Name: Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a utilizar microscopia correlativa de luz e eletrônica de duas cores para visualizar interações entre mitocôndrias e lisossomos em células HeLa. Este método avança estratégias terapêuticas para doenças neurodegenerativas.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa básica KBRI através do Korea Brain Research Institute, financiado pelo Ministério da Ciência e TIC (24-BR-01-03). TMEM192-V5-APEX2 plasmídeos foram gentilmente cedidos por Hyun-Woo Rhee (Universidade Nacional de Seul). Os dados TEM foram adquiridos nas Instalações Centrais de Pesquisa do Cérebro em KBRI.

O fluxo de trabalho passo a passo para a preparação da amostra é mostrado em Figura 1.
1. Cultura celular e transfecção
<ol>
	<li>Cultivar células HeLa a uma densidade de 1 × 105 células em placas de cultura de vidro de 35 mm com fundo de grelha contendo DMEM com 10% de soro fetal bovino e 100 U/ml de penicilina e estreptomicina a 37 °C.</li>
	<li>No dia seguinte à semeadura das células, co-transfecte as células em confluência de 30% a 40% com plasmídeos TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM usando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (1 μg de DNA de plasmídeo TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM com 3 μL de reagente de transfecção). Após a transfecção, trate as células com DMSO ou U18666A (2 μg/mL) e Bafilomicina A1 (100 nM) por 18 h.</li>
</ol>
2. Imagem microscópica confocal
<ol>
	<li>Depois de tratar as células com Bafilomicina e U18666A por 18 h, remova o meio de cultura e adicione imediatamente 250 μL de solução fixadora quente (30 ° C-37 ° C) (2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em solução de cacodilato de sódio 0,1 M [pH 7,0]) por pipetagem suave. Remova imediatamente o fixador, substitua-o por 1,5 mL de fixador fresco e incube no gelo por 30 min. Em seguida, lave as células por 3 x 10 min em 1 mL de tampão de cacodilato de sódio 0,1 M gelado. 
	NOTA: Os vapores de aldeído são tóxicos. Todos os experimentos devem ser conduzidos em uma capela ventilada.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução fria de glicina a 20 mM para extinguir o aldeído e incube no gelo por 10 min. Lave 3 x 10 min em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M frio.</li>
	<li>Preparar uma solução nova contendo 300 μM de Amplex-Red adicionando 10 mM de H2O2 a uma solução de cacodilato 0,1 M. Adicione 500 μL de solução Amplex-Red ao prato de amostra e incube por 5 min no gelo.</li>
	<li>Remova a solução Amplex-Red e enxágue 3 x 10 min com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M.</li>
	<li>Após a coloração Amplex-Red, use um microscópio confocal para obter imagens da área ao redor das células de interesse no modo de varredura 3 x 3. Capture o contraste de interferência diferencial (DIC) e o sinal de fluorescência para identificar e registrar a grade e as letras na antena parabólica usando uma objetiva de 40x (ou 60x). 
	NOTA: Essas imagens de visão geral servem como um mapa para identificar células-alvo específicas nas amostras incorporadas em plástico.</li>
	<li>Visualize as células-alvo em alta ampliação usando uma objetiva de 40x (ou 60x) e adquira uma imagem de pilha Z. 
	NOTA: Esta imagem de alta ampliação é sobreposta a uma imagem de microscópio eletrônico para criar uma imagem correlativa.</li>
</ol>
3. Preparação de amostras para o bloco EM
<ol>
	<li>Após a imagem da LM, adicione 1 mL de tetróxido de ósmio reduzido a 1% (preparado contendo ferrocianeto de potássio a 3% em tampão cacodilato 0,3 M com um volume igual de tetróxido de ósmio aquoso a 2%) para pós-fixação a 4 ° C por 1 h e, em seguida, enxágue por 3 x 10 min com água destilada a 4 ° C. 
	NOTA: Os vapores de tetróxido de ósmio são tóxicos. Todos os experimentos devem ser realizados em uma capela ventilada.</li>
	<li>Enxágue 3 x 10 min com água destilada à temperatura ambiente e, em seguida, desidrate em uma série graduada de etanol por 15 min de cada vez (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) em temperatura ambiente.</li>
	<li>Misture etanol com resina epóxi em proporções de volume de 3:1, 1:1 e 1:3, preparando um total de 300 μL de cada mistura. Despeje cada resina epóxi no prato, deixando-o incubar em temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, use a resina 100% epóxi para impregnação durante a noite.</li>
	<li>Prepare a cápsula de incorporação ou tubo de PCR enchendo-o com resina epóxi fresca, coloque o tubo ou cápsula de cabeça para baixo na região de interesse e coloque-o em um forno a 60 ° C por 48 h para polimerizar.</li>
</ol>
4. Seccionamento e imagem TEM
<ol>
	<li>Depois que a resina epóxi estiver completamente polimerizada, separe o vidro inferior do bloco de polímero imergindo-o em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Coloque o bloco de amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo e coloque-o no bloco de corte. Use uma lâmina de barbear para aparar a resina em uma forma trapezoidal ou retangular ao redor do objeto de interesse.</li>
	<li>Coloque o bloco de amostra aparado no porta-amostras e ajuste a lâmina diamantada. Certifique-se de que a borda de ataque do bloco de amostra esteja perfeitamente paralela à borda da lâmina de diamante.</li>
	<li>Usando um ultramicrótomo, corte seções ultrafinas a aproximadamente 60-70 nm das células embutidas planas. Recolha as seções seriais em uma grade de ranhura revestida de formvar e seque-as em uma placa quente.</li>
	<li>Manchar a seção com a mancha de contraste por 2 min e citrato de chumbo por 1 min.</li>
	<li>Colocar a grelha no suporte de amostras MET para observação. Identifique a célula-alvo de interesse com base na imagem DIC do microscópio óptico. Crie imagens de toda a área da célula usando imagens lado a lado e sobrepostas com ampliação de 1.700x.</li>
</ol>
5. Costura de imagem usando imageJ Fiji.
<ol>
	<li>Para iniciar a costura da imagem, inicie imageJ Fiji25 e clique em Arquivo | Novo | TrakEM2 (em branco) | Selecione a pasta de armazenamento para criar um novo projeto TrakEM226 (Figura 2A1).</li>
	<li>Abra o conjunto de dados da imagem do bloco arrastando e soltando os dados brutos da imagem do bloco no espaço de trabalho (Figura 2A2).</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse e selecione Alinhar | Montagem de todas as imagens nesta camada | elástico (correspondências de bloco não lineares) e, em seguida, clique em OK para aceitar os parâmetros restantes dos valores padrão (Figura 2A3).</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse e selecione Exportar | Criar imagem plana para criar uma imagem costurada e clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem.</li>
</ol>
6. Redimensionando a imagem de fluorescência
<ol>
	<li>Abra o software de ampliação de fotos (consulte Tabela de materiais). Clique em Arquivo | Abra e selecione a imagem de fluorescência.</li>
	<li>Insira a largura e a altura para serem do mesmo tamanho da imagem do microscópio eletrônico e selecione o algoritmo a ser aplicado no método de redimensionamento (Figura 2B1).</li>
	<li>Clique em Arquivo | Salvar COMO para salvar a imagem redimensionada.</li>
</ol>
7. Registro de imagem baseado em ponto de referência com o plug-in Big Warp
<ol>
	<li>Abra o ImageJ Fiji e arraste e solte a micrografia de fluorescência redimensionada (imagem FM) e a micrografia eletrônica costurada (imagem EM).</li>
	<li>Clique em Plugins | Visualizador de BigData | Big Wrap para iniciar o registro e, em seguida, clique no menu suspenso para selecionar a imagem FM como a imagem em movimento e a imagem EM como a imagem de destino (Figura 2C1). 
	NOTA: Cada imagem FM e EM terá três novas janelas pop-up (imagem em movimento do BigWrap, imagem fixa do BigWrap e pontos de referência) para exibir pontos de referência.</li>
	<li>Compare as imagens FM e EM usando funções como zoom (roda do mouse), rotação da imagem (mover o mouse enquanto mantém pressionado o botão esquerdo) e mover (mover o mouse enquanto mantém pressionado o botão direito) e, em seguida, pressione a barra de espaço no teclado para ativar o modo Ponto de referência e pressione o botão esquerdo do mouse para marcar pelo menos três pontos de referência identificados nas imagens FM e EM ( <classe forte = "xfig" >Figura 2C2, pontos rosa e seta vermelha).</li>
	<li>Depois de marcar todos os pontos de referência identificados, vá para Arquivo | Exportar imagem em movimento | OK e uma nova janela pop-up aparecerá com a imagem FM transformada (Figura 2C3). 
	NOTA: A janela pop-up recém-criada é uma imagem FM transformada com base no ponto de referência. Revise o alinhamento e faça ajustes, se necessário, adicionando ou modificando pontos de referência e recalculando a transformação.</li>
	<li>Clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem FM transformada.</li>
</ol>
8. Sobreposição de imagens CLEM
<ol>
	<li>No ImageJ, arraste e solte a imagem FM transformada e a imagem EM unida.</li>
	<li>Clique na imagem | Tipo | Cor de 8 bits para definir o mesmo tipo de imagem para as imagens LM e EM (Figura 2D1). 
	NOTA: A imagem EM deve ser convertida duas vezes na seguinte ordem: 8 bits -> Cor RGB -> Cor de 8 bits.</li>
	<li>Clique na imagem | Cor >| Mesclar canais para combinar as imagens em uma imagem composta selecionando as imagens FM e EM no menu suspenso, respectivamente (Figura 2D2).</li>
	<li>Clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem CLEM.</li>
</ol>

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

<ol><li>Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+mitochondrial+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of mitochondrial membrane dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).</li>
<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Lopez, J., Tait, S. W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+apoptosis%3A+Killing+cancer+using+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within.</a> Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).</li>
<li>Wang, C., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+apoptosis%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in apoptosis*.</a> Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).</li>
<li>Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+mitochondria+and+cell+metabolism%3A+A+functional+triangle+in+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).</li>
<li>Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+machineries%2C+regulation+and+cellular+functions+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).</li>
<li>Talari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-droplet+associated+mitochondria+promote+fatty-acid+oxidation+through+a+distinct+bioenergetic+pattern+in+male+wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats.</a> Nat Commun. 14 (1), 766(2023).</li>
<li>Enkler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf1+coordinates+fatty+acid+metabolism+and+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis.</a> Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).</li>
<li>Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+biology+and+function%3A+Modern+view+of+cellular+debris+bin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin.</a> Cells. 9 (5), 1131(2020).</li>
<li>Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysosome-centered+view+of+nutrient+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A lysosome-centered view of nutrient homeostasis.</a> Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).</li>
<li>Thelen, A. M., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+the+lysosome+in+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism.</a> Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome-related+organelles+mediate+mitochondrial+clearance+during+cellular+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation.</a> Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).</li>
<li>Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+mitochondria-lysosome+contacts+by+gba1+dysfunction+in+dopaminergic+neuronal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease.</a> Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).</li>
<li>Pickrell, A. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+pink1%2C+parkin%2C+and+mitochondrial+fidelity+in+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease.</a> Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).</li>
<li>Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+regulation+of+inter-mitochondrial+contact+fate+and+motility+in+charcot-marie-tooth+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2.</a> Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).</li>
<li>Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+dynamics+via+lysosomal+trpml1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).</li>
<li>Juhl, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+membrane+contact+sites+for+sterol+transfer+between+endo-lysosomes+and+mitochondria+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells.</a> Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).</li>
<li>Khalil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+pathway+for+erythroid+iron+delivery+through+lysosomal+trafficking+of+transferrin+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2.</a> Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).</li>
<li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+%28clem%29+combining+live-cell+imaging+and+immunolabeling+of+ultrathin+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections.</a> Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).</li>
<li>Loginov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+organelle+microscopy%3A+Fluorescence+guided+volume+electron+microscopy+of+intracellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).</li>
<li>De Beer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+tissues%3A+A+multiscale+workflow+from+live+imaging+to+3D+cryo-CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meosem+withstands+osmium+staining+and+epon+embedding+for+super-resolution+clem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li>
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<li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biol. 11, 73-81 (2017).</li>
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<li>Jung, M., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+imaging+by+correlative+light+and+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy.</a> J Vis Exp. (149), e59750(2019).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo descreve o CLEM de duas cores para observar a interação de mitocôndrias e lisossomos em células fixas usando tags mEosEM e APEX2 geneticamente codificadas. Nas últimas décadas, os avanços na microscopia melhoraram muito a capacidade de observar mudanças nas redes de organelas 32,33, e o estudo das interações de organelas tornou-se cada vez mais interessante. A microscopia de super-resolução tem sido usada para observar mudanças nos contatos altamente dinâmicos entre mitocôndrias e lisossomos34 , 35 , 36 . No entanto, apesar do uso da microscopia de super-resolução, é difícil distinguir alterações na espessura das membranas mitocondriais interna e externa (aproximadamente 22 nm) e nas junções das cristas (aproximadamente 28 nm)37. A microscopia eletrônica de transmissão tem a vantagem de poder observar a estrutura de amostras biológicas em altíssima resolução, mas tem a desvantagem de que as imagens só podem ser visualizadas em preto e branco, dificultando a distinção de organelas em imagens complexas. Em nosso protocolo, usamos um método CLEM que combina as vantagens da microscopia de luz e eletrônica para monitorar a interação de duas organelas diferentes, colorindo-as com cores diferentes. Em particular, o CLEM de duas cores é uma ferramenta inestimável para observar e analisar a mitofagia, o processo de degradação mitocondrial dentro dos lisossomos, conforme mostrado na Figura 3.
A imagem de células vivas é normalmente realizada em condições fisiológicas, permitindo que os pesquisadores observem os processos celulares dinâmicos em tempo real. No entanto, as técnicas de microscopia eletrônica geralmente requerem procedimentos demorados de preparação de amostras, incluindo fixação e coloração. O atraso de tempo entre a imagem de células vivas e a preparação da amostra de microscopia eletrônica limita a resolução temporal da técnica e pode resultar em eventos celulares dinâmicos potencialmente perdidos. Para superar a limitação do CLEM de células vivas, desenvolvemos um método CLEM de duas cores no qual a sonda mEosEM23 e o corante químico (Amplex-Red) são corados pela enzima de marcação de proximidade APEX238 sem perder o sinal de fluorescência mesmo em ambientes fixadores agressivos. Em um estudo CLEM anterior de células vivas39, foram encontradas discrepâncias entre os sinais de fluorescência e as imagens EM devido a problemas de resolução temporal na amostragem de TEM após imagens de células vivas e limitações técnicas na preparação da amostra. No entanto, ao adquirir imagens de fluorescência de células fixas por um tempo suficiente (imagem z-stack de células inteiras em alta ampliação), podemos resolver o problema de resolução temporal e melhorar a correlação entre as imagens LM e EM (Figura 3 e Figura 4).
Outro fator chave para resultados CLEM bem-sucedidos é como registrar com precisão a imagem LM com a imagem EM. Para fazer isso, primeiro usamos uma combinação de modos de imagem DIC e fluorescência durante a imagem de microscopia de luz para criar um mapa de navegação ao redor das células-alvo. Usando este mapa de navegação, pudemos identificar facilmente as células de interesse no ultramicrótomo e no TEM. Em segundo lugar, ao adquirir imagens TEM de células inteiras em alta ampliação, conseguimos obter muitos pontos de referência que poderiam ser usados para registro de imagens. Em nossa experiência, quanto maior o número de pontos de referência, melhor a precisão do alinhamento das imagens LM e EM no plug-in Big Warp.
Neste estudo, mostramos os domínios de interação de lisossomos e mitocôndrias com resultados de CLEM de alta resolução. Além disso, a sonda de duas cores permitiu uma distinção precisa entre mitocôndrias e lisossomos. No entanto, esse método tem algumas limitações. Primeiro, se o tempo de reação durante a marcação proximal do Amplex-Red pela enzima APEX2 for muito longo, o Amplex-Red se difundirá e se coará mais do que o local da proteína alvo38. Em segundo lugar, a espessura (volume do eixo z) da área onde o lisossomo está engolfado na mitocôndria é muito pequena, de modo que a fusão das duas membranas de organelas não pode ser determinada em uma seção serial de 50 nm de espessura. Além disso, é um desafio significativo alinhar com precisão o eixo z de uma seção óptica por microscópio óptico e uma seção mecânica por ultramicrótomo. Para superar essas limitações, o CLEM de duas cores pode ser usado em combinação com a tomografia eletrônica convencional40 ou o volume de seção serial-CLEM41.

As mitocôndrias e os lisossomos são as principais organelas ligadas à membrana que são essenciais para a manutenção da homeostase celular. As mitocôndrias são organelas celulares altamente dinâmicas moduladas por eventos de fissão e fusão1. Em geral, as mitocôndrias são referidas como a força motriz da célula e são conhecidas por seu importante papel na fosforilação oxidativa, produção de ATP e armazenamento de metabólitos, como cálcio2. Além de seu papel no metabolismo energético, as mitocôndrias estão envolvidas em vários outros processos de sinalização celular, incluindo apoptose3,4, sinalização de cálcio5,6 e metabolismo lipídico7,8. Da mesma forma, os lisossomos são organelas celulares altamente dinâmicas que desempenham vários papéis como centros de reciclagem celular para manter a limpeza celular por meio da degradação de proteínas, autofagia, endocitose e fagocitose9. Além de seu papel na degradação, os lisossomos também desempenham papéis na fisiologia celular, como detecção de nutrientes, homeostase10, metabolismo lipídico11 e desdiferenciação celular12.
Apesar da existência de numerosos estudos sobre as funções de organelas celulares individuais, nossa pesquisa recente concentrou-se na interferência menos compreendida entre mitocôndrias e lisossomos, que demonstrou influenciar tanto a fisiologia celular quanto a patologia. Contatos entre mitocôndrias e lisossomos foram observados em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas, neurônios e células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)13, e são observados principalmente sob estresse celular ou em doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson13,14 e doença de Charcot-Marie-Tooth15. O contato entre mitocôndrias e lisossomos desempenha um papel importante na manutenção da homeostase metabólica por meio da troca de íons (por exemplo, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 entre as duas organelas. Além disso, o contato entre mitocôndrias e lisossomos desempenha um papel crucial no controle de qualidade das organelas celulares. Por exemplo, as mitocôndrias danificadas podem ser alvo de degradação por meio do processo de mitofagia, no qual são engolidas por autofagossomos e entregues aos lisossomos para degradação. Consequentemente, a remoção de mitocôndrias disfuncionais pode ser facilitada antes que causem mais danos à célula ou às mitocôndrias normais. Essa interação entre mitocôndrias e lisossomos é crucial para manter a homeostase celular e prevenir o acúmulo de organelas disfuncionais. Assim, apenas as mitocôndrias danificadas são removidas seletivamente, permitindo que as mitocôndrias saudáveis funcionem de maneira ideal dentro da célula.
A microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM) é uma técnica de imagem que recentemente recebeu atenção como método de pesquisa, combinando as vantagens da microscopia de luz (LM) e da microscopia eletrônica (EM) para fornecer informações estruturais detalhadas em diferentes escalas. No CLEM, uma amostra é primeiro fotografada usando LM para identificar regiões específicas de interesse, seguida por etapas de preparação de amostra EM, como fixação, desidratação e incorporação. A mesma amostra é então observada em um microscópio eletrônico. Embora os métodos CLEM de células vivas tenham sido relatados recentemente19,20,21,22, continua sendo um desafio combinar com precisão imagens ópticas de amostras biológicas altamente dinâmicas com imagens de microscopia eletrônica de células fixas em um único plano. Para organelas altamente dinâmicas, como mitocôndrias e lisossomos, sua localização precisa pode mudar à medida que são observadas ao vivo sob o microscópio óptico e continuam a se mover mesmo durante o curto tempo de atraso necessário para a fixação.
Portanto, neste protocolo, duas marcas moleculares diferentes que permanecem ativas mesmo dentro de soluções fixadoras foram empregadas para visualizar a interação entre mitocôndrias e lisossomos, que desempenham um papel importante na manutenção da homeostase metabólica por meio da troca de íons (por exemplo, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 entre essas organelas. Os construtos TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM foram usados para observar as interações de mitocôndrias e lisossomos em células cultivadas nos níveis EM e LM. Para mitocôndrias, a tag mEosEM foi selecionada por sua capacidade de preservar o sinal de fluorescência durante a preparação da amostra EM em uma solução fixadora e OsO423. Para lisossomos, a tag APEX2, uma proteína de aproximadamente 28 kDa, foi usada para estudar a localização de uma proteína específica nos níveis EM e LM24. Na presença de peróxido de hidrogênio, o substrato do APEX2, Amplex-Red, forma um polímero insolúvel que pode ser observado por microscopia confocal no local alvo da etiqueta. Neste protocolo, o CLEM de duas cores foi usado para visualizar a estrutura das interações entre lisossomos e mitocôndrias em células fixas.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos e reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>25% de <td>Microscopia Eletrônica</td> <td>de Glutaraldeído</td> Ciências <td>16200</td> Os <td>vapores de aldeído são extremamente tóxicos. Utilizar apenas em hottes.</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio a 30%</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído a 4%</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-100-00</td><td>Os vapores de ldeído são extremamente tóxicos. Utilizar apenas em hottes.</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>ThermoFisher</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Transfecção de plasmídeo</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo 3%</td> <td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>22410</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio 4% solução aquosa</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>16320</td><td>Muito tóxico. Utilizar apenas em hottes.</td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sódio trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>UranyLess EM mancha</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>22409</td><td></td></tr><tr><td>Construção de plasmídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito-mEosEM</td><td>addgene</td><td>132706</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>TMEM192-V5-APEX2</td><td>Sharma N.&nbsp; et al.</td><td>N/A</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 um filtro de seringa</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Prato de lamínula grelhado</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>BEEM Cápsulas de incorporação</td><td>Ted Pella</td><td>130</td><td></td></tr><tr><td>Formvar suportado Grade de cobre de slot único</td><td>Ted Pella</td><td>01705</td><td></td></tr><tr><td>Faca de</td><td>diamante DiATOME</td><td>DU4530</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-micrótomo</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscopia confocal</td><td>Nikon</td><td>A1 Rsi/Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>Software e Algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/Image J</td><td>NIH / pacote de</td> software <td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> ImageJ BigWarp de código <td></td></tr><tr><td></td><td>aberto NIH / https://imagej.net/plugins/bigwarp de código</td><td></td><td></td>aberto</tr><tr><td>Photozoom Pro 8&nbsp;</td><td>BenVista</td><td></td><td>https://www.benvista.com/photozoompro Software alternativo Image Resizer : https://imageresizer.com/ Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel ON1 redimensionar : https://www.on1.com/products/resize-ai/</td></tr></tbody></table>

microscopia eletrônica e de luz correlativa de duas cores para a visualização de interações entre mitocôndrias e lisossomos

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Organelas celulares, como mitocôndrias e lisossomos, exibem estruturas dinâmicas. Apesar da maior resolução da microscopia eletrônica de transmissão para análise estrutural, a microscopia de luz é essencial para a visualização de organelas dinâmicas por marcação alvo-específica. O protocolo a seguir descreve um método que combina luz correlativa de duas cores e microscopia eletrônica (CLEM) para observar as interações entre mitocôndrias e lisossomos. Neste estudo, as mitocôndrias foram marcadas com mEosEM (Mito-mEosEM) e os lisossomos com TMEM192-V5-APEX2. Os resultados obtidos a partir de imagens CLEM nos permitem observar as mudanças nas interações entre mitocôndrias e lisossomos sob condições de estresse externo. O tratamento com bafilomicina (BFA), que inibe a função lisossômica, resultou em um aumento no contato entre as mitocôndrias e os lisossomos, levando à formação de mitocôndrias fragmentadas presas dentro dos lisossomos. Por outro lado, o tratamento com U18666A, que inibe a exportação de colesterol dos lisossomos, fez com que os lisossomos fossem cercados por mitocôndrias, indicando uma forma distinta de interação. Este estudo apresenta um método eficaz para observar as interações entre mitocôndrias e lisossomos em células fixas. Além disso, a imagem CLEM com sondas de duas cores oferece uma ferramenta poderosa para futuras investigações da dinâmica das organelas e suas implicações para a função e patologia celular.

Para visualizar as interações entre mitocôndrias e lisossomos usando este protocolo de CLEM de dupla cor, empregamos Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2. Primeiramente, células fixadas foram analisadas usando um microscópio óptico, seguido de amostragem e imagem em microscopia eletrônica. Os resultados das imagens correlacionadas são mostrados na Figura 3A,B e na Figura 4A. Após seguir o protocolo descrito acima, verificamos se poderíamos observar alterações na interação entre mitocôndrias e lisossomos sob estresse externo.
O tratamento de células com BFA, um inibidor da V-ATPase lisossômica, inibe a autofagia, resultando em redução da qualidade mitocondrial e aumento das interações entre mitocôndrias e lisossomos27. Em células tratadas com BFA, observamos mitocôndrias aprisionadas dentro de lisossomos (Figura 3B), em comparação com células-controle tratadas com DMSO (Figura 3A). Embora seja difícil distinguir mitocôndrias fragmentadas e densas eletronicamente e compartimentos celulares dentro de lisossomos apenas em micrografias eletrônicas, eles podem ser facilmente diferenciados em imagens correlacionadas (Figura 3B1,B2). A estrutura de perturbação mitocondrial (Figura 3A1,A2; seta azul) observada nas mitocôndrias de células tratadas com DMSO não está relacionada aos lisossomos, e a estrutura na imagem de fluorescência que parece ser um lisossomo aprisionado dentro de uma grande mitocôndria é na verdade uma estrutura onde a mitocôndria envolve o lisossomo (Figura 3A2; seta vermelha).
Em seguida, testamos os efeitos do U18666A (2 µg/mL por 18 h), um inibidor bem conhecido da NPC1 que bloqueia o movimento do colesterol para fora dos lisossomos28. Células tratadas com U18666A mostraram aumento da interação direta entre mitocôndrias e lisossomos (Figura 4). Além disso, os contatos entre mitocôndrias e lisossomos em amostras tratadas com U18666A diferiam daqueles em amostras tratadas com BFA. Em células HeLa tratadas com BFA, a mitocôndria fragmentada está completamente aprisionada no lisossomo, uma morfologia de mitofagia previamente descrita12,29. No entanto, no grupo tratado com U18666A, alguns lisossomos positivos para TMEM192 parecem ser englobados pela mitocôndria (Figura 4D,E)30,31.
<img alt="Fluxo de preparação e imagem celular: transfeção, marcação com APEX2, microscopia confocal, configuração de análise em MET." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visão esquemática do CLEM baseado em MET utilizando uma sonda fluorescente com marcação genética. (A) Células HeLa foram cultivadas em placas de cultura com fundo de grade de vidro de 35 mm. (B) Células fixadas foram marcadas com Amplex-Red pela proteína APEX2. (C) Imagens de fluorescência foram obtidas com um microscópio confocal. Um estágio motorizado e a função de varredura em mosaico foram utilizados para capturar uma imagem panorâmica ampla e uma imagem de alta resolução da célula-alvo. A imagem ampla serve como um mapa de navegação para identificar a localização da célula-alvo em espécimes embutidos em plástico. (D) Prossiga com a pós-fixação e o embutimento com desidratação. (E) O embutimento foi realizado utilizando um tubo de PCR ou cápsula BEEM preenchido com resina sobre a célula-alvo na lamínula. (F) Após a polimerização da resina, a remoção da lamínula deixou um padrão de grade impresso na superfície inferior do bloco. (G) A célula-alvo foi identificada pelo padrão impresso na superfície da resina, e a célula-alvo foi seccionada com espessura aproximada de 60 nm utilizando um ultramicrotomo. (H) Secções seriadas foram coletadas em grades de cobre com suporte recoberto com formvar. (I) As grades foram analisadas por microscopia eletrônica de transmissão. Abreviações: TEM = microscopia eletrônica de transmissão; CLEM = microscopia correlativa de luz e elétrons; ROI = região de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de processamento de imagem: montagem de imagens, redimensionamento de fluorescência, registro por pontos de referência, sobreposição de CLEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Processamento de imagem e geração da imagem CLEM usando o ImageJ Fiji. (A1) Interface gráfica principal do Fiji e do TrakEM2. (A2) Importação do conjunto de dados de imagens em mosaico adquirido com MET na ampliação de 1.700x. (A3) Alinhamento e exemplo de uma imagem montada utilizando o método de alinhamento de imagens do TrakEM2. (B1-B2) Conversão de uma micrografia óptica pequena em imagens grandes de alta qualidade usando software de ampliação fotográfica. (C1-C3) Fluxo de trabalho para o registro entre imagens de microscopia óptica e imagens de microscopia eletrônica utilizando o software do plug-in Big Wrap. (D1-D3) O processo de sobreposição de uma imagem de FM transformada e uma imagem de EM para sintetizar uma imagem de microscopia correlacionada. Abreviaturas: TEM = microscopia eletrônica de transmissão; CLEM = microscopia correlacionada de luz e elétrons; FM = microscopia de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de CLEM, microscopia confocal e TEM; localização de mitocôndrias e lisossomos; análise de estrutura celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Imagens de MCLE dos sítios de contato mitocondrial e lisossomal tratados ou não com bafilomicina A1. Células HeLa foram cotransfectadas com Mito-mEosEM (mitocôndrias; verde) e TMEM192-APEX2 (lisossomos; vermelho) e, em seguida, coradas com corante Amplex-Red. (A) Células HeLa não tratadas. As informações moleculares provenientes do sinal de fluorescência (painel esquerdo) e as informações ultraestruturais obtidas por MET (painel central) foram sobrepostas (painel direito) com base no sinal e na morfologia mitocondrial. (A1,A2) Em células HeLa não tratadas, a membrana interna mitocondrial está rompida (seta azul), ou as mitocôndrias e os lisossomos estão muito próximos um do outro (seta vermelha). (B1,B2) Em células HeLa tratadas com bafilomicina A1 por 18 h, observou-se mitofagia, caracterizada pelo aprisionamento de mitocôndrias não degradadas nos lisossomos (seta verde). Barras de escala = 1 µm (A1,A2,B1,B2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagens de microscopia confocal, MET e CLEM de mitocôndrias (verde) e lisossomos (vermelho) em células." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imagens de CLEM dos sítios de contato mitocondrial e lisossomal tratados com U18666A (A) Imagens de CLEM de duas cores de células HeLa expressando Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2 (marcado com Amplex-Red) submetidas ao tratamento com U18666A (2 µg/mL por 18 h). (A1,A2) Setas vermelhas indicam sítios de contato entre mitocôndrias e lisossomos. Barras de escala = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) A seta vermelha indica a presença de fusão entre organelas, observada em imagens seriadas. Barras de escala = 500 nm (B1-B3). Barras de escala = 1 µm (C1-C3). (D,E) Imagens de MET em alta magnificação dos sítios de fusão entre mitocôndrias e lisossomos. Cores falsas são utilizadas para distinguir a mitocôndria (verde) do lisossomo (vermelho). Barras de escala = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um mecanismo para usar microscopia de luz e eletrônica correlativa para visualizar a interação de mitocôndrias e lisossomos marcados com mEosEM e APEX2, respectivamente.

Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...

dual-color-correlative-light-electron-microscopy-for-visualization

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Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

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Visualizando a mitofagia com corantes fluorescentes para mitocôndrias e lisossomos

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y cultivadas e neurônios primários do hipocampo de ratos para visualização e análise da ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção de emissão estimulada (STED).

Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

Aprenda a utilizar microscopia correlativa de luz e eletrônica de duas cores para visualizar interações entre mitocôndrias e lisossomos em células HeLa. Este método avança estratégias terapêuticas para doenças neurodegenerativas.

Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

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