Montagem de organoides retinianos com microglia
July 26th, 2024
A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.
Para começar, obtenha as células-tronco embrionárias humanas no meio de células-tronco com uma densidade celular de 80 a 90%Após remover o meio gasto, enxágue as células em cada poço com um mililitro de 1X DPBS. Incube as colônias de células-tronco em cada poço com um mililitro de EDTA 0,5 milimolar por aproximadamente cinco minutos a 37 graus Celsius. Verifique a morfologia da colônia para confirmar se as bordas estão ligeiramente enroladas com lacunas soltas.
Aspire o EDTA e, se necessário, incube as células a 37 graus Celsius por mais um a dois minutos, mas não excedendo oito minutos. Enxágue suavemente as células em cada poço com seis mililitros de meio A contendo seis microlitros de solução de inibidor de ROCK Y-27632 de 10 milimolares. Bata suavemente no fundo do prato para ajudar a enxaguar as células.
Após 24 horas, observe as células ao microscópio para confirmar a formação do corpo embrionário. Usando uma pipeta de 10 mililitros, colete os corpos embrionários em um tubo centrífugo de 15 mililitros e espere que os corpos embrionários se assentem no fundo por cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os corpos embrionários em seis mililitros de meio fresco A. Transfira-os para um novo poço de baixa adesão de uma placa de seis poços e cultive em uma incubadora a 37 graus Celsius.
No quarto dia, cubra um prato de 10 centímetros com três mililitros de solução de gelatina de peixe a 0,1% e incube por pelo menos uma hora em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% e 37 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de gelatina e enxágue o prato uma vez com cinco a seis mililitros de 1X DPBS. Colete cuidadosamente os corpos embrionários em um tubo centrífugo de 15 mililitros e espere que os corpos embrionários se assentem no fundo em cinco minutos.
Ressuspenda suavemente os corpos embrionários com 15 mililitros de meio B e transfira-os para o prato revestido de 10 centímetros. Cultura em incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por uma semana após 49 dias. Centrifugar as células a 200 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células com dois mililitros de meio fresco C. Transfira para um novo poço de baixa adesão de uma placa de seis poços. Incube a placa em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono, 37 graus Celsius. No dia 56, substitua o meio gasto por dois mililitros de meio C por poço.
Examine a placa ao microscópio para identificar a microglia ramificada que adere ao fundo do poço de baixa aderência. Para colher micróglia para co-cultura, substitua suavemente o C médio em cada poço por um mililitro de Accutase e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Usando uma pipeta de cinco mililitros, colete as células da microglia em um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 200 x g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Depois de descartar o sobrenadante, suspenda a microglia com um mililitro de E médio.
Visão Geral
Este estudo investiga o papel da microglia em doenças degenerativas da retina através da geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos e microglia. Este modelo visa melhorar a compreensão da patogênese e do desenvolvimento de doenças retinianas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia da Retina
- Imunologia
Fundo
- Microglia são células imunes residentes na retina.
- Elas desempenham papéis cruciais na patologia de doenças degenerativas da retina.
- Entender as funções microgliais pode ajudar no desenvolvimento de terapias.
- Modelos de co-cultura permitem uma análise mais abrangente das interações celulares.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um modelo de co-cultura confiável de organoides retinianos e microglia.
- Investigar os mecanismos patogênicos subjacentes às doenças retinianas.
- Melhorar a compreensão do comportamento microglial no ambiente retiniano.
Métodos Utilizados
- O estudo utilizou um modelo de co-cultura envolvendo organoides retinianos e microglia humana derivada de células-tronco embrionárias.
- As células-tronco embrionárias humanas foram cultivadas até atingir uma densidade específica, seguida pela isolação microglial.
- O modelo observou estágios de desenvolvimento ao longo de um período de 30 dias.
- As condições de cultivo incluíram incubação a 37 graus Celsius com gases controlados.
- Técnicas de imunofluorescência foram usadas para confirmar a presença de microglia e marcadores retinianos.
Principais Resultados
- Organoides retinianos co-cultivados exibiram autofluorescência GFP significativa indicando microglia ativa.
- A imunofluorescência confirmou a expressão de marcadores de fotorreceptores retinianos (CRX) e marcadores microgliais (IBA1).
- O estudo destaca a interação entre microglia e células retinianas durante a modelagem de doenças.
Conclusões
- Este estudo demonstra um modelo de co-cultura funcional que reflete a complexidade das doenças retinianas.
- Ele permite insights sobre os papéis microgliais na patologia retiniana, potencialmente orientando estratégias terapêuticas.
- As implicações do modelo se estendem para uma melhor compreensão dos mecanismos de interações neuroimunes em doenças oculares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Integrating microglia into human retinal organoids addresses a critical gap in disease-relevant modeling for retinal and CNS drug discovery. This co-culture system enhances predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for neuroimmune interactions. The platform supports translational continuity from discovery through preclinical research, enabling more informed portfolio decisions in ophthalmic and neurodegenerative pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglia-mediated mechanisms in retinal disease models.
- Supports functional target validation by recapitulating immune cell interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroimmune targets in ophthalmology.
- Improves predictive confidence for early-stage asset triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated co-culture system for compound screening in a human-relevant context.
- Enables quantitative assessment of microglial and photoreceptor marker expression.
- Supports reproducible assay development for immune-modulating therapeutics.
- Prepares a scalable platform for screening neuroinflammatory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery and preclinical validation for retinal and CNS indications.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human cell-derived data.
- Supports mechanistic studies of neuroimmune interactions in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture model fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research for retinal and CNS drug programs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of microglia-retina interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible organoid systems with quantifiable immune and neuronal markers.
- Analytics: Provides immunofluorescence and autofluorescence readouts for comparative analysis of disease and intervention effects.
- Translational Research: Supports alignment with human disease mechanisms and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neuroimmune and ophthalmic research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by modeling human disease complexity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets targeting retinal and CNS diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and co-culture techniques.
- Needs access to advanced imaging and immunofluorescence analytics.
- Demands cross-team standardization for reproducible outputs.
- May require adaptation for different disease models or cell sources.
- Potential variability in cellular responses should be considered in experimental design.
