Name: Imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a preparar nanoesferas de pontos quânticos por evaporação de emulsão e aplicá-las em imunoensaios de fluxo lateral para detecção rápida de biomarcadores de doenças em 15 minutos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Xangai (STCSM) (22S31902000) e pelo Programa de Incubação de Pesquisa Clínica do Hospital de Doenças de Pele de Xangai (NO. lcfy2021-10).

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital de Doenças de Pele de Xangai (nº 2020-15). Todos os procedimentos experimentais envolvendo amostras de sangue humano foram realizados em laboratório de Biossegurança Nível II. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de nanoesferas de QDs
NOTA: Para a síntese de nanoesferas QD, uma técnica de evaporação de emulsão-solvente foi usada para sintetizar nanoesferas QD, com uma proporção de fase oleosa para fase aquosa de 1:5. A mini emulsão é gerada por ultrassom e as nanoesferas são solidificadas por evaporação de solvente (clorofórmio). O hidróxido de sódio foi utilizado para catalisar a hidrólise de grupos anidridos na superfície do nanobead, convertendo-os em grupos carboxila.
<ol><li>Preparação de soluções em fase oleosa e em fase aquosa<ol><li>Prepare 1 mL de fase oleosa: 0,4 mL de solução de poli (estireno-anidrido co-maleico) (PSMA) (50 mg / mL), 0,1 mL de solução de QDs (100 mg / mL), preencha qualquer volume menor que 1 mL com clorofórmio.</li>
		<li>Prepare 5 mL de fase aquosa: solução aquosa SDS (0,5% em peso).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de emulsão e solidificação<ol><li>Adicione 1 mL de fase oleosa e 5 mL de fase aquosa a um frasco para injetáveis (15 mL) e coloque o frasco em um agitador magnético. Ligue a energia do agitador magnético.</li>
		<li>Depois que as fases oleosa e aquosa estiverem completamente misturadas, transfira imediatamente o frasco para a ultrassonografia programada (60 s, um pulso de 3 s seguido por uma pausa de 3 s, amplitude de 50%) e ligue a energia.</li>
		<li>Observar a solução após a ultrassonização. A solução inicialmente de cor carmesim fez a transição para uma fase opalescente que ainda mantém um tom avermelhado.</li>
		<li>Coloque o frasco de volta no agitador magnético à temperatura ambiente, mexendo continuamente durante a noite. O clorofórmio foi gradualmente evaporado e a emulsão solidificada em nanoesferas compostas.</li>
	</ol></li>
	<li>Modificação de superfície de nanoesferas<ol><li>Adicione 0,1 mL de hidróxido de sódio 0,1 mM à suspensão de nanoesferas por 1 h. Os grupos anidridos na superfície das nanoesferas são hidrolisados em grupos carboxila.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de nanoesferas<ol><li>Desligue o agitador magnético e mova as nanoesferas solidificadas para um tubo de centrífuga. Centrifugue o tubo a 13523 x g por 10 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione o volume inicial de água deionizada à precipitação, cubra o tubo com sua tampa, mergulhe-o no banho-maria ultrassônico e mantenha a imersão até que o precipitado esteja totalmente disperso.</li>
		<li>Repita as etapas 1.4.1-1.4.2 duas vezes e, finalmente, transfira as nanoesferas para a garrafa de vidro. Armazene-o a 4 °C até o uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterização de nanoesferas<ol><li>Caracterize o tamanho e a morfologia das nanoesferas de QDs usando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM)22. NOTA: Diferentes tamanhos de nanoesferas podem ser obtidos alterando a proporção de solução de QDs e solução de PSMA. O tamanho das nanoesferas de QDs também pode ser determinado por meio de espalhamento dinâmico de luz (DLS) 27 .</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de conjugados de anticorpos QDNB
<ol><li>Ativação de grupos carboxila<ol><li>Adicione 100 μL de QDNB preparado (10 mg / mL) em 200 μL de tampão fosfato (PB, 20 mM, pH 6,0) e, em seguida, adicione 6 μL de EDC (20 mg / mL).</li>
		<li>Incube a mistura por 30 min em temperatura ambiente em um misturador rotativo.</li>
		<li>Após a incubação, centrifugue a mistura a 13523 x g durante 10 min à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 100 μL de PB (20 mM, pH 6,0) à precipitação, cubra o tubo com sua tampa e mergulhe o tubo no banho-maria ultrassônico operacional até que o precipitado esteja totalmente disperso.</li>
	</ol></li>
	<li>Conjugação de anticorpos e nanoesferas<ol><li>Dispersar 100 μg de anticorpo em 200 μL de PB (20 mM, pH 6,0) e adicionar a suspensão de QDNB ativada obtida na etapa 2.1 à solução de anticorpos.</li>
		<li>Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min com rotação contínua. Remova o excesso de anticorpos por centrifugação a 6010 x g por 5 min (à temperatura ambiente) e, em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio de nanoesferas<ol><li>Adicionar 200 μL de solução de caseína a 1% (em tampão PB 20 mM, pH 7,4) ao resíduo (obtido na etapa 2.2.2), cobrir o tubo com sua tampa e mergulhá-lo no banho-maria ultrassônico operacional até que o resíduo esteja totalmente disperso.</li>
		<li>Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 2 h com rotação contínua. NOTA: O objetivo desta etapa é bloquear quaisquer locais que não tenham reagido na superfície do QDNB.</li>
	</ol></li>
	<li>Armazenamento de conjugados<ol><li>Adicione 100 μL de solução conservante (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA, 5% de trealose, 6% de sacarose, 0,1% S9, pH 7,4) à mistura e armazene a 4 ° C para uso subsequente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação de tiras de imunoensaio de fluxo lateral
NOTA: A fita imunocromatográfica é composta por uma membrana de nitrocelulose (NC), uma almofada de amostra, uma almofada conjugada, uma almofada absorvente e uma placa de cloreto de polivinila (PVC) (Figura 1). Todas as soluções devem ser preparadas e usadas imediatamente. Recomenda-se que as tiras de imunoensaio de fluxo lateral sejam preparadas em uma sala limpa com umidade controlada.
<ol><li>Preparação da membrana NC<ol><li>Preparar a solução de revestimento da linha de ensaio (linha T) e da linha de controlo (linha C): diluir o anticorpo de captura PCR e a imunoglobulina G anti-coelho caprino com PB até uma concentração final de 1 mg/ml.</li>
		<li>Coloque a placa de PVC corretamente e remova o papel protetor localizado a 25 mm da borda da placa de PVC. Alinhe e cole a membrana NC ao longo da borda inferior do papel protetor restante à placa de PVC.</li>
		<li>Dispense as soluções de revestimento T-line e C-line na membrana NC a uma taxa de jateamento de 1 μL/cm, garantindo que ela seja colocada a 20 mm de distância da borda superior, formando uma linha de teste (1 mm de largura).</li>
		<li>Coloque a membrana NC em condições com umidade inferior a 30% e faixa de temperatura de 18-26 °C para secagem. O tempo de secagem deve ser de pelo menos 24 h. NOTA: Certifique-se de que as bordas superior e inferior da membrana NC estejam niveladas com as bordas correspondentes das áreas adjacentes. As membranas NC não devem ser tocadas com as mãos. A umidade durante esta etapa deve ser controlada dentro da faixa de 45% a 65%. Antes de prosseguir, a solução de revestimento T-line, a solução de revestimento C-line e a membrana NC devem ser equilibradas na mesma temperatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da almofada conjugada<ol><li>Mergulhe a almofada conjugada na solução de tratamento da almofada conjugada (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA).</li>
		<li>Coloque a almofada conjugada embebida em um forno de secagem para tratamento de secagem (temperatura ambiente) durante a noite.</li>
		<li>Cole suavemente a almofada conjugada modificada na placa de PVC.</li>
		<li>Diluir a solução conjugada de anticorpos QDNB preparada com a solução conservante (tampão PB 20 mM, pH 7,4, BSA a 1%, trealose a 5%, sacarose a 6%, S9 a 0,1%, pH 7,4).</li>
		<li>Dispense a solução conjugada de anticorpos QDNB na almofada conjugada a uma taxa de jateamento de 1 μL / cm e seque a almofada conjugada por 24 h. NOTA: A razão de diluição específica deve ser ajustada de acordo com o alvo de detecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da almofada de amostra<ol><li>Mergulhe a almofada de amostra na solução de tratamento da almofada de amostra (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA, 5% de trealose, 6% de sacarose, 0,1% S9, pH 7,4).</li>
		<li>Coloque a almofada de amostra embebida em um forno de secagem (45 °C) e seque por 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Montando o cartão e cortando-o em tiras<ol><li>Conforme mostrado na Figura 1, coloque sucessivamente o papel absorvente (almofada absorvente), almofada conjugada e almofada de amostra na placa de PVC com membrana NC.</li>
		<li>Corte o cartão em tiras de 3,8 mm de largura.</li>
	</ol></li>
	<li>Embalagem das tiras<ol><li>Envolva as tiras de teste em um de plástico e sele uma bolsa de folha de alumínio que contenha um dessecante.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Operação do ensaio e avaliação qualitativa
NOTA: Recomenda-se que as operações envolvendo amostras de sangue humano sejam realizadas em um laboratório de Nível de Biossegurança II. As amostras de plasma humano foram obtidas de um laboratório clínico (de seres humanos não identificados). Normalmente, o sangue humano foi coletado usando um tubo de vácuo EDTA e o plasma foi isolado de acordo com o protocolo padrão34. Centrifugue a 3.000 × g por 10 min em temperatura ambiente para separação de plasma. Recolher a camada superior de plasma amarelo com uma pipeta e conservar o plasma num tubo de 1,5 ml a -80 °C até à utilização.
<ol><li>Pipete 10 μL de amostra de plasma ou solução calibradora em 1 mL de um tampão PBS contendo 0,1% de Tween 20. Em seguida, transfira 100 μL da amostra diluída preparada para a almofada de amostra da tira de teste.</li>
	<li>Após uma corrida de 15 minutos, observe os sinais de fluorescência da linha T e da linha C sob exposição à luz ultravioleta para obter resultados qualitativos.</li>
	<li>Insira o cartão de tira em um leitor de ensaio de fluxo lateral fluorescente para obter as intensidades de fluorescência para análise quantitativa. NOTA: Neste exemplo, o método de imunoensaio sanduíche é empregado35,36; Uma linha vermelha (linha de controle) indica um resultado negativo, enquanto as duas linhas vermelhas (linhas de teste e controle) indicam um resultado positivo. A ausência da linha de controle indica que o teste realizado é inválido.</li>
</ol>

Nanoesferas de pontos quânticos para maior sensibilidade na detecção de biomarcadores

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<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+detection+using+quantum+dot+fluorescence+immunochromatography+combined+with+isothermal+amplification+and+CRISPR%2FCas13a%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a.</a> Biosens Bioelectron. 202, 113978(2022).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+quantum+dot+nanobead+lateral+flow+assay+for+facile+detection+of+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).</li>
<li>Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-need+quantitation+of+2%2C4-dichlorophenoxyacetic+acid+using+a+ratiometric+fluorescent+nanoprobe+and+a+smartphone-based+sensing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system.</a> Sensors Actuators B Chem. 367, 132083(2022).</li>
<li>McCafferty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+processing+and+handling+for+plasma+and+serum+proteomics+BT+-+Serum%2Fplasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT - Serum/plasma proteomics.</a> Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+quantitative+detection+of+C-reactive+protein+based+on+quantum+dots+and+immunofiltration+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay.</a> Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+quantitative+detection+of+C-reaction+protein+based+on+immunofluorescent+nanospheres+coupled+with+lateral+flow+test+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip.</a> Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).</li>
<li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-component+dual-readout+aggregation-induced+emission+nanobeads+for+qualitative+and+quantitative+detection+of+c-reactive+protein+at+the+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care.</a> Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).</li>
<li>Gui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+reverse+fluorescence+dual-signal+readout+immunochromatographic+assay+for+the+sensitive+determination+of+sibutramine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine.</a> ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).</li>
</ol>

Pengfei Zhang é fundador da Shanghai Kundao Biotech e tem potenciais interesses financeiros com esta empresa.

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB)27 e o uso de QDNB para a preparação de imunoensaios fluorescentes de fluxo lateral (LFIA). A medição qualitativa e quantitativa da PCR em amostras é demonstrada. Este LFIA baseado em QDNB também pode ser aplicado a outros biomarcadores de doenças25,32, toxinas alimentares29,30, vírus16,27 e muito mais.
As etapas críticas neste protocolo são a preparação de conjugados de anticorpos QDNB e QDNB. O tamanho de partícula do QDNB e o conteúdo de QD em nanoesferas devem ser otimizados para obter QDNB altamente fluorescente com baixos sinais de fundo no LFIA. Os pares de anticorpos de captura e detecção são essenciais para o imunoensaio e devem ser rastreados para as melhores correspondências de vários fornecedores. A conjugação do anticorpo com QDNB deve ser otimizada, incluindo a relação anticorpo/QDNB, pH tampão e reagentes de bloqueio. Especificamente, a agregação de QDNBs e anticorpos deve ser evitada otimizando o pH do tampão, a concentração de sal e o tempo de reação nos procedimentos de conjugação.
Comparado com outros métodos de preparação para nanoesferas de pontos quânticos, este protocolo tem as vantagens de simplicidade, fácil operação e alta produtividade. Além disso, as nanoesferas compostas de polímero são biocompatíveis, ao contrário das nanoesferas de sílica, que geralmente requerem modificação adicional da superfície com polímeros. No entanto, os QDNBs preparados usando este protocolo não são tão monodispersos quanto aqueles preparados usando nanoesferas de molde de polímero19 ou sílica21 . O tamanho de partícula dos QDNBs geralmente varia de 70 nm a 200 nm.
As tiras de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) baseadas em QDNB são preparadas de forma semelhante a outras LFIAs fluorescentes. Devido aos altos rendimentos quânticos de QDs e à amplificação de sinal de QDNBs, o LFIA baseado em QDNB usando este protocolo é mais sensível do que outros LFIAs baseados em microesferas fluorescentes, como microesferas fluorescentes resolvidas no tempo e microesferas de fluoresceína. Além disso, a estabilidade do QDNB é superior à fluoresceína tradicional, proporcionando LFIAs baseados em QDNB com um tempo de armazenamento mais longo.
No entanto, o cádmio na superfície dos pontos quânticos é propenso à quelação com grupos sulfidrila em proteínas, especialmente em ambientes aquosos. Evitar o uso de altas concentrações de proteína é fundamental para a estabilidade dos LFIAs baseados em QDNB. O cádmio é tóxico e seu uso é limitado em algumas situações, necessitando da preparação de pontos quânticos livres de cádmio com alto rendimento quântico e estabilidade.
Em resumo, é fornecido um método versátil para preparar nanoesferas de pontos quânticos em uma única etapa e é escalável para produção industrial. Usando os QDNBs preparados, tiras de imunoensaio de fluxo lateral fluorescente foram criadas para a detecção qualitativa e quantitativa de biomarcadores de doenças. O QDNB ideal para LFIA é um nanobead de tamanho pequeno encapsulado com vários QDs sem extinção de fluorescência.

As tiras de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) servem como ferramentas cruciais de detecção rápida no local de atendimento 1,2, particularmente na triagem de doenças durante epidemias. No entanto, as tiras de teste LFIA tradicionais à base de ouro coloidal exibem baixa sensibilidade de detecção e fornecem apenas resultados qualitativos3. Para aumentar a sensibilidade de detecção do LFIA, surgiram várias novas nanopartículas, incluindo látex colorido 4,5, nanopartículas fluorescentes de conversão ascendente6, microesferas fluorescentes resolvidas no tempo 7,8 e pontos quânticos 9,10,11. Os pontos quânticos (QDs)12,13, também conhecidos como nanocristais semicondutores, oferecem comprimentos de onda de emissão ajustáveis, uma ampla faixa de excitação e alta eficiência de luminescência, tornando-os rótulos ideais para imagens biológicas.
No entanto, o sinal de fluorescência emitido por pontos quânticos individuais permanece fraco, resultando em sensibilidade de detecção relativamente baixa em imunoensaios. O encapsulamento de vários pontos quânticos dentro de microesferas pode amplificar sinais e melhorar a sensibilidade dos imunoensaios baseados em pontos quânticos. Vários métodos, como automontagem camada por camada 14,15,16,17,18, o método de inchaço19,20 e o encapsulamento da microesfera de sílica 21,22,23,24, foram empregados para encapsular pontos quânticos dentro de microesferas. Por exemplo, marcadores de nanoesferas de sílica funcionalizados por pontos quânticos podem ser alcançados aumentando a carga de QD por imunorreação25 imprensada. Um secador por pulverização equipado com um atomizador ultrassônico também foi usado para preparar nanoesferas QD-BSA em nanoescala26. No entanto, os métodos mencionados acima sofrem de multietapas complexas, têmpera de fluorescência e baixa produtividade.
Em nosso trabalho anterior27, foi relatado um método de evaporação de emulsão-solvente para encapsular pontos quânticos dentro de nanoesferas de polímero. Essa técnica de preparação é simples, mantém a eficiência fluorescente dos QDs, garante alta eficiência de encapsulamento e permite uma produção fácil e escalável. Vários grupos de pesquisa desenvolveram com sucesso tiras LFIA usando QDNBs preparados por meio desse método para aplicações, incluindo detecção de toxinas alimentares 28,29,30, detecção de biomarcadores de doenças infecciosas 31,32 e monitoramento ambiental33.
Este protocolo apresenta etapas específicas de preparação para nanoesferas de pontos quânticos (QDNB), conjugação de QDNB e anticorpos, preparação de LFIA baseada em QDNB e medição de proteína C reativa (PCR) em amostras de plasma humano.

<table><tbody><tr><td>(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td></td></tr><tr><td>Papel de absorbância&nbsp;</td><td>Kinbio Biotech</td><td>CH37K</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td></td></tr><tr><td>CdSe/ZnS ponto quântico</td><td>Suzhou Mesolight Inc.</td><td>CdSe / ZnS-625</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sino Pharm</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CRP</td><td>Hytest Biotech</td><td>4C28</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de ensaio de fluxo lateral fluorescente</td><td>Suzhou Helmence Precision Instrument</td><td>FIC-H1</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de fibra de vidro</td><td>Kinbio Biotech</td><td>SB06</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D111018</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Satorious</td><td>CN140</td><td></td></tr><tr><td>Copolímero de poli(estireno-anidrido maleico)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S458066</td><td></td></tr><tr><td>Coelho IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110502</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sino Pharm</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sino Pharm</td><td>10019718</td><td></td></tr></tbody></table>

imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos

Fluorescent Lateral Flow Immunoassay Based on Quantum Dots Nanobeads

Os pontos quânticos, também conhecidos como nanocristais semicondutores, são novos rótulos fluorescentes para imagens e sensores biológicos. No entanto, conjugados de anticorpo de ponto quântico com pequenas dimensões (~ 10 nm), preparados por meio de procedimentos de purificação trabalhosos, exibem sensibilidade limitada na detecção de certos marcadores de doenças vestigiais usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral. Aqui, apresentamos um método para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) usando um método de evaporação de emulsão de uma etapa. Usando o QDNB preparado, um imunoensaio fluorescente de fluxo lateral foi fabricado para detectar biomarcadores de doenças usando proteína C-reativa (PCR) como exemplo. Ao contrário das nanopartículas de ponto quântico único, os conjugados de nanoesferas de pontos quânticos e anticorpos são mais sensíveis como marcadores de imunoensaio devido à amplificação do sinal, encapsulando centenas de pontos quânticos em uma nanoesfera composta de polímero. Além disso, o tamanho maior dos QDNBs facilita a separação por centrifugação ao conjugar QDNBs com anticorpos. O imunoensaio fluorescente de fluxo lateral baseado em QDNBs foi confeccionado, e a concentração de PCR na amostra foi medida em 15 min. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor fluorescente em 15 minutos.

Os procedimentos de preparação do QDNB são ilustrados esquematicamente na Figura 1A. A fase oleosa contendo QDs e polímero em clorofórmio foi misturada com a fase aquosa, e uma mini-emulsão foi obtida por sonicação. A emulsão foi solidificada por evaporação gradual do clorofórmio. A micrografia eletrônica de transmissão (MET) do QDNB é apresentada na Figura 2A. Os QDNBs têm uma morfologia esférica, com diâmetros médios de 96 nm, medidos em 50 QDNBs em imagens MET. As nanopartículas QD são claramente observadas dentro das nanoesferas, indicando encapsulamento bem-sucedido. A Figura 2B e a Figura 2D mostram os espectros de fluorescência e absorção do QDNB, respectivamente.
O QDNB e o anticorpo foram conjugados usando química de carbodiimida, conforme mostrado na Figura 1B. O conjugado de anticorpos QDNB foi usado para preparar LFIA baseado em QDNB. A estrutura do LFIA é ilustrada na Figura 1C. Se o antígeno da PCR estiver presente na amostra, os conjugados QDNB-anti-CRP se acumulam na linha de teste.
Conforme mostrado na Figura 3, a medição é realizada adicionando 100 μL de amostra diluída ao orifício da amostra. Após um tempo de reação de 15 min, os resultados do teste podem ser lidos qualitativamente sob iluminação de luz UV. Os resultados quantitativos podem ser obtidos usando um leitor de fitas fluorescentes, e a concentração da amostra pode ser calculada usando uma equação de calibração embutida no software leitor de fitas37,38.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração do imunoensaio fluorescente de fluxo lateral baseado em nanoesferas de pontos quânticos. (A) Procedimentos para a preparação do QDNB. (B) Princípio dos conjugados QDNB-anticorpos. (C) Princípio da LFIA baseada em QDNB para a detecção de PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização de QDNBs. (A) Imagem TEM de QDNBs. Barra de escala: 100 nm. (B) Espectros de emissão fluorescente de QDNB. (C) Espectros de absorção de QDNB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig03.jpg"> Figura 3: Procedimentos de imunoensaio de fluxo lateral para PCR. (A) Ilustração da detecção. (B) Fotografias de tiras LFIA baseadas em QDNB detectando amostras de PCR em uma faixa de 0-30 mg/L sob luz UV. (C) Leitor fluorescente para quantificação dos resultados. (D) Fotografia dos resultados quantitativos. (E) Detecção de proteína C reativa (PCR) usando transformação logística seguida de regressão linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) e a detecção de biomarcadores de doenças usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral baseadas em QDNB. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor de tiras fluorescentes em 15 minutos.

Imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos

Quantum dots, also known as semiconductor nanocrystals, are novel fluorescent labels for biological imaging and sensing. However, quantum dot-antibody ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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