Name: Montagem de organoides retinianos com microglia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprenda a montar organoides retinianos com microglia usando células-tronco embrionárias humanas e técnicas de co-cultura. Este modelo avança o estudo de doenças degenerativas da retina e interações neuroimunes.

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Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82101145) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (Z200014).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. A linhagem celular H9 dos HESCs era do Instituto de Pesquisa WiCell. Pré-aqueça o meio de cultura celular à temperatura ambiente (RT) por 30 min antes do experimento.
1. Geração de micróglia humana
<ol><li>Cultive as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 106 células em cada poço.</li>
	<li>Aspire o meio de células-tronco e enxágue as células com 1x DPBS (1 mL / poço de placa de 6 poços). A próxima etapa requer 2 x 107-1 x 108 células. Se não for suficiente, combine células de 2 a 5 poços para executar as etapas a seguir.</li>
	<li>Dissocie as colônias de células-tronco usando a solução de EDTA 0,5 mM por cerca de 5 min em uma incubadora a 37 ° C (1 mL / poço de placa de 6 poços).</li>
	<li>Verifique a morfologia da colônia após 5 min. Quando as bordas da colônia estão ligeiramente enroladas com lacunas soltas, as células estão prontas para serem diferenciadas e aspirar o EDTA. Caso contrário, incube as células a 37 °C por mais 1-2 min. Não incube por mais de 8 min.</li>
	<li>Enxágue suavemente as células em cada poço usando 6 mL de meio A (Tabela 1) com 6 μL de solução de inibidor de ROCK Y-27632 10 mM. Bata suavemente no fundo do prato para ajudar a enxaguar as células. Defina o dia como dia 0. NOTA: Não pipete as células. As células formarão corpos embrióides (EBs) no dia seguinte.</li>
	<li>Após 24 h, observe as células ao microscópio para confirmar a formação de EB. Colete os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os EBs com 6 mL de Medium A fresco e transfira-os para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Cultura em incubadora a 37 °C. NOTA: O objetivo da transferência do poço no dia 1 é reduzir a influência de um grande número de células mortas durante o processo de formação de EB, o que pode afetar o estado de crescimento celular.</li>
	<li>Atualize o Meio A fresco diariamente até o dia 4 (6 mL / poço de placa de 6 poços).</li>
	<li>No dia 4, cubra uma placa de 10 cm com 3 mL de solução de gelatina de peixe a 0,1% por pelo menos 1 h em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C. NOTA: Se o tempo de revestimento for inferior a 1 h, é difícil realizar as etapas a seguir.</li>
	<li>Colete cuidadosamente os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.</li>
	<li>Remova a solução de gelatina a 0,1% e enxágue o prato de 10 cm uma vez com 5-6 mL de 1x DPBS. Remova o DPBS.</li>
	<li>Ressuspenda suavemente os EBs com 15 mL de Meio B (Tabela 1) no tubo centrífugo de 15 mL e transfira-os para o prato revestido de 10 cm. Cultura em incubadora a 37 °C, CO 5%2 por 1 semana. NOTA: Nos primeiros 7 dias, não mova o prato.</li>
	<li>Refresque com Medium B fresco uma vez por semana até o dia 49 (prato de 15 mL / 10 cm) e examine as células ao microscópio uma vez por semana. NOTA: Após o dia 49, várias células secretoras podem ser encontradas no sobrenadante na placa de cultura.</li>
	<li>Centrifugar as células sobrenadantes a 200 x g durante 5 min a RT.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células com 2 mL de meio B fresco e transfira para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Incubar em uma incubadora de CO2, 37 °C a 5%. NOTA: Nos próximos 7 dias, não mova a placa. A microglia pode aderir ao fundo do poço de baixa adesão.</li>
	<li>No dia 56, substitua por Medium C (Tabela 1) (2 mL / poço de placa de 6 poços). A microglia adere ao fundo do poço de baixa adesão e parecerá ramificada ao microscópio. NOTA: Ao trocar o meio C a cada 3 dias (2 mL / poço de placa de 6 poços), a microglia pode ser cultivada em meio C por cerca de 15 dias.</li>
</ol>2. Geração de ROs humanos e co-cultura dos ROs com microglia
<ol><li>Cultivei as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 106 células em cada poço.</li>
	<li>Adicione Dispase (1 mL / poço de placa de 6 poços) à célula de cultura. Incubar a 37 °C durante 5 min. Aspire a solução Dispase do poço.</li>
	<li>Adicione o Médio D (Tabela 1) (1 mL / poço de placa de 6 poços) ao poço. Corte a célula em pedaços pequenos com uma pipeta de 10 μL.</li>
	<li>Recolha cuidadosamente todos os pedaços de células e meios num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugue a 200 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda suavemente as células em 200 μL de uma matriz fria. Mova o tubo de microcentrífuga de 1.5 para uma incubadora por 20 min. Opere rápido porque a matriz se solidificará à temperatura ambiente (RT). Após 20 minutos na incubadora, a matriz se solidificará.</li>
	<li>Prepare uma placa de 10 cm com 15 mL de Medium D. Ressuspenda a matriz com Medium D e agite a placa de Petri suavemente.</li>
	<li>Em seguida, coloque o prato em uma incubadora por 5 dias. Não mova a placa. Defina o dia como dia 0 (ROs). As células irão aderir em 3 dias.</li>
	<li>No dia 5 (ROs) e no dia 10 (ROs), atualize o meio com Medium D.</li>
	<li>No dia 12 (ROs), remova o meio e adicione 3 mL de Dispase a cada prato por 5 min.</li>
	<li>Aspire o Dispase e adicione 15 mL de Medium E (Tabela 1).</li>
	<li>Colheita da microglia: No dia 56 (MGs), aspire suavemente o Medium C, adicione Accutase (1 mL / poço de uma placa de 6 poços) e incube a 37 ° C por 3 min.</li>
	<li>Colete as células da microglia em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Centrifugue as células a 200 x g em RT por 5 min.</li>
	<li>Aspire suavemente o sobrenadante e suspenda a microglia com 1 mL de Medium E. Adicione microglia às ROs digeridas no dia 12. NOTA: No dia 12 (ROs), as células são adesivas. No dia 13 (ROs), as células são encontradas suspensas no meio E. Se o meio mudar de amarelo do dia 12 (ROs) para o dia 19 (ROs), atualize o meio com Medium E.</li>
	<li>No dia 19 (ROs), agregue os organoides ao centro do prato, girando suavemente o prato. Aspire suavemente o Medium E e refresque o meio com Medium F.</li>
	<li>Transfira os organoides com Medium F para um novo prato de suspensão.</li>
	<li>Troque o meio uma vez por semana e selecione organoides para experimentos.</li>
</ol>

Organoides retinianos integrados à microglia: um modelo para estudar doenças da retina

<ol><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298(2021).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629(2022).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li>
</ol>

Os autores não estão cientes de quaisquer afiliações, membros, subsídios ou participações financeiras que possam afetar a objetividade deste estudo.

Devido à disponibilidade restrita da retina humana, nossa compreensão atual das respostas inflamatórias da retina vem quase de modelos animais. Para superar essa limitação, os organoides retinianos foram diferenciados. O desenvolvimento de modelos organoides retinianos tem sido uma área ativa de pesquisa, com o objetivo de recapitular a complexidade da retina humana para modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de organoides retinianos a partir de células-tronco pluripotentes humanas 1,2,12,13. No entanto, a maioria desses modelos não possui a presença de microglia, que são conhecidas por desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento da retina e na patogênese da doença. Estudos recentes tentaram integrar a microglia em organoides retinianos ou modelos organoides cerebrais 16,17,18, mas o método detalhado não é claro. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo detalhado para co-cultura de microglia com organoides retinianos no estágio inicial, ambos derivados da mesma linha hESC. Embora alguns estudos tenham explorado o papel da microglia em doenças da retina usando modelos animais ou sistemas de cultura de células 7,8,9, o modelo de co-cultura apresentado aqui oferece um sistema baseado em humanos fisiologicamente mais relevante para estudar as interações microglia-retina e suas implicações na patogênese da doença.
As etapas críticas são o estado celular das células-tronco humanas e a diferenciação da microglia e dos organoides da retina. Microglia e ROs devem ser diferenciados passo a passo, e reagentes e placas corretos (placa tratada com cultura de tecidos ou placa de suspensão) devem ser usados em diferentes estágios. Este modelo pode nos ajudar a entender o processo de como a microglia contribui para a ocorrência de doenças da retina. Ele tem implicações significativas para futuras triagens de drogas e investigações sobre mecanismos de doenças. No entanto, os métodos que publicamos atualmente ainda têm algumas limitações. Devido ao período prolongado de diferenciação da microglia e à falta de métodos adequados de criopreservação, devemos planejar nosso tempo com sabedoria para a diferenciação da microglia e dos organoides da retina para co-cultura.
Além dos organoides da retina, acreditamos que a integração de células imunes em outros modelos de organoides também pode promover o desenvolvimento de organoides. Portanto, testar outros sistemas organoides é crucial. A integração de vários tipos de células e organoides para formar órgãos completos representa um modelo promissor para o futuro.

Como fonte limitada da retina humana, a diferenciação de células-tronco humanas em organoides retinianos tridimensionais (3D) representa um modelo in vitro promissor para simular a retina1. Ele contém diferentes tipos de células na retina, incluindo fotorreceptores, células ganglionares da retina, células bipolares, células de Müller, células horizontais e astrócitos2. Este modelo permite a emulação e o estudo dos mecanismos de desenvolvimento da retina e da patogênese das doenças da retina. No entanto, devido ao método de diferenciação direcional, os organoides retinianos foram derivados do neuroectoderma3, faltando muitos outros tipos de células originárias de diferentes camadas germinativas, como a microglia do saco vitelino e as células perivasculares do mesoderma 4,5,6.
Atualmente, muitas doenças da retina, como retinite pigmentosa7, glaucoma8 e retinoblastoma9, provaram estar intimamente relacionadas à microglia dentro da retina. No entanto, devido à falta de modelos de pesquisa adequados, mecanismos específicos que ilustram a relação entre a microglia e essas doenças ainda permanecem obscuros. Embora os camundongos tenham servido como um modelo favorável para o estudo de doenças da retina, estudos recentes destacaram diferenças significativas entre a microglia de camundongos e humanos em termos de expectativa de vida, taxa de proliferação e ausência de genes homólogos humanos10,11. Essas descobertas sugeriram que as conclusões tiradas de modelos de camundongos podem não ser totalmente confiáveis, enfatizando a importância da construção de organoides retinianos humanos contendo microglia.
Nas últimas décadas, vários métodos para a diferenciação 3D de organoides retinianos foram desenvolvidos12,13. Para facilitar a operação de co-cultura da microglia dentro dos organoides da retina, selecionamos um método de diferenciação envolvendo uma transição da cultura aderente para a cultura em suspensão. Essa abordagem permite que a microglia seja incorporada aos organoides da retina, mantendo-os por pelo menos 60 dias14.

<table><tbody><tr><td>Acctuase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRX(M02)</td><td>abnova</td><td>H00001406-M02</td><td>Anticorpo; diluição de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Abcam</td><td>ab5076</td><td>Anticorpo; diluição de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1U/mL)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industry</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G7041-100G</td><td>Solid</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular H9</td><td>WiCell Research Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>RD Systems&nbsp;</td><td>203-IL-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech</td><td>200-34-50UG</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>RD Systems&nbsp;</td><td>216-MC-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pen/estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Meio de células-tronco&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5990</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>X-ViVO</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr></tbody></table>

montagem de organoides retinianos com microglia

Assembling Retinal Organoids with Microglia

Devido à acessibilidade limitada da retina humana, os organoides retinianos (ROs) são o melhor modelo para estudar doenças retinianas humanas, o que pode revelar o mecanismo de desenvolvimento da retina e a ocorrência de doenças retinianas. A microglia (MG) são macrófagos residentes únicos na retina e no sistema nervoso central (SNC), servindo a funções imunitárias cruciais. No entanto, os organoides retinianos carecem de micróglia, pois sua origem de diferenciação é o saco vitelino. A patogênese específica da microglia nessas doenças da retina permanece obscura; Portanto, o estabelecimento de um modelo organoide retiniano incorporado à microglia revela-se necessário. Aqui, construímos com sucesso um modelo co-cultivado de organoides retinianos com microglia derivada de células-tronco humanas. Neste artigo, diferenciamos a microglia e, em seguida, co-cultivamos em organoides retinianos no estágio inicial. Como incorporação de células imunes, este modelo fornece uma plataforma otimizada para modelagem de doenças da retina e triagem de medicamentos para facilitar pesquisas aprofundadas sobre a patogênese e o tratamento de doenças relacionadas à retina e ao SNC.

O procedimento para geração de organoides retinianos é descrito em nosso estudo anterior15. Aqui, mostramos os resultados representativos da microglia e da co-cultura de microglia e organoides da retina.
Aqui, demonstramos cada estágio da diferenciação da microglia (Figura 1A). O dia 0 representa o estágio da cultura de células-tronco. Em seguida, as células-tronco foram digeridas e cultivadas para formação de EB. Nos primeiros 4 dias do processo, as células formarão EBs (Figura 1B). Posteriormente, transferimos os EBs suspensos para pratos aderentes de 10 cm. Após aproximadamente 7 dias, as células são semelhantes às mostradas na Figura 1C. À medida que a cultura progride, as células aderentes secretam progenitores hematopoiéticos no sobrenadante (Figura 1D). Esse processo leva aproximadamente 45 dias. Neste ponto, as células podem ser colhidas do sobrenadante e transferidas para placas de 6 poços. Nos próximos 7 dias, a microglia ficará madura (Figura 1E) e pronta para novas experimentações.
No dia 12 da diferenciação do organoide retiniano, as células aderentes são digeridas para cultura em suspensão e o meio E contendo microglia é adicionado aos organoides retinianos. A microglia migrará para os organoides da retina. Para observar claramente a morfologia da microglia, adicionamos a transfecção de EGFP-lentivírus nas hESCs, o que fez com que a microglia diferenciada expressasse GFP com autofluorescência (Verde) (Figura 2A-C). Também examinamos a estrutura tecidual de organoides retinianos co-cultivados com microglia usando o marcador de células fotorreceptoras CRX e o marcador de células microgliais IBA1 por ensaio de imunofluorescência em organoides retinianos co-cultivados com microglia após diferenciação por 50 dias (Figura 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático e linha do tempo da célula da microglia derivada de hESC. (A) O protocolo começa com o descongelamento e passagem de hESCs em uma placa de 6 poços. (B) Os EBs homogêneos formados contendo o meio A. (C) Os EBs são transferidos para uma placa revestida e os progenitores hematopoiéticos são formados nos dias 4-56. (D, E) No dia 56, o sobrenadante com células é coletado (D) e transferido para uma placa de 6 poços de baixa adesão para formar microglia no dia 63 (E). Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig02.jpg"> Figura 2: Imagens representativas ao longo da linha do tempo durante a co-cultura de microglia e organoides da retina. (A) Imagens representativas de células da microglia derivadas de EGFP-hESC. (B) Co-cultura de microglia EGFP+ com organoides retinianos após diferenciação por 18 dias. (C) Co-cultura de microglia EGFP+ com organoides retinianos após diferenciação por 30 dias. Barra de escala: 300 μm. (D) CRX (marcador de células fotorreceptoras; vermelho) e IBA1 (marcador microglial; verde) foram usados para detectar a estrutura tecidual de organoides retinianos co-cultivados com microglia após 50 dias de diferenciação. DAPI (azul) cora o núcleo. Barra de escala: 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Composição da mídia utilizada neste estudo. Os componentes necessários para preparar o volume de 500 mL de cada meio estão listados na tabela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/Table%201-67016R1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Montagem de organoides retinianos com microglia

Due to the limited accessibility of the human retina, retinal organoids (ROs) are the best model for studying human retinal disease, which could reveal ...

assembling-retinal-organoids-with-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Apresentamos um protocolo para gerar um organoide cerebral humano com microglia residente, incorporando células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) no desenvolvimento de organoides.

Derivação de um organoide do cérebro humano com desenvolvimento de microglia

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Este vídeo demonstra três tipos de análise morfométrica da retina, que incluem a medição da espessura da camada nuclear interna, a quantificação do número de células ganglionares da retina (RGCs) e medindo os tamanhos dos RGCs. A técnica pode oferecer uma plataforma simples, mas científica para análises morfométricas.

Análises morfométricas de secções da retina

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Aprenda a montar organoides retinianos com microglia usando células-tronco embrionárias humanas e técnicas de co-cultura. Este modelo avança o estudo de doenças degenerativas da retina e interações neuroimunes.

Montagem de organoides retinianos com microglia

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