segmento específico da medula espinhal por meio de dois métodos diferentes de implantação cirúrgica são detalhadas aqui. Esses métodos são otimizados para uma ampla gama de dispositivos e aplicações, que podem ou não exigir contato direto com a medula espinhal para estimulação óptica. Para elucidar a metodologia, a anatomia vertebral é referenciada primeiro para identificar pontos de referência proeminentes antes de fazer uma incisão na pele. As etapas cirúrgicas para fixar uma haste óptica sobre a coluna cervical em roedores são demonstradas. Os procedimentos são então descritos para prender o dispositivo optoeletrônico conectado à haste óptica em um espaço subcutâneo longe da medula espinhal, minimizando o contato direto desnecessário. Estudos comportamentais comparando animais que receberam os implantes com aqueles submetidos a cirurgias simuladas indicam que as hastes ópticas não afetaram adversamente a função dos membros posteriores ou anteriores sete dias após o implante. O presente trabalho amplia o kit de ferramentas de neuromodulação para uso em estudos futuros destinados a investigar várias intervenções na medula espinhal.

Um dispositivo optoeletrônico com seu diagrama funcional detalhado mostrado na Figura Suplementar 2 foi implantado em quatro ratos Long Evans. A Figura 3 suplementar mostra o dispositivo optoeletrônico final pronto para implantar. Três outros animais foram submetidos a cirurgias simuladas, que envolveram uma laminectomia medial em C5 sem implante do dispositivo. O dispositivo optoeletrônico consistia em uma sonda flexível com um μLED embutido na ponta que era ativado por um driver de LED integrado. O driver de LED é controlado por um microcontrolador com firmware programável. Também consistia em um corpo de dispositivo que era suturado à camada muscular imediatamente abaixo da pele. Uma camada de Parylene-C (~ 10 μm) é depositada em todo o dispositivo usando deposição química de vapor (CVD). Uma segunda camada de polidimetilsiloxano (PDMS) (~ 800 μm) cobriu o corpo do dispositivo optoeletrônico (Figura Suplementar 3) para formar uma interface suave com o tecido. A ponta da sonda foi fixada em C4 com o μLED pairando sobre C5. Um indicador μLED foi utilizado no dispositivo (com sua luz visível sob a pele) que ligou simultaneamente com o μLED da haste óptica para verificação ao vivo da funcionalidade do dispositivo. Os animais foram monitorados por um período de 7 dias após a cirurgia para confirmar a confiabilidade sustentada de seu desempenho ao longo do tempo (Figura 4B).
As funções motoras dos animais foram avaliadas por meio da escala de classificação locomotora de campo aberto de Martinez19. Para avaliar o comportamento em campo aberto, dois observadores treinados que desconheciam os grupos de tratamento realizaram os testes antes das operações, bem como nos dias três, cinco e sete após a cirurgia. Após a coleta de dados, o teste U de Mann-Whitney foi realizado para determinar diferenças em cada momento para os escores do membro anterior e posterior entre os grupos implante e simulado. Nossa análise indica um escore de função do membro anterior semelhante nos grupos implante e simulado no sétimo dia (Figura 5A). Da mesma forma, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos para os escores dos membros posteriores em todos os momentos (Figura 5B).
A verificação post-mortem foi realizada 7 dias após o implante para confirmar se a sonda e o corpo do dispositivo permaneceram no lugar. Nenhum descolamento visível da sutura ou do dispositivo foi encontrado. Além disso, puxar o corpo do dispositivo não causou seu descolamento do tecido (Figura Suplementar 4A). Os músculos previamente dissecados e suturados foram então expostos sobre a medula espinhal, e foi confirmado que as sondas permaneceram firmemente cimentadas sobre a medula espinhal (Figura Suplementar 4B). Semelhante ao corpo do dispositivo, a cabeça da sonda foi puxada sucessivamente contra o ponto de cimentação para avaliar sua fixação à junta mecânica sonda-lâmina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática da implantação do dispositivo e marcos anatômicos. (A) Demonstrando a colocação da sonda sobre a medula espinhal e a colocação subcutânea do dispositivo. (B) Modelo 3D indicando os pontos de referência usados para determinar os níveis da medula espinhal. Os processos espinhosos C2, T2 e T10 são mostrados para referência. Cores mais escuras indicam o nível correspondente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig02.jpg"> Figura 2: Exposição da medula espinhal e preparação de bolsa subcutânea. (A) O estereotáxico é posicionado no animal. (B) processo espinhoso C2 e (C) processo espinhoso T2 são identificados por palpação . (D) Uma incisão através da pele e da camada adiposa subcutânea é feita para expor a musculatura dorsal no ponto de interesse no nível cervical. (E) Através da dissecção romba da musculatura dorsal, as vértebras cervicais são expostas. (F) Uma bolsa subcutânea é criada para prender o dispositivo implantável caudal ao local da incisão. (G) Um afastador é colocado após dissecção adequada para expor as vértebras cervicais e o músculo em forma de bola, cobrindo completamente C2 e mascarando parcialmente C3. A linha tracejada indica o músculo em forma de bola. Uma vez que a medula espinhal cervical tenha sido exposta, (H) duas laminectomias laterais em C5 e C6 são feitas para colocação de sonda sob as vértebras, ou (I) laminectomia medial é feita em C5 para colocação de sonda sobre as vértebras. Os asteriscos indicam o local da laminectomia lateral. Barras de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig03.jpg"> Figura 3: Implantação do dispositivo e colocação da sonda. (A) O dispositivo é colocado na bolsa subcutânea. (B) O dispositivo é suturado à musculatura. (C) A sonda é presa no topo da lâmina C5, que recebeu laminectomia medial. (D) O dispositivo é colocado sob a lâmina C5 e C6, ambas submetidas à laminectomia lateral. Em ambos (C) e (D), a ponta da sonda é cimentada em um C4 intacto. Barras de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig04.jpg"> Figura 4: Marcação do dispositivo e verificação da funcionalidade pós-cirurgia. (A) A localização do dispositivo pode ser opcionalmente marcada sobre a pele após a sutura para facilitar sua identificação pós-cirurgia. (B) A figura representa um animal pós-implantação. A funcionalidade do dispositivo foi validada pela observação do indicador μLED visível sob a pele, confirmando o sucesso da operação do dispositivo (a protuberância no lado direito do animal é onde o corpo do dispositivo é implantado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig05.jpg"> Figura 5: Pontuações comportamentais de campo aberto de Martinez em grupos simulados e implantes para desempenho de membros anteriores e posteriores ao longo do tempo. Os gráficos ilustram os escores comportamentais médios para (A) avaliações de campo aberto do membro anterior e (B) do membro posterior em quatro pontos de tempo: 0 (linha de base), 3 dias, 5 dias e 7 dias após o implante (DPI). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Diferenças significativas (p &lt; 0,05) entre os grupos simulado e implante são indicadas com asteriscos (*) em pontos de tempo específicos. A legenda da figura indica os grupos simulados exibidos pela linha pontilhada, enquanto o grupo de implantes é mostrado pela linha sólida. O tamanho da amostra simulada foi n = 3 e o implante foi n = 4. O teste não paramétrico U de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância das diferenças entre os grupos em cada momento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Ilustração da laminectomia. As linhas tracejadas indicam as regiões a serem ressecadas para (A) duas laminectomias laterais para colocação de sonda sob as vértebras e (B) laminectomia medial para colocação de sonda sobre as vértebras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Esquema do dispositivo optoeletrônico. O diagrama de blocos detalhado do dispositivo é mostrado. O bloco superior esquerdo mostra um tanque LC ressonante de antena de receptor de energia sem fio. A energia recebida é retificada e alimentada em um regulador de tensão de baixa queda (LDO). Uma unidade de microcontrolador ativa automaticamente o dispositivo com base nos parâmetros programados e um driver de LED alimenta todos os μLEDs embutidos na sonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 3 suplementar: Dispositivo optoeletrônico. O dispositivo optoeletrônico final com encapsulamento biocompatível conectado a uma haste óptica composta por 1 μLED na ponta. O retângulo tracejado mostra a localização do μLED. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 4 suplementar: Verificação post-mortem da estabilidade do dispositivo. Sete dias após o implante, (A) o corpo do dispositivo permaneceu suturado à musculatura na mesma posição em que foi implantado e (B) a sonda cimentada permaneceu presa no topo da lâmina C4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo detalha um procedimento cirúrgico para realizar cirurgia da medula espinhal e para implantar e prender uma haste óptica sobre a medula espinhal em roedores.

Implantação de dispositivos optoeletrônicos na medula espinhal de roedores

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

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