Name: Extração assistida por micro-ondas de compostos fenólicos e antioxidantes para aplicações cosméticas usando tecnologia baseada em poliol (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a extrair compostos fenólicos e antioxidantes de forma sustentável usando extração assistida por micro-ondas com solventes à base de poliol para aplicações cosméticas. Este método ecológico oferece maior eficiência e segurança.

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Este estudo foi financiado pela Universidade Mae Fah Luang. Os autores gostariam de agradecer ao Instituto de Chá e Café da Universidade Mae Fah Luang por facilitar a conexão entre os pesquisadores e os agricultores locais em relação à aquisição de amostras de casca de prata de café.

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação experimental
<ol><li>Preparação de amostras de plantas<ol><li>Recolher o café fresco (Coffea arabica) e secá-lo a 60 °C num secador de tabuleiros durante 72 h11.</li>
		<li>Moa a casca de prata do café seco (CS) em um pó fino usando um moedor e armazene-o em temperatura ambiente para análise posterior11. NOTA: Neste estudo, CS fresco (C. arabica) foi coletado em Baan Doi Chang, distrito de Mae Suai, Chiang Rai, Tailândia. O CS é um subproduto obtido durante o processo de descasque que remove a camada de pergaminho dos grãos de café secos após o processamento das cerejas para remover as camadas externas do fruto16.</li>
	</ol></li>
	<li>Produtos químicos<ol><li>Utilizar reagentes químicos de qualidade analítica, com excepção dos solventes do ensaio. NOTA: Solventes de grau cosmético foram usados no experimento.</li>
		<li>Use os solventes (água, etanol, glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, hexilenoglicol, isopentildiol, 1-2 hexanodiol, pentilenoglicol e metilpropanodiol) para a extração de CS com MAE.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Processo de extração
<ol><li>Preparação de amostras e solventes<ol><li>Preparar a amostra e os solventes para o procedimento MAE de acordo com um protocolo previamente relatado9 com algumas modificações.</li>
		<li>Prepare cada solvente na concentração de 60% diluindo 60 mL de cada solvente com água destilada e ajustando o volume para 100 mL para extrações triplicadas. NOTA: Use água 100% destilada para extração de água.</li>
		<li>Pesar 0,67 g de CS e misturar com 20 ml de cada solvente de extracção na proporção de 1:30 num recipiente de reacção (figura 1A) para MAE. NOTA: A quantidade máxima de sólido-líquido para cada recipiente é de 2 g de amostra e 20 mL de solvente.</li>
		<li>Adicione uma barra agitadora magnética a cada recipiente para garantir uma distribuição uniforme do calor e do solvente dentro da amostra, aumentando a eficiência do processo de extração e promovendo um melhor rendimento de extração. NOTA: Se solventes apolares forem aplicados ao processo de extração, as barras agitadoras de Teflon podem ser usadas em vez das barras agitadoras magnéticas para fornecer aquecimento eficaz através do sistema de micro-ondas.</li>
		<li>Feche cada vaso firmemente com uma ferramenta especial (Figura 2) e coloque todos os vasos na câmara MAE (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Configurando o instrumento e o procedimento de extração assistida por micro-ondas<ol><li>Execute o procedimento de extração de acordo com o protocolo de referência com algumas modificações9.</li>
		<li>Abra a tela do monitor para configurar o método clicando no ícone da caixa de ferramentas na barra superior e selecionando o rotor SK eT na seção de acessórios (Figura 3A,B).</li>
		<li>Selecione a taxa de agitação das barras do agitador clicando na seção do agitador e digitando 20% (Figura 4A). NOTA: A taxa de agitação pode ser selecionada de 0% a 100%.</li>
		<li>Clique no setor da fechadura da porta e configure-o para ativar em temperaturas superiores a 80 °C (Figura 4B). NOTA: Esta configuração garante o fechamento automático da porta da câmara quando a temperatura interna ultrapassa 80 °C.</li>
		<li>Clique no ícone da tabela na barra superior (Figura 5A) e defina o gradiente de temperatura (T1) para uma duração de extração de 10 min, a potência de micro-ondas para 1800 W e a temperatura para 120 °C.</li>
		<li>Ative o agitador clicando no botão do agitador até que a luz verde apareça.</li>
		<li>Defina a velocidade do ventilador para o nível 3 (máximo) (Figura 5B).</li>
		<li>Para manter o tempo de extração, selecione a temperatura de extração desejada (T2) definindo a duração da extração para 15 min, a potência de micro-ondas para 1800 W e a temperatura para 120 °C.</li>
		<li>Defina o agitador e a velocidade do ventilador conforme indicado nas seções 2.2.6 e 2.2.7 (Figura 5A,B). NOTA: A temperatura máxima e a potência de microondas são de 260 °C e 1800 W.</li>
		<li>Defina o tempo de resfriamento clicando no botão de resfriamento no canto inferior esquerdo da tela e selecionando a duração de 10 min (Figura 6).</li>
		<li>Salve o método clicando no ícone salvar no canto superior direito da tela (Figura 7A).</li>
		<li>Certifique-se de que, após salvar as condições do método, o gráfico de condições de extração seja exibido na tela com o botão play no canto inferior direito (Figura 7B).</li>
		<li>Inicie o processo de extração escolhendo o número de recipientes usados (Figura 7C). NOTA: Até 15 recipientes podem ser usados em uma extração e, se o número desejado de recipientes for utilizado, certifique-se de que os recipientes sejam colocados de forma equilibrada na câmara.</li>
		<li>Após a extração, centrifugar os extratos a 4 °C, 9072 x g, por 15 min, usando uma centrífuga refrigerada.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante com uma pipeta de vidro de 10 ml (figura 8) e conservá-lo a -20 °C no congelador para um estudo mais aprofundado. NOTA: Dependendo do tamanho da partícula e da densidade do resíduo vegetal, os extratos exigirão tempos de centrifugação mais longos (20-30 min).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Determinação dos compostos fenólicos
<ol><li>Determinação do teor de fenólicos totais<ol><li>Determinar o conteúdo fenólico total dos extratos de CS referenciando o protocolo com algumas modificações17.</li>
		<li>Preparar uma diluição de 10 vezes das amostras diluindo com água destilada.</li>
		<li>Misturar 10 μL da amostra diluída com 20 μl de reagente de Folin-Ciocalteu não diluído e deixá-los reagir durante 3 min.</li>
		<li>Em seguida, adicione 100 μL de solução de 7,5% de Na2CO3 à mistura em cada poço de uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Preparar diferentes concentrações para a gama de concentração padrão de ácido gálico (ver Quadro 1 e Quadro 2) diluindo com água destilada.</li>
		<li>Misture-os com 20 μL de reagente de Folin-Ciocalteu e deixe-os reagir por 3 min.</li>
		<li>Em seguida, adicione 100 μL de solução de 7,5% de Na2CO3 à mistura em cada poço de uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Incube a reação por 30 min no escuro em temperatura ambiente.</li>
		<li>Medir a absorvância da solução de reacção a 765 nm utilizando um leitor de microplacas (figura 9A).</li>
		<li>Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 765 nm (figura 10A).</li>
		<li>Exprimir os resultados em mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de amostra e calcular utilizando a seguinte equação18: NOTA: mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de amostra = [((A765 - c) / m)) em μg equivalente de ácido gálico × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada em cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)] onde, c = interceptação y, m = inclinação</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação do teor de flavonóides totais<ol><li>Determinar o teor total de flavonóides do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações17.</li>
		<li>Preparar uma diluição de 5 vezes das amostras diluindo com água destilada.</li>
		<li>Adicione 50 μL da amostra diluída a 15 μL de NaNO2 a 5% e incube no escuro por 5 min.</li>
		<li>Misture 15 μL de solução de AlCl3 a 10% com a reação e mantenha-a em temperatura ambiente por 6 min.</li>
		<li>Em seguida, adicione 100 μL de solução de NaOH 1 M à reação e incube por mais 10 minutos.</li>
		<li>Medir a absorvância da mistura a 510 nm (figura 9B).</li>
		<li>Prepare diferentes concentrações de quercetina na faixa padrão (consulte as Tabelas 3 e 4) adicionando-as a 15 μL de NaNO2 a 5% e incubando no escuro por 5 min.</li>
		<li>Misture 15 μL de solução de AlCl3 a 10% com a reação e mantenha em temperatura ambiente por 6 min.</li>
		<li>Adicione 100 μL de solução de NaOH 1 M à reação e incube por mais 10 min.</li>
		<li>Determinar a absorvância do padrão a 510 nm (figura 9B).</li>
		<li>Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 510 nm (figura 10B).</li>
		<li>Exprimir os resultados em mg de equivalente de quercetina (QE) por g de amostra, calculados pela equação19 do seguinte modo: NOTA: mg de equivalente de quercetina (QE) por g de amostra = [((A510 - c) / m)) em μg equivalente de quercetina × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)] onde, c = interceptação y, m = inclinação</li>
	</ol></li>
</ol>4. Determinação das atividades antioxidantes
<ol><li>Ensaio de eliminação de radicais 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH)<ol><li>Determine a atividade de eliminação do radical DPPH do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações17.</li>
		<li>Preparar uma diluição de 10 vezes das amostras, diluindo-as com água destilada.</li>
		<li>Misture 20 μL das amostras diluídas com 135 μL de solução de DPPH 0,1 mM.</li>
		<li>Prepare diferentes concentrações da faixa de concentração padrão Trolox (consulte as Tabelas 5 e 6) misturando com 135 μL de solução de DPPH 0,1 mM.</li>
		<li>Incube a mistura no escuro em temperatura ambiente por 30 min.</li>
		<li>Medir a absorvância da resultante a 517 nm (figura 9C).</li>
		<li>Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e % de inibição (figura 10C).</li>
		<li>Calcular a % de inibição do ensaio DPPH do seguinte modo: % Inibição = [(absorbância de controle − absorbância da amostra)/ absorbância de controle] × 100</li>
		<li>Exprimir os resultados em mg da capacidade antioxidante equivalente de Trolox por g de amostra, calculada pela seguinte equação20: NOTA: mg de equivalente de Trolox (TE) por g de amostra = [((% de inibição-c) / m) em μg de equivalente de Trolox × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada em cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)] onde, c = interceptação y, m = inclinação</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de eliminação de radicais do ácido 2,2′-Azino-Bis-3-Etilbenztiazolina-6-sulfônico (ABTS)<ol><li>Determine a atividade de eliminação do radical ABTS do extrato de CS usando o protocolo da referência com algumas modificações17.</li>
		<li>Prepare a solução de estoque ABTS·+ misturando 7 mM de ABTS e 2,45 mM de persulfato de potássio (1:2) e incube no escuro à temperatura ambiente por 16 h.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho misturando 5 mL de solução estoque ABTS·+ com 100 mL de água deionizada.</li>
		<li>Misture 160 μL de solução de trabalho ABTS·+ com 10 μL da amostra diluída a 10 vezes ou padrão Trolox em diferentes concentrações (ver Tabela 7 e Tabela 8).</li>
		<li>Incube a reação no escuro em temperatura ambiente por 30 min.</li>
		<li>Determinar a absorvância da mistura a 734 nm (figura 9D).</li>
		<li>Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e % de inibição (figura 10D).</li>
		<li>Calcular % de inibição do ensaio ABTS utilizando a seguinte fórmula: % Inibição = [(absorbância de controle - absorbância da amostra) / absorbância de controle] × 100.<ol><li>Exprimir os resultados em mg da capacidade antioxidante equivalente de Trolox por g de amostra, calculada utilizando a seguinte equação21: NOTA: mg de equivalente trolox (TE) por g de amostra = [((% de inibição - c) / m)] em μg equivalente Trolox × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)] onde, c = interceptação y, m = inclinação</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de Poder Antioxidante Redutor Férrico (FRAP)<ol><li>Determinar a atividade antioxidante redutora de férrico do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações17.</li>
		<li>Prepare o reagente FRAP usando um tampão de acetato de 30 mM em pH 3,6, que é uma mistura de solução de TPTZ 10 mM em HCl 40 mM e solução de FeCl3,6H 2O 20 mM na proporção de 10:1:1.</li>
		<li>Coloque o reagente FRAP em um frasco âmbar até que seja necessário. NOTA: Certifique-se de que o reagente FRAP esteja marrom. Se contaminado por íons metálicos ou outros compostos reativos, o reagente ficará roxo e deve ser descartado. Use apenas reagentes recém-preparados.</li>
		<li>Preparar uma diluição de 5 vezes das amostras, diluindo-as com água destilada.</li>
		<li>Adicionar 10 μL da amostra diluída ou 20 μL de FeSO4,7H 2O em diferentes concentrações padrão (Tabela 9 e Tabela 10) a 180 μL da solução FRAP.</li>
		<li>Incubar a reação à temperatura ambiente durante 4 min.</li>
		<li>Avaliar a absorvância da mistura a 593 nm (figura 9E).</li>
		<li>Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 593 nm (figura 10E).</li>
		<li>Exprimir os resultados em mg de FeSO4 por g de amostra, calculados utilizando a seguinte equação21: NOTA: mg de equivalente a FeSO4 [Fe (II) E) por g de amostra = [((A593 - c) / m)] em μg equivalente a FeSO4 × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)] onde, c = interceptação y, m = inclinação</li>
	</ol></li>
	<li>Realize todos os ensaios (TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP) de cada amostra em triplicata. Neste estudo, a água foi usada como branco para a maioria dos ensaios, exceto DPPH, onde o etanol serviu como branco para abordar a absorbância de fundo.</li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Use o software SPSS para realizar uma análise estatística dos dados experimentais.</li>
	<li>Realize o teste de normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk.</li>
	<li>Compare as substâncias bioativas e as atividades antioxidantes do extrato de MAE CS à base de polióis e extratos de MAE CS à base de solventes convencionais usando ANOVA unidirecional com os testes de intervalo múltiplo de Duncan.</li>
	<li>Expresse todos os dados como média ± DP (n = 3) e defina o nível de significância em p < 0,05.</li>
</ol>

Extração assistida por micro-ondas à base de poliol para rendimentos fenólicos e antioxidantes

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Os autores não têm nada a divulgar.

Vários fatores desempenham um papel crucial na implementação bem-sucedida do MAE, como o conteúdo fitoquímico dos componentes da planta, duração da extração, temperatura, potência de micro-ondas, relação sólido-líquido e concentração de solvente13. As plantas normalmente exibem perfis variados de fitoquímicos; Assim, a seleção de plantas naturais ricas em antioxidantes e compostos fenólicos é essencial23. Além disso, constituintes bioativos distintos exibem uma variedade de polaridades, dependendo do solvente usado. Da mesma forma, os solventes exibem polaridades diferentes. Dado que a polaridade dos solventes desempenha um papel crucial na determinação da eficácia da extração de compostos bioativos de matérias-primas, é imperativo que a polaridade do solvente se alinhe com a das moléculas bioativas alvo24.
Neste estudo, vários polióis foram utilizados para extrair polifenóis e antioxidantes da casca de café usando MAE. Os polifenóis são predominantemente polares e os solventes com alta polaridade normalmente aumentam o rendimento dos compostos fenólicos25. Em comparação com amostras com água e etanol, aquelas que empregaram diferentes polióis demonstraram maior eficiência em todas as respostas medidas, incluindo TPC, TFC e ensaios antioxidantes como DPPH, ABTS e FRAP. Estudos anteriores apóiam as descobertas de que as misturas aquoso-poliol podem aumentar o rendimento de extração de compostos bioativos em comparação com as misturas aquoso-etanol 9,10,11. Ao comparar diferentes polióis, as amostras com um sistema aquoso de poliol específico não produziram o valor mais alto. No entanto, é interessante notar que as amostras com 1,2-hexanodiol aquoso produziram os maiores valores nos ensaios TPC e TFC. Enquanto isso, aqueles com hexilenoglicol aquoso produziram os maiores valores nos ensaios DPPH e FRAP, e o extrato aquoso de pentilenoglicol exibiu os maiores valores no ensaio ABTS. A variação nos valores obtidos de diferentes ensaios, como TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP dentro de sistemas aquosos de polióis, pode ser atribuída a vários fatores, incluindo as características distintivas dos polióis empregados. Os polióis exibem diferenças na viscosidade, polaridade e pontos de ebulição, influenciando diretamente sua eficácia na extração de compostos bioativos de materiais vegetais26. Uma explicação potencial pode ser atribuída ao princípio de "Semelhante dissolve semelhante", em que o sistema de solvente específico é o mais apropriado para facilitar a transferência de massa de compostos bioativos específicos27. Isso ressalta a importância de selecionar um solvente com uma polaridade que corresponda à do composto bioativo alvo.
Outra possível razão pode ser o fato de que a diferença no número de grupos hidroxila (-OH) presentes no solvente impacta significativamente o rendimento dos compostos fenólicos28. Entre esses polióis, apenas a glicerina contém três grupos -OH, enquanto os polióis restantes neste estudo contêm dois grupos -OH. Solventes com maior número de grupos -OH tendem a exibir maior viscosidade em comparação com aqueles com menos29. A viscosidade elevada pode impedir a transferência eficiente de compostos ativos durante o processo de extração, reduzindo assim o rendimento geral. Além disso, a constante dielétrica de um solvente, intimamente ligada à sua polaridade, desempenha um papel crucial na determinação de sua capacidade de dissolver solutos polares ou apolares. Solventes com constantes dielétricas mais altas são mais hábeis em dissolver solutos polares, e aqueles com menor são mais adequados para solutos apolares30. Entre os polióis, a glicerina exibe uma constante dielétrica comparativamente alta de 41,14, enquanto o hexilenoglicol, o pentilenoglicol e o 1,2-hexanodiol demonstram constantes dielétricas mais baixas de 25,86, 17,31 e 15,45, respectivamente 31,32. Os resultados deste estudo sugerem que os compostos bioativos dentro da amostra podem abranger constituintes de baixo pólo.
A eficiência da extração pode ser aprimorada otimizando a seleção e a composição dos solventes, e mais experimentos podem ser necessários para identificar o sistema de solvente mais adequado. Embora a investigação exiba potencial, ela é limitada por seu foco exclusivo na extração assistida por micro-ondas com polióis e sua avaliação restrita de outras variáveis, incluindo duração da extração, temperatura, concentração de solvente, relação sólido-líquido e poder de extração. Além disso, um estudo mecanístico é necessário para entender como os polióis funcionam devido às suas variadas constantes dielétricas, impactando diretamente sua solubilidade de solutos polares ou apolares. Diferenças nas constantes dielétricas entre os polióis destacam a importância de investigar seus mecanismos específicos na extração de compostos bioativos. Essa pesquisa ofereceria informações valiosas sobre as interações solvente-soluto, auxiliando na otimização e seleção de sistemas de solventes para processos de extração eficientes.
Em relação ao processo MAE, existem algumas limitações. Embora o MAE possa fornecer aquecimento rápido, o controle preciso da temperatura pode ser um desafio, potencialmente levando ao superaquecimento e à degradação de compostos termicamente sensíveis33. No entanto, a configuração de potência de micro-ondas para gradiente e temperatura de extração pode ser definida para a mesma potência de micro-ondas para evitar frustração de temperatura durante a extração. Além disso, o MAE tem limitações sobre componentes vegetais sensíveis ao calor. No entanto, a tecnologia avançada Ethos X MAE pode minimizar o risco de deterioração, apoiando o aquecimento efetivo em uma duração mais curta usando aquecimento dielétrico34. Cada vaso da câmara MAE tem sua própria capacidade máxima limitada de sólidos e líquidos. A relação sólido-líquido sobre essa limitação também pode influenciar muito a concentração dos extratos11. A dissolução entre solvente e soluto pode ser promovida usando barras agitadoras, potencialmente levando a uma extração eficaz e maior rendimento35. Além disso, os compostos fenólicos e flavonoides extraídos dentro dos extratos podem ser verificados por meio de análises adicionais, como Cromatografia Líquida Tripla Quadrupolo Mass Spectrometry (LC-QQQ) e Cromatografia Líquida Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry (LC-QTOF), para estabelecer a presença de compostos bioativos específicos e suas respectivas quantidades36.
A extração de polifenóis e antioxidantes da casca de café usando polióis aquosos através do MAE demonstrou maior eficiência em comparação com os extratos aquosos e etanólicos. Com base nos resultados derivados do MAE à base de polióis dos extratos de CS, observou-se que o emprego dos sistemas aquoso-hexilenoglicol, aquoso-1,2-hexanodiol e aquoso-pentilenoglicol resultou em rendimentos de extração significativamente maiores de compostos bioativos e capacidades antioxidantes. Além disso, esses achados ressaltam o potencial da utilização de tais compostos extraídos para análises investigativas subsequentes. A utilização de polióis como solventes verdes para extração de compostos bioativos de materiais vegetais por meio do MAE promete benefícios ambientais e maior rendimento de compostos bioativos, oferecendo uma abordagem sustentável com potencial para uso em aplicações cosméticas.

Atualmente, há uma tendência global de conscientização ambiental na indústria da beleza, levando os fabricantes a se concentrarem em tecnologia verde para extração de componentes vegetais usando alternativas sustentáveis1. Normalmente, solventes tradicionais, como etanol, metanol e hexano, são usados para extrair componentes fenólicos vegetais e antioxidantes naturais2. No entanto, a presença de resíduos de solventes nos extratos vegetais representa um risco potencial para a saúde humana, induzindo irritação cutânea e ocular3, particularmente no que diz respeito à sua aplicação em cosméticos. Consequentemente, é desafiador eliminar esses resíduos de solventes dos extratos, um processo que demanda considerável investimento em tempo, energia e recursos humanos4. Recentemente, água superaquecida, líquidos iônicos, solventes eutéticos profundos e solventes bioderivados surgiram como abordagens promissoras para a extração de solventes verdes5. No entanto, seu uso ainda é limitado pela separação do produto em processos aquosos. Para enfrentar esses desafios, o desenvolvimento de extratos prontos para uso surge como uma solução viável6.
Os polióis são frequentemente usados em formulações cosméticas como umectantes devido à sua boa polaridade e capacidade de reter a umidade do ambiente7. Além disso, polióis como glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, metilpropanodiol, isopentildiol, pentilenoglicol, 1,2-hexanodiol e hexilenoglicol podem ser utilizados para extrações de plantas. São considerados solventes não tóxicos, biodegradáveis, ecologicamente corretos, não reativos e seguros para uso na extração de plantas8. Além disso, os polióis podem suportar o calor gerado durante a extração assistida por micro-ondas (MAE) devido aos seus pontos de ebulição e polaridade elevados9. Esses polióis são geralmente reconhecidos como produtos químicos seguros (GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos. Ao contrário dos solventes convencionais, como etanol ou metanol, que podem exigir uma remoção rigorosa do extrato devido aos seus efeitos potencialmente nocivos, os polióis oferecem a vantagem de minimizar a energia, o tempo e os custos associados aos processos de remoção de solventes10. Isso não apenas agiliza o processo de extração, mas também aumenta a eficiência geral e a sustentabilidade do método de extração. Investigações anteriores empregaram polióis como propilenoglicol e butilenoglicol como solventes na extração de compostos bioativos de flores de Camellia sinensis 10 e polpa de café11, revelando potencial significativo para seu papel como solventes alternativos sustentáveis no processo de extração de plantas. Assim, o desenvolvimento e a otimização contínuos de um sistema de solvente de polióis-água têm potencial para avanços significativos na química verde e em práticas industriais sustentáveis.
Geralmente, os compostos bioativos encontrados nas plantas são sintetizados como metabólitos secundários. Esses compostos podem ser categorizados em três grupos primários: terpenos e terpenóides, alcalóides e compostos fenólicos12. Vários métodos de extração são utilizados em diferentes condições para isolar compostos bioativos específicos das plantas. Compostos bioativos de materiais vegetais podem ser extraídos usando técnicas convencionais ou não convencionais. Os métodos tradicionais incluem maceração, extração de refluxo e hidrodestilação, enquanto os métodos não convencionais consistem em extração assistida por ultrassom, extração assistida por enzima, extração assistida por micro-ondas (MAE), extração assistida por campo elétrico pulsado, extração de fluido supercrítico e extração de líquido pressurizado13. Esses métodos não convencionais são projetados para aumentar a segurança, utilizando solventes e auxiliares mais seguros, melhorando a eficiência energética, evitando a degradação dos componentes bioativos e reduzindo a poluição ambiental14.
Além disso, o MAE está entre as sofisticadas tecnologias verdes para extração de compostos bioativos de plantas. Os procedimentos convencionais de extração requerem quantidades significativas de tempo, energia e altas temperaturas, que com o tempo podem degradar compostos bioativos sensíveis ao calor13. Em contraste com as extrações térmicas convencionais, o MAE facilita a extração de compostos bioativos, gerando aquecimento localizado dentro da amostra, interrompendo as estruturas celulares e aumentando a transferência de massa, aumentando assim a eficiência da extração do composto. O calor é transferido de dentro das células vegetais por microondas, que operam nas moléculas de água dentro dos componentes da planta13. Além disso, o MAE avançou para melhorar a extração e separação de compostos ativos, aumentando o rendimento do produto, aumentando a eficiência da extração, exigindo menos produtos químicos e economizando tempo e energia, evitando a destruição de compostos bioativos15.
Esta pesquisa se concentra na extração de compostos fenólicos vegetais e antioxidantes naturais por meio de extração assistida por micro-ondas (MAE) usando diferentes tipos de polióis como solventes. O conteúdo fenólico total (TPC), o conteúdo total de flavonóides (TFC) e as atividades antioxidantes (DPPH, ABTS e FRAP) dos extratos de MAE à base de poliol são determinados. Além disso, o MAE à base de poliol é comparado com o MAE usando solventes convencionais, como água e etanol. Espera-se que esta pesquisa contribua para o desenvolvimento de tecnologia de extração ambientalmente sustentável para componentes naturais, promovendo a sustentabilidade reduzindo a dependência de produtos químicos perigosos, encurtando os tempos de processamento e minimizando o consumo de energia na produção de matérias-primas para aplicações potenciais na indústria de cosméticos.

<table><tbody><tr><td>1,2-Hexanodiol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,2 -Azino-bis 3 etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico sal de diamônio (ABTS)</td><td>Sigma</td><td>A1888</td><td></td></tr><tr><td>2,2-Difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)</td><td>Sigma</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-Tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)</td><td>Sigma</td><td>93285</td><td></td></tr><tr><td>2-Digital balança</td><td>Ohaus</td><td></td><td>Pioneer</td></tr><tr><td>4-Digital balança</td><td>Denver</td><td>SI-234</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroxi-2,5,7,8 tetrametilcromano -2-ácido carboxílico (Trolox)</td><td>Placa Sigma</td><td>238813</td><td></td></tr> de <tr><td>96 poços</td><td>SPL Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>RCI Labscan</td><td>64175</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>RCI Labscan</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de alumínio</td><td>Loba Chemie</td><td>898</td><td></td></tr><tr><td>Automatic pipeta</td><td>Labnet</td><td></td><td>Biopett</td></tr><tr><td>Butilenoglicol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extração avançada por microondas Ethos X</td><td>Milestone Srl, Sorisole, Itália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato ferroso</td><td>Ajex Finechem</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Folin-Ciocalteu</td><td>Loba Chemie</td><td>3870</td><td></td></tr><tr><td>Freezer SF</td><td>Sanyo</td><td>C697(GYN)</td><td></td></tr><tr><td>Ácido gálico</td><td>Sigma</td><td>398225</td><td></td></tr><tr><td>Grinder</td><td>Ou Hardware Products Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexilenoglicol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (37%)</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1107</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III)</td><td>Loba Chemie</td><td>3820</td><td></td></tr><tr><td>Isopentildiol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>RCI Labscan</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>Metilpropanodiol&nbsp;</td><td>Fornecedor verificado - Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentilenoglicol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de potássio</td><td>Loba Chemie</td><td>5420</td><td></td></tr><tr><td>Propilenoglicol</td><td>Chanjao Longevity Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quercetina</td><td>Sigma</td><td>Q4951</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Hettich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Loba Chemie</td><td>5758</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Loba Chemie</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1325</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Loba Chemie</td><td>5954</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas SPECTROstar Nano</td><td>BMG- Software LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS IBM SPSS</td><td>Statistics 20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secador de bandejas</td><td>França Etuves</td><td>XUE343</td><td></td></tr></tbody></table>

extração assistida por micro-ondas de compostos fenólicos e antioxidantes para aplicações cosméticas usando tecnologia baseada em poliol

Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Compounds and Antioxidants for Cosmetic Applications Using Polyol-Based Technology

A utilização de polióis como solventes verdes para extração de compostos bioativos de materiais vegetais tem ganhado atenção devido à sua segurança e comportamento inerte com produtos químicos bioativos vegetais. Este estudo explora a extração sustentável de compostos fenólicos e antioxidantes naturais da casca de café usando o método de extração assistida por micro-ondas (MAE) com solventes à base de poliol: glicerina, propilenoglicol (PG), butilenoglicol (BG), metilpropanodiol (MPD), isopentildiol (IPD), pentilenoglicol, 1,2-hexanodiol e hexilenoglicol (HG). Foi realizada uma análise comparativa de extrações com solventes convencionais e não convencionais, com foco em seu impacto nos compostos bioativos do MAE, englobando parâmetros como conteúdo fenólico total (TPC), teor total de flavonoides (TFC) e atividades antioxidantes como o ensaio de sequestro de radicais 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), o ensaio de sequestro de radicais 2,2′-azino-bis(-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS) e o ensaio de poder antioxidante redutor férrico (FRAP). Os maiores valores foram observados para TPC com extração aquosa de 1,2-hexanodiol (amostra de 52,0 ± 3,0 mg GAE/g), TFC com extração aquosa de 1,2-hexanodiol (amostra de 20,0 ± 1,7 mg QE/g), DPPH com extração aquosa de HG (amostra de 13,6 ± 0,3 mg TE/g), ABTS com extração aquosa de pentilenoglicol (amostra de 8,2 ± 0,1 mg TE/g) e FRAP com extração aquosa de HG (amostra de 21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g). Esta pesquisa visa avançar a tecnologia de extração ecologicamente correta por meio de componentes naturais de plantas, promovendo a sustentabilidade ao minimizar o uso de produtos químicos perigosos e reduzir o tempo e o consumo de energia, com aplicações potenciais em cosméticos.

Efeito de solventes polióis e solventes convencionais sobre o conteúdo de fenólicos totais, teor de flavonóides totais, ensaios antioxidantes DPPH, FRAP e ABTS A polaridade do solvente deve ser compatível com a das moléculas ativas direcionadas para melhorar a eficiência de extração de substâncias bioativas das plantas22. Experimentos foram conduzidos usando vários solventes (água, etanol, glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, metilpropanodiol, isopentildiol, pentilenoglicol, 1,2-hexanodiol e hexilenoglicol) para avaliar seu impacto sobre os compostos bioativos e atividades antioxidantes do extrato de silverskin de café MAE.
Efeito de solventes polióis e solventes convencionais sobre o teor de fenólicos totais O conteúdo fenólico total de cada extração com diferentes solventes foi analisado. O maior teor de fenólicos foi obtido nas amostras com 1,2-hexanodiol aquoso (52,0 ± 3,0 mg GAE/g de amostra), enquanto o menor TPC foi revelado nas amostras com extração de água (31,4 ± 4,3 mg GAE/g de amostra), e esses valores foram significativamente diferentes daqueles de todas as outras condições. As amostras com pentilenoglicol aquoso produziram o segundo maior valor de TPC, seguidas por amostras com glicol aquoso-butileno, metilpropanodiol e outros sistemas de solventes (Figura 11A). Ao comparar amostras com solventes convencionais (sistema água e etanol aquoso) e amostras com solventes à base de polióis, podem ser observadas diferenças significativas nos valores de TPC (p &lt; 0,05).
Efeito de solventes polióis e solventes convencionais sobre o teor de flavonoides totais O teor de flavonóides totais de cada extração com diferentes solventes foi analisado. O maior teor de flavonóides foi obtido nas amostras com 1,2-hexanodiol aquoso (20,0 ± amostra de 1,7 mg QE/g), demonstrando uma diferença significativa em relação a todos os outros extratos. As amostras com isopentiodiol aquoso revelaram o menor valor de TFC (8,8 ± 0,7 mg QE/g de amostra), que não foi significativamente diferente dos extratos aquos-metil propanodiol e etanol aquoso. Além disso, o segundo maior valor de TFC foi encontrado na amostra com pentilenoglicol aquoso, seguido por hexilenoglicol aquoso, propilenoglicol aquoso, butilenoglicol aquoso e glicerina aquosa (Figura 11B).
Efeito de solventes polióis e solventes convencionais em ensaios antioxidantes As atividades antioxidantes dos extratos com polióis e solventes convencionais foram avaliadas por meio dos ensaios DPPH, ABTS e FRAP. O maior valor para o ensaio de DPPH foi medido em amostras com hexilenoglicol aquoso (13,6 ± 0,3 mg TE/g de amostra) e o menor em amostras com etanol aquoso (4,5 ± 0,2 mg GAE/g de amostra), e esses valores foram significativamente diferentes dos demais extratos (p &lt; 0,05). Os segundos maiores valores de DPPH foram observados nas amostras com 1,2-hexanodiol aquoso, seguido por pentilenoglicol aquoso, propanodiol metil aquoso e outros sistemas de solventes (Figura 11C).
O maior valor de ABTS foi medido em amostras com pentilenoglicol aquoso (8,2 ± 0,1 mg TE/g amostra) e o menor em amostras com água (5,6 ± 0,04 mg GAE/g amostra), e esses valores foram significativamente diferentes dos demais extratos (p &lt; 0,05). Os segundos maiores valores de ABTS foram detectados em butilenoglicol aquoso e 1,2-hexanodiol aquoso, seguidos por amostras com glicerina aquosa, metilpropanodiol aquoso e outros sistemas de solventes (Figura 11D).
Os maiores valores de FRAP foram observados nas amostras com água-hexilenoglicol (21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g amostra e os menores na extração em água (11,5 ± 0,2 Fe (II) E/g amostra), sendo esses valores significativamente diferentes (p &lt; 0,05) para os demais solventes. Além disso, os segundos maiores valores de FRAP foram encontrados em amostras com pentilenoglicol aquoso, seguido por butilenoglicol aquoso, glicerina aquosa e outros sistemas de solventes (Figura 11E).
Ao comparar as atividades antioxidantes das amostras com solventes convencionais (água e etanol aquoso), aquelas contendo polióis exibiram atividades antioxidantes significativamente maiores em todos os ensaios antioxidantes (DPPH, ABTS e FRAP) (p &lt; 0,05).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig01.jpg"> Figura 1: Reação em recipientes experimentais e na câmara MAE. (A) A amostra e o solvente são adicionados ao recipiente branco entre camadas de um recipiente de Teflon antes da extração. (B) Cada recipiente é colocado dentro da câmara de micro-ondas antes de iniciar a extração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig02.jpg"> Figura 2: Ferramentas especiais para fechar os vasos de reação. Depois de adicionar a amostra e o solvente ao recipiente de Teflon, as tampas são aplicadas na parte superior do recipiente, colocadas no suporte do recipiente e bem presas com as ferramentas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig03.jpg"> Figura 3: Método de extração. (A) Método de extração, criado entrando na seção de método. (B) O acessório SK eT é aplicado para o processo MAE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig04.jpg"> Figura 4: Taxa de agitação e configuração da função de travamento da porta. (A) As barras agitadoras magnéticas dentro de cada recipiente podem ser ativadas escolhendo a taxa de agitação. (B) A função de trava da porta limita a temperatura, permitindo que a câmara seja aberta após a extração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig05.jpg"> Figura 5: Configurando as condições de extração. (A) Entrar no ícone da tabela e definir as condições de extração, como tempo, temperatura e potência de micro-ondas. (B) Abrindo o botão do agitador e escolhendo a velocidade do soprador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig06.jpg"> Figura 6: Configurando o tempo de resfriamento. Aplicando o tempo de resfriamento para reduzir a temperatura interna na câmara MAE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig07.jpg"> Figura 7: Iniciando o processo de extração. (A) Salvando o método criado para extração. (B) Clicando no ícone de reprodução para iniciar o processo de extração. (C) Escolher o número de recipientes para iniciar a extração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig08.jpg"> Figura 8: Imagem do extrato final após extração usando MAE. Obtenção do sobrenadante após centrifugação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig09.jpg"> Figura 9: As 96 placas de poços para determinar a atividade de sequestro de TPC, TFC, DPPH, atividade de sequestro de ABTS e ensaio FRAP dos extratos. (A) Determinação do TPC para a placa-padrão de ácido gálico a partir de uma concentração de 2,5-75 μg/mL e extratos de amostra. (B) Determinação do TFC para a placa padrão de quercetina a partir de concentrações de 2,5-50 μg/mL e ensaio TFC para medir extratos de amostras. (C) Determinar a atividade de eliminação de DPPH para a placa padrão Trolox a partir de concentrações de 0,25-12,5 μg/mL e a placa de detecção de atividade de eliminação de DPPH de extratos de amostra. (D) Determinação da atividade de eliminação de ABTS para a placa padrão Trolox a partir de concentrações de 0,25-5 μg/mL e a placa de detecção de atividade de eliminação de ABTS de extratos de amostra. (E) Determinação do ensaio FRAP para a placa padrão FeSO4 a partir de concentrações de 0,25-10 μg/mL e a placa de detecção do ensaio FRAP de extratos de amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig10.jpg"> Figura 10: As curvas de calibração padrão para o ensaio TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP. (A) A curva padrão para determinar o TPC, plotada por concentrações do padrão de ácido gálico e absorbância em A765. (B) A curva padrão para determinar o TFC, representada graficamente pelas concentrações do padrão de quercetina e da absorvância a A510. (C) A curva padrão para determinar a atividade de eliminação de DPPH, plotada por concentrações do padrão Trolox e % de inibição. (D) A curva padrão para determinar a atividade de eliminação do ABTS, plotada pelas concentrações do padrão Trolox e % de inibição. (E) A curva padrão para medir o ensaio FRAP, plotada por concentrações do padrão de sulfato ferroso e absorbância em A593. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67033/67033fig11.jpg"> Figura 11: O efeito dos tipos de solvente no TPC, TFC, DPPH sequestrando atividade, atividade de sequestro ABTS e ensaio FRAP no MAE de café silverskin. (A) O efeito dos tipos de solvente no conteúdo fenólico total. (B) O efeito dos tipos de solventes no teor total de flavonóides. (C) O efeito dos tipos de solvente na atividade de eliminação de DPPH. (D) O efeito dos tipos de solvente na atividade de eliminação de ABTS. (E) O efeito dos tipos de solvente no ensaio FRAP. Os valores são indicados como Média ± DP (n = 3). Valores com diferentes letras sobrescritas expressam diferença estatisticamente significativa (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/67033fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Preparação da curva padrão do ácido gálico. Preparando a faixa de concentração padrão de 2,5-75 μg/mL na placa de 96 poços. B = branco, 1-7 = número de poços na placa de 96 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%201%20Gallic%20acid%20standard%20curve%20preparation.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Cálculo final da concentração dos padrões de ácido gálico. Preparando a faixa de concentração padrão de 2,5-75 μg/mL. As concentrações finais (μg/ml) de ácido gálico são calculadas em conformidade. Concentração final (μg/mL) = (Concentração inicial (mg/mL) × Volume inicial (μL) / volume final (μL)) × (1000 μg/1 mg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%202%20Final%20concentration%20gallic%20acid.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Preparação da curva padrão de quercetina. Preparação da faixa de concentração padrão de 2,5-50 μg/mL na placa de 96 poços. B = branco, 1-7 = número de poços na placa de 96 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%203%20Quercetin%20standard%20curve%20preparation.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 4: Tabela de cálculo final de concentração para padrões de quercetina. Preparando a faixa de concentração padrão de 2,5-50 μg/mL. As concentrações finais (μg/ml) de quercetina são calculadas em conformidade. Concentração final (μg/mL) = (Concentração inicial (mg/mL) × Volume inicial (μL) / volume final (μL)) × (1000 μg/1 mg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%204%20Final%20concentration%20%20quercetin.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 5: Preparação da curva padrão Trolox na faixa de concentração de 0,25-12,5 μg/mL. Preparando a faixa de concentração padrão de 0,25-12,5 μg/mL na placa de 96 poços. B = branco, C = controle, 1-7 = número de poços na placa de 96 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%205%20Trolox%20standard%20curve%20preparation.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 6: Cálculo final da concentração dos padrões Trolox para o ensaio DPPH. Preparação da faixa de concentração padrão de 0,25-12,5 μg/mL, incluindo as concentrações finais (μg/mL) de Trolox. Concentração final (μg/mL) = (Concentração inicial (mg/mL) × Volume inicial (μL) / volume final (μL)) × (1000 μg/1 mg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%206%20Final%20concentration%20for%20trolox%20DPPH.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 7: Preparação da curva padrão Trolox na faixa de concentração de 0,25-5 μg/mL. Preparação da faixa de concentração padrão de estoque de 0,25-5 μg/mL na placa de 96 poços. B = branco, C = controle, 1-7 = número de poços na placa de 96 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%207%20Trolox%20standard%20curve%20preparation.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 8: Cálculo final da concentração dos padrões Trolox para o ensaio ABTS. Preparação da faixa de concentração padrão de 0,25-5 μg/mL, incluindo as concentrações finais (μg/mL) de Trolox. Concentração final (μg/mL) = (Concentração inicial (mg/mL) × Volume inicial (μL) / volume final (μL)) × (1000 μg/1 mg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%208%20Final%20concentration%20for%20trolox%20ABTS.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 9: Tabela de cálculo final de concentração para os padrões FeSO4 . Preparação da faixa de concentração padrão de 2,5-100 μg/mL, incluindo as concentrações finais (μg/mL) de FeSO4. Concentração final (μg/mL) = (Concentração inicial (mg/mL) × Volume inicial (μL) / volume final (μL)) × (1000 μg/1 mg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%209%20Final%20concentration%20for%20FeSO4.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 10: Preparação da curva padrão FeSO4 . Preparando a faixa de concentração padrão de 0,25-10 μg/mL na placa de 96 poços. B = em branco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67033/Table%2010%20FeSO4%20standard%20curve%20preparation.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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