Combinando imagem e eletrofisiologia para visualizar e registrar despolarizações de propagação em camundongos

O escopo de nossa pesquisa é entender a relação entre despolarizações disseminadas e lesões cerebrais traumáticas leves usando modelos cerebrais. Nosso grupo e outros mostraram recentemente que as despolarizações disseminadas ocorrem em lesões leves de crânio fechado em camundongos. Os amplificadores de eletrofisiologia in vivo comumente usados filtram as lentas mudanças extracelulares associadas às despolarizações de propagação, tornando quase impossível detectar a despolarização de propagação.

A vantagem deste protocolo é alavancar tanto a imagem quanto a eletrofisiologia in vivo para confirmar a ausência ou presença de despolarizações disseminadas após uma lesão cerebral traumática leve. Começamos a entender o papel da disseminação de despolarizações no comportamento agudo, patologia e déficits cognitivos de longo prazo associados aos MTBIs. Para começar, coloque o animal anestesiado em uma estrutura estereotáxica e mantenha a temperatura corporal do animal usando uma almofada de aquecimento.

Usando uma lâmina de bisturi número 10, faça uma incisão ao longo da linha média de rostral para caudal. E aplique imediatamente cola de cianoacrilato na incisão. Em seguida, espalhe a pele lateralmente para expor o crânio.

Adicione uma ou duas gotas adicionais de cola de cianoacrilato sobre o crânio para fornecer proteção extra. Enquanto a cola está secando, use uma tesoura cirúrgica estéril para aumentar o tamanho da incisão sobre o cerebelo. Em seguida, usando uma broca de 0,8 milímetros, faça furos piloto no crânio e gire os parafusos no crânio.

Enrole o excesso de fio ao redor do parafuso, permitindo alguma folga para a colocação do cabeçote mais tarde. Depois que todos os parafusos de caveira estiverem no lugar, conecte todos os pinos dourados no conector do estágio de cabeça desejado. Segurando o conector no lugar com o braço estereotáxico, posicione os pinos do conector logo acima das cabeças dos parafusos sem contato com o fio.

Sele toda a área com cola de cianoacrilato, garantindo que a área de imagem na frente dos parafusos do crânio não seja perturbada. Construa cimento dental ao redor da base dos pinos de ouro, garantindo que os pinos de ouro dos parafusos do crânio não estejam conectados aos do estágio principal. Deixe o cimento dental curar antes de remover o conector do estágio principal.

Para começar, ligue o computador IOS e a placa do painel de LED. Monte o animal anestesiado implantado com eletrodo em uma cama de impacto embaixo da câmera. E ajuste o anel de foco para cobrir a superfície cortical.

Depois de carregar o sinal óptico intrínseco ou as configurações do IOS, pressione o botão Live para visualizar o mouse e centralizar o crânio do animal sob a câmera. Em seguida, pressione Multi-D Acquisition para acessar as configurações de aquisição e selecione os pontos de tempo desejados. Salve as imagens no caminho do arquivo designado com o prefixo de nome apropriado.

Conecte os pinos dourados do animal ao conector do estágio principal e, em seguida, ao estágio principal. Ligue o computador de eletrofisiologia e conecte-o ao equipamento de eletrofisiologia. Depois de carregar as configurações do software Intan, clique no ícone Escolher formato de arquivo e, na janela pop-up, selecione Um arquivo por formato de tipo de sinal.

Em seguida, na guia BW em Largura de banda de hardware, selecione a largura de banda do amplificador de 0,13 a 500 hertz. Selecione Amplo em Seletor de exibição de filtro. Depois de definir os filtros passa-baixa e alta, clique no ícone Selecionar nome do arquivo para selecionar o caminho do arquivo desejado para salvar.

Para o impacto, ligue o impactor eletromagnético e mova a alavanca para verificar se a ponta se retrai e se estende corretamente. Coloque rapidamente o animal em uma cama de espuma e deslize a cama sob a ponta do impactor. Alinhar a ponta do impactor com a linha média e posicioná-la a um milímetro rostral de bregma.

Em seguida, abaixe a ponta do impactor até que ela toque firmemente o topo da cabeça do animal. Empurre a alavanca para retrair a ponta do impactor e, em seguida, abaixe-a manualmente em cinco milímetros antes de ativar a alavanca de impacto. Remova imediatamente o animal da cama de espuma e coloque-o embaixo da câmera para obter imagens em cinco segundos.

Clique em Adquirir para iniciar a imagem do IOS na janela Aquisição multidimensional. Capture imagens por quatro minutos para registrar todo o evento de despolarização de propagação. Para iniciar a gravação de eletrofisiologia, clique no ícone Gravar no software Intan.

Após a conclusão da gravação, desconecte o animal do estágio principal e do conector e coloque-o de volta em sua gaiola. Para abrir a pilha de imagens, clique em Arquivo, seguido de Importar e Sequência de Imagens. Desenhe um quadrado usando o cursor, definindo a região de interesse, para gerar o gráfico da despolarização de propagação.

Navegue até Imagem, seguido por Pilhas e Plotar perfil do eixo Z para plotar o gráfico e clique no botão Ao vivo. No gráfico gerado, clique em Lista para gerar uma lista de valores. Para visualização, converta a imagem em tons de cinza com uma tabela de pesquisa de incêndio.

Despolarizações espalhadas foram observadas se propagando pelo córtex e grandes vasos sanguíneos pela janela. A atividade de alta frequência nos registros eletrofisiológicos mostrou um rápido retorno em animais simulados após a remoção do isoflurano. Mas em animais despolarizados, a atividade de alta frequência permaneceu suprimida por vários minutos antes da recuperação.

Os gráficos de potência demonstraram um claro aumento de potência após a recuperação da supressão em ambas as condições.