Name: Análise quantitativa de metabólitos dietéticos de vitamina A em tecidos oculares e não oculares murinos usando cromatografia líquida de alta eficiência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a quantificar metabólitos de vitamina A em tecidos oculares e hepáticos de camundongos usando cromatografia líquida de alta eficiência. Este método auxilia pesquisadores a estudar transportadores STRA6 e RBPR2.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análise de metabólitos de vitamina A em tecido murino para estudos de função de rodopsina

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Octanol, adequado para HPLC, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>203-917-6</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxano, adequado para HPLC, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>204-661-8</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-retinal</td><td>National Eye Institute</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-retinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252105</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinal</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R239900</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252110</td><td></td></tr><tr><td>Produtos Químicos de Pesquisa totalmente trans-retinal</td><td>Toronto</td><td>TRC-R240000</td><td></td></tr><tr>Acetato de etila totalmente<td>trans-retinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252002</td><td></td></tr>, <tr><td>adequado para HPLC, &ge; 99,7%</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>205-500-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexano, HPLC Grau</td><td>Fisher Scientific, Spectrum Chemical</td><td>18-610-808</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>Fisher Scienctific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl Palmitato</td> Toronto <td>Research Chemicals</td><td>TRC-R275450</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (ACS Cristalino/Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Coletor de Frações Analíticas</td><td>Agilent</td><td>G1364F</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Bomba Binária</td><td>Agilent</td><td>G7112B</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Detector de Matriz de Diodos</td><td>Agilent</td><td>G7115A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Termostato Multicoluna</td><td>Agilent</td><td>G7116A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Vialsampler</td><td>Agilent</td><td>G7129A</td><td></td></tr><tr><td>ST40R Centrífuga Refrigerada</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSST40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus Concentrador de Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22820168</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Frascos de rosca âmbar</td><td>Agilent</td><td>5188-6535</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de crimpagem com septos de borracha PTFE/vermelho, 11 mm</td><td>Agilent</td><td>5183-4498</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de vidro descartáveis</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS9950215</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de tampa de rosca, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de frasco, 150 &micro; L, vidro com pés de polímero</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

análise quantitativa de metabólitos dietéticos de vitamina a em tecidos oculares e não oculares murinos usando cromatografia líquida de alta eficiência

Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography

Aqui, utilizamos o método descrito acima para detectar e quantificar retinóides em tecido ocular e sistêmico murino e geramos cromatogramas representativos. Além disso, daremos um resumo dos retinóides típicos que podem ser detectados nesses tecidos.
Aos 6 meses de idade, os camundongos foram eutanasiados por asfixia por CO2 . Para manter o conteúdo retinóide ocular, os camundongos foram adaptados ao escuro por 2 dias antes da eutanásia e extração. Dois olhos, 0,2 g de fígado e 75 μL de sangue foram colhidos para extração de retinóides e posterior análise por HPLC. Para o tecido ocular, um olho foi extraído sem a adição de hidroxilamina, enquanto o outro foi submetido ao tratamento com hidroxilamina. Para fígado e sangue, o tratamento com hidroxilamina não foi necessário, uma vez que os retinaldeídos não são normalmente detectados nesses tecidos.
No cromatograma do olho de camundongo não tratado com hidroxilamina, foi identificado 13-cis-retinal, um dos dois isômeros não canônicos de retinaldeído. Além disso, foram identificados 11-cis-retinal e all-trans-retinal, os dois isômeros canônicos de retinaldeído. Em ambos os cromatogramas, foram identificados o 11-cis-retinol intermediário do ciclo visual, bem como a principal forma de transporte de vitamina A, o all-trans-retinol (Figura 4A).
No cromatograma do olho de camundongo tratado com hidroxilamina, todos os isômeros de retinaldeído mencionados anteriormente ainda estavam presentes. No entanto, os tempos de retenção para esses isômeros foram significativamente aumentados. Além disso, esses isômeros de retinaldeído agora se apresentam como isômeros syn e anti . Durante a quantificação por meio da integração de picos, os picos syn e anti devem ser somados para obter um valor de integração preciso. Tanto o 11-cis-retinol quanto o all-trans-retinol ainda estavam presentes (Figura 4B).
No cromatograma do tecido hepático de camundongos, palmitato de retinila e all-trans-retinol foram identificados dentro desses tecidos. O palmitato de retinila, um éster de retinila, serve como a principal forma de armazenamento de vitamina A em mamíferos e pode ser encontrado em quantidades significativas no tecido hepático de mamíferos. O fígado libera vitamina A nos tecidos sistêmicos como holo-RBP4, contendo todo o trans-retinol dentro do complexo RBP4-transtricatina Posteriormente, um grande pico de todo o trans-retinol pode ser identificado neste cromatograma ( Figura 4C ).
No cromatograma do sangue de camundongos, foi identificado um grande pico de todo o trans-retinol. Dado que o holo-RBP4 do fígado é liberado para os tecidos sistêmicos através do sistema circulatório, isso é o esperado ( Figura 4D ). A absorbância característica do espectro UV (~ 250-400 nm) das isoformas retinóides nos picos de HPLC resolvidos dependentes do tempo pode ser útil na confirmação cruzada inicial da qualidade da presença da isoforma em um pico respectivo específico (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig01.jpg"> Figura 1: Estruturas químicas dos retinóides. (A) Esses retinóides são normalmente encontrados em tecido murino extraído. Observe os diferentes grupos de extremidades polares, bem como as diferentes localizações das ligações duplas cis nos isômeros retinóides. (B) A conversão de retinaldeídos em oximas retinianos aumenta a eficiência da extração, evita a coeluição de picos com palmitato de retinila, bem como a coeluição dentro dos isômeros de retinaldeído. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho para coleta de tecido, homogeneização, extração e análise de retinóides. Retinas e amostras de tecido de camundongos adaptados ao escuro foram homogeneizadas e extraídas. Passo 1: Após a eutanásia dos camundongos de acordo com as diretrizes, sangue e vários tecidos são coletados. Etapas 2-4: A homogeneização do tecido é então feita com solução salina e metanol, com cloridrato de hidroxilamina para análises quantitativas. Etapas 5-7: Os retinóides são tratados com hexano, seguido de evaporação. Passos 8,9: Ressuspenso com 100 μL de hexano para garantir que todos os retinóides sejam dissolvidos. Passo 10: Finalmente, as amostras são analisadas por HPLC. Abreviatura: HPLC = Cromatografia Líquida de Alta Resolução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig03.jpg"> Figura 3: Cromatograma de padrões retinóides e padrões de retinóides tratados com hidroxilamina. (A) Este cromatograma contém padrões de palmitato de retinila, 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol, 13-cis-retinol e all-trans-retinol. (B) Este cromatograma contém os padrões de palmitato de retinila, 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol, 13-cis-retinol e all-trans-retinol. Este cromatograma contém os isômeros syn e anti-oxima retinaldeído, além de isômeros de retinol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig04.jpg"> Figura 4: Cromatogramas representativos. (A) Cromatograma representativo do tecido ocular de camundongo. Este cromatograma contém retinóides normalmente encontrados no tecido ocular murino, incluindo isômeros de retinaldeído, além de isômeros de retinol. (B) Cromatograma representativo do tecido ocular de camundongo tratado com hidroxilamina. Observe que, em vez dos retinaldeídos não quimicamente modificados encontrados nos cromatogramas anteriores (Figura 4A), este cromatograma contém os isômeros syn e anti-oxima retinaldeyde, além dos isômeros de retinol. (C) Cromatograma representativo do tecido hepático de camundongo. Este cromatograma contém retinóides normalmente encontrados no tecido hepático murino, incluindo palmitato de retinila e all-trans-retinol. (D) Cromatograma representativo de sangue de camundongo. Este cromatograma contém retinóides normalmente encontrados no sangue murino, incluindo todo o trans-retinol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig05.jpg"> Figura 5: Espectro de absorbância UV dos isômeros de retinaldeído do tecido ocular murino. Espectros de absorbância de (A) 13-cis-retinal, (B) 11-cis-retinal, (C) 9-cis-retinal, (D) totalmente trans-retiniano, (E) syn 11-cis-retinal oxima, (F) anti 11-cis-retinal oxima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig06.jpg"> Figura 6: Visão geral dos módulos de HPLC, fluxo de fase móvel e outros instrumentos. O fluxo de fase móvel começa a partir dos frascos de solvente preparados e é bombeado em alta pressão pela bomba binária para o amostrador automático, onde o analito é incorporado ao fluxo de solvente. A fase móvel e o analito atingem o compartimento da coluna com temperatura regulada e, finalmente, o detector de matriz de diodos para medição. (A) Tela de monitor de cor vermelha minimizando a fotoisomerização de retinóides. (B) Bomba binária. (C) Amostrador de frascos. (D) Termostato multicoluna. (E) Detector de arranjo de diodos. (F) Coletor de frações analíticas. (G) Recipiente de resíduos poli de alta densidade. (H) Da esquerda para a direita, tampa de crimpagem de alumínio, inserto de 250 μL com pés de polímero, frasco superior de crimpagem de cor âmbar, montagem final do frasco de injeção. (I) Centrífuga refrigerada esquerda. Certo, concentrador de centrífuga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Absortividade molar (ε)</td>
			<td>Solvente</td>
			<td>Referência</td>
		</tr><tr><td>Palmitato de Retinilo</td>
			<td>49260</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-Retinal</td>
			<td>35500</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-Retinal</td>
			<td>24935</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>9-cis-Retinal</td>
			<td>36100</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>Totalmente trans-retinal</td>
			<td>42880</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-Retinol</td>
			<td>34890</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-Retinol</td>
			<td>48305</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Robeson et al.50 e Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>Totalmente trans-retinol</td>
			<td>52770</td>
			<td>Etanol</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Absortividade molar de retinóides em etanol. Os valores de absortividade molar dos retinóides foram coletados de Kane e Napoli44, Hubbard et al.46, Robeson et al.47 e Robeson et al.48. A absortividade molar depende do solvente. Os valores listados aqui são específicos para retinóides dissolvidos em etanol.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tecido</td>
			<td>Quantidade de colheita de tecido</td>
			<td>Volume para Homogeneização</td>
		</tr><tr><td>Sangue</td>
			<td>75 μL</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Fígado</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Rim</td>
			<td>2 Rins inteiros</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Pele</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>1 mL – 1,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Baço</td>
			<td>1 Baço inteiro</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Olho</td>
			<td>Ambos Retina, pool 4 Retina</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Cérebro</td>
			<td>1 Cérebro inteiro</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Coração</td>
			<td>1 Coração Inteiro</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Pulmão</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Quantidade de tecido recomendada por análise. Quantidade de tecido por análise e volume de soro fisiológico gelado a 50% (0,9%) e metanol a 50% para homogeneização tecidual, conforme preconizado por Kane e Napoli44.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Tempo de retenção (min)</td>
			<td>Máximos de absorbância UV (nm)</td>
		</tr><tr><td>Palmitato de Retinilo</td>
			<td>5.177</td>
			<td>326</td>
		</tr><tr><td>13-cis-Retinal</td>
			<td>7.268</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>11-cis-Retinal</td>
			<td>7.691</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>9-cis-Retinal</td>
			<td>7.931</td>
			<td>364</td>
		</tr><tr><td>Totalmente trans-retinal</td>
			<td>8.993</td>
			<td>370</td>
		</tr><tr><td>11-cis-Retinol</td>
			<td>17.003</td>
			<td>318</td>
		</tr><tr><td>13-cis-Retinol</td>
			<td>17.83</td>
			<td>328</td>
		</tr><tr><td>Totalmente trans-retinol</td>
			<td>23.933</td>
			<td>326</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Tempos de retenção e comprimentos de onda máximos de absorbância dos retinóides. Esses valores foram observados quando usados com o método descrito e a fase móvel, conforme detectado com o detector de matriz de diodos referenciado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Tempo de retenção (min)</td>
			<td>Máximos de absorbância UV (nm)</td>
		</tr><tr><td>Syn 11-cis-Oxima Retiniana</td>
			<td>9.59</td>
			<td>346</td>
		</tr><tr><td>Syn Oxima totalmente trans-retiniana</td>
			<td>10.6</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Syn 13-cis-retinal oxima</td>
			<td>11.3</td>
			<td>352</td>
		</tr><tr><td>Oxima anti-13-cis-retiniana</td>
			<td>13</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Oxima anti-11-cis-retiniana</td>
			<td>15.1</td>
			<td>350</td>
		</tr><tr><td>Anti Oxima totalmente trans-retiniana</td>
			<td>19.7</td>
			<td>360</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Tempos de retenção e comprimentos de onda máximos de absorbância de retinaldeídos tratados com hidroxilamina, resultando em isômeros syn e anti-oxima de cada retinaldeído. Esses valores foram observados quando usados com o método descrito e a fase móvel, conforme detectado com o detector de matriz de diodos referenciado.

Análise quantitativa de metabólitos dietéticos de vitamina A em tecidos oculares e não oculares murinos usando cromatografia líquida de alta eficiência

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