Imagem molecular de organoides cerebrais humanos usando espectrometria de massa

Estudamos a metabolômica do cérebro humano em desenvolvimento. Um desafio para investigar in vivo. Para resolver isso, usamos modelos de organoides cerebrais in vitro e técnicas avançadas de metabolômica especial.

Tecnologias avançadas baseadas em tecnologia mestre têm sido rapidamente aplicadas nos últimos anos para caracterização de organoides, uma tendência que deve continuar. Estudos metabolômicos recentes usando imagens por espectrometria de massa ou MSI demonstram as vantagens dos modelos organoides na compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento humano e doenças, incluindo condições raras e aplicações em medicina personalizada. Manter a integridade molecular e a morfologia dos organoides durante a imagem molecular é um desafio, exigindo manuseio e preparação precisos da amostra. Para resolver isso, foi desenvolvida uma técnica especializada para análise multi MALDI MSI de alta resolução de organoides cerebrais. Ele otimiza o espectro de massa entre as condições de imagem, matrícula e preservação de tecidos para garantir dados confiáveis de alta qualidade. Este protocolo abrangente demonstra o potencial MSI de alta resolução e fornece aos pesquisadores os recursos necessários para utilizar totalmente essa tecnologia para investigar a topografia metabolômica de organoides em detalhes.

Nossa pesquisa anunciará nossa compreensão da neurogênese, metabólito associado a tipos específicos de células em organoides cerebrais. Esse perfil metabólico detalhado não apenas iluminará a regra desses metabólitos no desenvolvimento do cérebro, mas também identificará o alvo potencial para intervenções terapêuticas que imitam distúrbios do neurodesenvolvimento.

[Narrador] Para começar, remova o frasco contendo os organoides cerebrais derivados das células-tronco pluripotentes induzidas da incubadora. Usando pontas de furo largo, transfira os organoides do frasco para o prato. Lave os organoides três vezes com DPBS sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio para enxaguar a mídia. Em seguida, enxágue rapidamente com água destilada para remover quaisquer sais do DPBS. Adicione 10 miligramas de gelatina obtida da pele fria do peixe em um frasco contendo 100 mililitros de DPBS. Aqueça e mexa a mistura a 70 a 80 graus Celsius por duas horas. Em seguida, mova a solução para uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos para remover as bolhas. Usando uma pequena ponta de pipeta, prenda o organoide no centro de um molde de plástico. Despeje delicadamente a solução de incorporação de gelatina a 10% no molde até que o organoide esteja totalmente imerso. Coloque o molde em uma placa de Petri contendo 100% de etanol frio em gelo seco. Quando completamente congelado, evidenciado pela mudança de cor para branco sólido, remova o bloco de gelatina organoide da placa de Petri. Embrulhe o bloco em papel alumínio ou coloque-o em um copo de lata. Sele e armazene o bloco a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para a seção criogênica. Para seccionamento criogênico, coloque os blocos de plástico contendo organoides dentro da câmara criogênica ajustada a menos 20 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, no criotomo, divida os organoides em seções de 14 micrômetros e monte em lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e estanho para imagem por espectrometria de massa ou MSI. Armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius até obter imagens. Para começar, remova a lâmina revestida de óxido de índio e estanho montada com seções de organoides cerebrais de menos 80 graus Celsius. Coloque a lâmina em um desidratado por 20 minutos para minimizar a condensação da água atmosférica na superfície. Após a dessecação, usando um pulverizador pneumático aquecido, pulverize 10 miligramas por mililitro NEDC em 70% de metanol nas seções organoides. Para obter uma plataforma MALDI MSI de alta resolução para visualizar metabólitos organoides cerebrais, monte a fonte de íons com uma interface de funil de íons duplos em um espectrômetro de massa. Use um laser ND triplicado de frequência de comutação Q conectado com um comprimento de onda de 349 nanômetros, uma taxa de repetição de um kilohertz e uma energia de pulso de aproximadamente 1,3 a 1,4 micro joules. Para evitar a sobreamostragem, focalize o laser em um tamanho de ponto de aproximadamente 15 micrômetros de diâmetro. Anexar a amostra ao injector MALDI stage. Opere e mantenha o funil de íons de alta pressão em 7,4 a 7,5 Torr e o funil de íons de baixa pressão em 1,6 a 1,8 Torr. Aplique tensões de radiofrequência de 780 kilohertz a 191 volts pico a pico para baixo e 604 kilohertz a 80 volts pico a pico para os funis de íons de alta pressão. Para melhorar a sensibilidade para pequenos metabólitos na faixa de baixa massa, reduza as amplitudes de RF no funil de baixa e alta pressão da fonte MALDIDMSI para aproximadamente 20 e 15%, respectivamente. Defina a resolução em massa para 70.000. Em seguida, selecione a área e o tamanho do pixel de 25 micrômetros por pixel. Defina a faixa de carga principal entre 80 e 900 nos modos de íons negativo e positivo. Mantenha o controle automático de ganho desligado, defina o tempo de injeção para 250 milissegundos e adquira espectros de massa de transformada furier no modo de perfil. Importe os dados espectrais de espectrometria de massa diretamente para o software compatível. Execute a correção da linha de base usando o algoritmo de convolução e normalize os dados usando a contagem total de íons. Gere a lista de recursos de imagens de íons a partir dos arquivos de dados brutos usando uma largura de compartimento de carga mestre delta igual a 0,01 ou 5:00 PPM para distinguir imagens de taxa de carga mestre com base no defeito de massa e na cobertura de pixels. Gere imagens de cores falsas ou RGB a partir de espécies individuais de íons metabólitos. Carregue a lista principal de taxa de carga dos arquivos de dados brutos obtidos do MALDI MSI para o Banco de Dados de Metaboloma Humano para identificar metabólitos. Metabólitos relacionados ao ciclo de Krebs em organoides cerebrais humanos de 60 dias foram mapeados espacialmente usando MSI com incorporação de gelatina de peixe.