Name: Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a medir taxas de consumo de oxigênio em culturas de epitélio pigmentar retiniano altamente diferenciadas usando o dispositivo Resipher. Este método permite monitoramento de longo prazo em condições ideais de cultura.

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Agradecemos aos Drs. Daniel Hass e Jim Hurley pela ideia de testar a solubilidade de O2 em meios novos versus condicionados como controle. Agradecemos à Dra. Magali Saint-Geniez pela contribuição editorial do manuscrito. Agradecemos a Scott Szalay do Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, por adaptar a câmara de hipóxia com o cabo USB Resipher. Nenhum fundo federal foi usado para pesquisa de HFT. O Núcleo de Serviços Eletrônicos é apoiado pelo P30 EY007003 do National Eye Institute. Este trabalho é apoiado por uma bolsa departamental irrestrita da Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. é apoiado pela Iniciativa James Grosfeld para Degeneração Macular Relacionada à Idade Seca, a Fundação E. Matilda Ziegler para Cegos, uma doação do banco de olhos Eversight, uma doação de K08EY033420 do National Eye Institute e apoio de Dee e Dickson Brown, bem como da Fundação David e Lisa Drews Discovering Hope. D.Y.S. é apoiado pelo Programa Scientia da UNSW. L.A.K. é apoiado pelo Prêmio Iraty, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, uma bolsa R01EY027739 do Instituto Nacional de Olhos e a Atividade de Aquisição de Pesquisa Médica do Exército do Departamento de Defesa VR220059.

Novo sistema de monitoramento de OCR para culturas de EPR diferenciadas

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan e Kin Lo são funcionários da Lucid Scientific, que fabrica o sistema Resipher.

O metabolismo mitocondrial do EPR desempenha um papel crítico na patogênese de doenças retinianas comuns que causam cegueira, incluindo DMRI e RVP. A modelagem do metabolismo mitocondrial do EPR in vitro permite isolar seu estado metabólico daqueles dos tecidos circundantes, além de submeter o tecido a diferentes insultos simuladores de doenças de maneira controlada. Essa modelagem in vitro do metabolismo mitocondrial do EPR foi facilitada pelo advento de culturas primárias humanas e iPSC-RPE de alta fidelidade que atingem o estado de diferenciação e a polaridade adequados necessários para aproximar o EPR in vivo. Embora o monitoramento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) em tais culturas seja um método ideal para monitorar o metabolismo mitocondrial, a configuração do monitoramento do OCR geralmente impede o cultivo de culturas nas condições necessárias para RPE altamente polarizado e totalmente diferenciado. Aqui, descrevemos o Resipher como um novo sistema para monitorar o metabolismo mitocondrial do RPE por meio da avaliação em tempo real e de longo prazo do OCR em culturas de RPE altamente diferenciadas e polarizadas.
Outros métodos têm sido usados para monitorar o OCR no EPR. O Seahorse XF Analyzer foi projetado para monitorar o OCR em curtos períodos de tempo com manipulações agudas da função mitocondrial. No entanto, os ensaios de cavalos-marinhos exigem que as células sejam cultivadas em placas personalizadas, que não são propícias para suportar alta polaridade e diferenciação de RPE21. Calton, Vollarth e colegas adaptaram o cavalo-marinho para a avaliação de culturas de EPR altamente diferenciadas cultivadas em suportes microporosos, cortando a membrana microporosa em pedaços e colocando-os na placa do cavalo-marinho, mas esse método ainda funciona apenas para monitoramento de curto prazo de culturas, pois as células não têm acesso ao CO2 Durante o ensaio, o ensaio só pode ser feito em condições não estéreis, e o corte do suporte microporoso induzirá morte e disfunção na porção da borda do suporte microporoso ao longo do tempo22. O Barofuse é um sistema de perfusão sem bomba no qual tiras de EPR cultivadas em suportes microporosos podem ser carregadas no sistema de perfusão, permitindo que o OCR seja monitorado em tempo real23. Semelhante à configuração modificada para o Seahorse por Calton, Vollarth e colegas, as principais limitações da avaliação do EPR com Barofuse são a necessidade de cortar os suportes microporosos e a natureza de curto prazo do ensaio. O Oxygraph também foi projetado para mudanças cinéticas rápidas no OCR em resposta a manipulações metabólicas24. Não tem sido usado para culturas de EPR e sofreria as mesmas limitações para avaliar culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas que o cavalo-marinho e o Barofuse.
Em contraste com esses outros métodos, o sistema OCR descrito aqui permite o monitoramento do OCR enquanto o RPE é cultivado em placas/substratos de cultura de células padrão sob condições padrão com meio de RPE padrão em uma incubadora de CO2 de cultura de células padrão, fornecendo sondagem fácil e conveniente de culturas de RPE altamente diferenciadas e polarizadas. Além de gerar dados sobre alterações de OCR em tempo real pelo sistema, essas mesmas células podem ser utilizadas para ensaios adicionais no final do período de monitoramento de OCR. Isso permite experimentos altamente flexíveis em que o efeito de uma intervenção no OCR é testado repetidamente durante um período de semanas (por exemplo, - indução de EMT de EPR na Figura 5) ou onde a recuperação a longo prazo de uma intervenção pode ser testada (por exemplo, - recuperação do desacoplamento mitocondrial na Figura 3) ou onde as alterações metabólicas em cascata em resposta a uma intervenção inicial podem ser monitoradas (por exemplo, - efeitos do soro no OCR quando os nutrientes do meio são esgotados na Figura 3) 2). O sistema OCR neste artigo é particularmente conveniente para medir o OCR em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas. Essas culturas são funcionalmente pós-mitóticas, com empacotamento apertado e pigmentação pesada. Isso significa que cada poço contém números de células quase idênticos9, evitando assim a necessidade de normalizar o OCR para o número de células para a maioria dos experimentos. Mesmo quando a normalização para o número de células é necessária, a pigmentação pesada do EPR e as bordas celulares bem demarcadas permitem que a normalização ocorra com uma contagem de células simples não invasiva com base em imagens de campo claro. Para experimentos envolvendo RPE indiferenciado e proliferação de RPE, como os experimentos EMT na Figura 5, normalizar o OCR por poço para o número de células torna-se necessário para saber qual é o OCR "por célula".
Fora do campo retiniano, o sistema tem sido empregado para estudar a respiração celular e a atividade metabólica em vários tipos de células, incluindo células das ilhotas pancreáticas25, músculo esquelético26, câncer de ovário27, cardiomiócitos28 e até organismos inteiros, como C. elegans29. O monitoramento em tempo real e de longo prazo do OCR usando o sistema OCR descrito aqui revelou informações importantes sobre mudanças bioenergéticas e disfunção mitocondrial nesses diversos modelos de doenças.
O sistema Resipher carrega limitações. O método para determinar o OCR é fundamentalmente diferente do Seahorse Analyzer, BaroFuse ou Oxygraph. Requer o estabelecimento de um gradiente de O2 para calcular o OCR, e o gradiente pode levar horas para ser estabelecido. Assim, experimentos cinéticos rápidos, possíveis nos outros sistemas, não são possíveis com este sistema. Além disso, ao contrário dos outros sistemas, o Resipher não possui portas de injeção para a entrega rápida de pequenas moléculas ou coleta de metabólitos. Em vez disso, a tampa de detecção deve ser removida em uma capa de cultura de células, com drogas sendo enriquecidas ou meio substituído, juntamente com a coleta manual de metabólitos a serem analisados.
Para estabelecer e solucionar problemas de um experimento usando o sistema OCR descrito neste documento, recomenda-se o seguinte. Primeiro, minimize a evaporação. Lembre-se de que o gradiente de O2 na coluna de mídia acima da monocamada RPE é altamente dependente da altura da coluna9, e o sistema calcula o OCR com base no gradiente de O2 . Assim, se houver um rebaixamento acentuado da coluna de mídia durante o experimento devido à evaporação, o gradiente de O2 mudará, afetando as leituras de OCR. Manter a bandeja de água da incubadora cheia é fundamental, mas também é sugerido que a água seja colocada em todos os poços não utilizados da placa de 96 poços. Além disso, os poços na borda da placa têm taxas de evaporação mais altas, de modo que esses poços são deixados vazios de células nos experimentos típicos apresentados acima. O sensor de umidade no sistema OCR pode ajudar a monitorar a umidade da incubadora. Na Figura 8A, a queda na umidade durante o experimento sugere que a bandeja de água da incubadora está vazia. À medida que a evaporação acelera no poço, as leituras de concentração de O2 para o poço subirão mais alto e, eventualmente, "planarão" na concentração atmosférica de O2 (~ 200 μM) (Figura 8A).
Em segundo lugar, confirme se o "sanduíche" do sistema OCR está montado adequadamente. Os pontos de contato de metal na parte inferior do dispositivo e na parte superior da tampa de detecção devem estar limpos, sem detritos para impedir o contato total. O dispositivo e a tampa de detecção devem ser fixados totalmente nivelados e uniformemente alinhados na placa de 96 poços, sem qualquer inclinação. O cabo USB que conecta o dispositivo ao hub não deve estar tensionado, o que pode resultar em torque do "sanduíche" e restrição do movimento adequado do dispositivo.
Terceiro, certifique-se de que o dispositivo e os sensores da tampa de detecção estejam calibrados. A Figura 2B detalha como verificar rapidamente o funcionamento adequado do sensor no início de cada experimento. Quarto, certifique-se de que um poço específico não esteja demonstrando um OCR discrepante antes da manipulação experimental. Depois de garantir que os sensores estejam funcionando, determinar os valores de OCR de linha de base para todos os poços com células pode ajudar a determinar se certos poços contêm células não saudáveis. A Figura 8B mostra vários poços submetidos à avaliação de OCR de linha de base, nos quais o poço de cor azul demonstra claramente um OCR mais baixo (e, portanto, alta concentração de O2 ). Este poço é um outlier e deve ser excluído da manipulação experimental.
Quinto, minimize as manipulações ambientais durante as leituras ativas de OCR. O gradiente de O2 é altamente sensível a mudanças de temperatura, umidade, níveis de CO2 da incubadora e pressão atmosférica. A abertura da porta da incubadora afeta significativamente esses fatores, causando interrupções temporárias nas leituras de OCR até que o gradiente de O2 da coluna de mídia retorne ao equilíbrio (Figura 8C). Os parâmetros que afetam o OCR podem ser monitorados na interface on-line do sistema na guia "Ambiente" (Figura 8A).
Sexto, determine o volume de mídia ideal para o experimento. Embora o volume insuficiente do meio possa criar artefatos por evaporação excessiva (consulte a primeira medida de solução de problemas acima) ou exaustão prematura de nutrientes no meio, o volume excessivo do meio limita a disponibilidade de O2 para a monocamada do EPR, desencadeando hipóxia9. A Figura 7 é uma captura de tela da calculadora online disponível para determinar o efeito do volume de mídia na concentração de O2 na monocamada RPE. O OCR máximo possível para um determinado volume de mídia é exibido na Figura 9A. Se a taxa de OCR para um determinado experimento usando um determinado volume se aproximar da taxa exibida na Figura 9A, então a concentração de O2 na monocamada RPE se aproxima da anóxia (0%) e um volume de mídia menor é necessário. Em geral, experimentos envolvendo processos mitocondrialmente intensivos em cultura de EPR devem ter volumes de meio não superiores a 75 μL por 96 poços.
Sétimo, realizar a normalização apropriada para isolar os efeitos de uma intervenção experimental no OCR. Como poços diferentes podem ter OCR de linha de base diferente, é fundamental obter leituras de OCR de linha de base para cada poço antes de uma intervenção experimental. Subtraia o OCR basal do OCR após a intervenção experimental para obter o "Delta OCR", que demonstra o efeito da intervenção experimental no OCR. O método para obter "Delta OCR" é demonstrado na Figura 3 e na Figura 9B. Se alguém estiver interessado nos efeitos de uma intervenção experimental na capacidade de outra intervenção experimental de induzir OCR, é necessária uma etapa adicional de normalização, o "OCR Delta-Delta". Tal exemplo é ilustrado na Figura 9B, onde a capacidade do palmitato (uma intervenção experimental) de induzir aumento do OCR (via indução de β-oxidação) depende do tipo de meio para a cultura de EPR (uma segunda intervenção experimental).
Finalmente, minimize o risco de contaminação. O sistema monitora o OCR introduzindo um sensor de oxigênio na mídia acima das células. Isso aumenta o risco de infecção. Quedas inesperadas no OCR durante o experimento ou OCR inesperadamente baixo no início do experimento podem ser sinais de uma infecção. As placas precisam ser monitoradas ativamente quanto a infecções sob um microscópio de cultura de células. A contaminação cruzada entre placas de 96 poços pode ocorrer se uma tampa de detecção for reutilizada. Para minimizar essa contaminação cruzada, deve-se mergulhar toda a tampa em etanol a 70% por 20 minutos para descontaminação após a realização de um experimento, antes da reutilização da tampa de detecção em um novo experimento (consulte a seção 1.2.15 do protocolo).
Em conclusão, é apresentado um protocolo para monitoramento em tempo real e de longo prazo do metabolismo mitocondrial em culturas de EPR de alta fidelidade por meio da avaliação do OCR usando um novo sistema chamado Resipher. Ele pode ser usado para inúmeras aplicações em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas, em particular, sondando propriedades metabólicas fisiológicas de EPR isolado, bem como metabolismo alterado de EPR em modelos in vitro de doença da retina, incluindo DMRI e PVR.

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais funcionalmente pós-mitóticas e altamente polarizadas que formam uma barreira entre os fotorreceptores sensíveis à luz na retina e sua circulação sanguínea, um leito capilar denominado coriocapilar. Como o papel dos neurônios que sustentam a glia, o EPR realiza inúmeras funções para apoiar os fotorreceptores, incluindo fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, transporte de nutrientes e suporte metabólico para fotorreceptores e secreção de fatores essenciais de crescimento, todos críticos para manter a função visual.
A degeneração do EPR está subjacente a vários distúrbios degenerativos comuns da visão. Na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma das causas mais comuns de perda de visão incurável no mundo, o EPR morre e, portanto, os fotorreceptores sobrejacentes sofrem uma degeneração secundária. Na vitreorretinopatia proliferativa (PVR), o EPR sai de seu estado pós-mitótico normalmente quiescente, proliferando e se desdiferenciando em um estado mesenquimal (a chamada transição epitelial para mesenquimal [EMT]) com alterações em seu metabolismo. A desdiferenciação do EPR causa uma perda de suporte do EPR para os fotorreceptores, ao mesmo tempo em que desencadeia um estado mais fibrótico. Isso resulta tanto na degeneração dos fotorreceptores quanto na cicatrização induzida pelo EPR, que desencadeiam perda de visão 1,2.
A maior parte do suporte do EPR aos fotorreceptores é metabólico, e a desregulação metabólica é um fator crítico em várias doenças da retina, incluindo DMRI e PVR. O EPR serve como uma barreira regulatória entre os fotorreceptores e sua fonte de oxigênio e nutrientes, os coriocapilares. Assim, o que o EPR escolhe metabolizar versus o que o EPR escolhe passar do coriocapilar para os fotorreceptores governa fortemente o metabolismo e a sobrevivência dos fotorreceptores. Numerosos estudos mostraram que o EPR é fortemente dependente do metabolismo mitocondrial para sua saúde normal e que os fotorreceptores dependem fortemente da glicólise3. Isso introduziu o conceito de estados metabólicos complementares e entrelaçados entre os fotorreceptores e o EPR. Especificamente, o EPR reduz seu metabolismo de substratos metabólicos fotorreceptores preferidos e, em vez disso, utiliza os subprodutos do metabolismo dos fotorreceptores combinados com os metabólitos que os fotorreceptores não consomem. Em doenças como RVP e DMRI, as evidências sugerem fortemente que o EPR se torna mais glicolítico e menos dependente do metabolismo mitocondrial; essa mudança para a glicólise do EPR pode privar os fotorreceptores dos metabólitos de que necessita, desencadeando a degeneração 4,5,6. Dado o quão interdependentes são o EPR e o metabolismo dos fotorreceptores e o quanto o metabolismo alterado está subjacente à doença da retina, há um forte interesse em modelar e manipular o metabolismo do EPR para fins terapêuticos.
Embora o estudo do metabolismo mitocondrial do EPR in vivo seja ideal, muitos aspectos do metabolismo mitocondrial do EPR só podem ser investigados na prática em um sistema de cultura in vitro. Um progresso significativo em direção a culturas de EPR de alta fidelidade foi feito nas últimas décadas, a ponto de as culturas de EPR mais cuidadosamente preparadas agora estarem sendo usadas para terapia de reposição celular em ensaios clínicos em humanos7. Para manter essas culturas de alta fidelidade, o RPE precisa ser cultivado em substratos específicos em meios específicos por meses antes da experimentação. Com essas condições, as culturas de EPR são diferenciadas e polarizadas ao máximo, aproximando-se do EPR in vivo. Infelizmente, não há nenhum equipamento atualmente disponível que possa medir o metabolismo mitocondrial especificamente a partir do EPR in vivo. Embora o monitoramento de oxigênio da rede capilar da retina tenha sido obtido in vivo usando oximetria de ressonância paramagnética eletrônica (EPR)8, isso não é possível para a análise de RPE. As diferenças entre o metabolismo do EPR in vivo e in vitro não são bem descritas, mas as culturas de EPR demonstraram ter alta atividade mitocondrial, semelhante ao EPR in vivo 3,9, sugerindo que uma visão significativa do metabolismo mitocondrial do EPR pode ser obtida usando culturas de EPR de alta fidelidade.
Como todo metabolismo mitocondrial leva ao consumo de oxigênio, medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) do EPR é um proxy fiel para o metabolismo mitocondrial. Medir o OCR em culturas de EPR tem sido difícil, pois as condições que promovem a polarização e diferenciação máximas do EPR muitas vezes impedem medições precisas de OCR de longo prazo com as técnicas atualmente disponíveis, como o Seahorse Analyzer. Neste artigo de métodos, é introduzido um novo dispositivo, denominado Resipher (doravante denominado "o sistema"), que permite a medição contínua de OCR ao longo de semanas em RPE cultivado sob condições que promovem ao máximo a polarização e a diferenciação. A facilidade com que o OCR pode ser medido por este sistema em condições de cultura de EPR que promovem ao máximo a diferenciação e polarização de EPR é única entre os dispositivos de medição de OCR existentes.
Este artigo fornece dicas e truques para usar o sistema com culturas de EPR, seguido por uma demonstração de duas aplicações específicas. Primeiro, o EMT do RPE, imitando o PVR, é desencadeado pela exposição ao fator de crescimento transformador beta (TGFβ) 1 , 10 , 11 , 12 . O sistema é usado para monitorar como o metabolismo do EPR evolui durante o processo de EMT. Em segundo lugar, o papel da hipóxia no metabolismo do EPR é explorado usando este sistema. A hipóxia é um importante contribuinte para a patogênese da DMRI, pois a coriocapilar diminui com a idade13,14. A combinação desse sistema com câmaras de hipóxia permite modelar o metabolismo mitocondrial alterado do EPR com a hipóxia sutil que acompanha o envelhecimento. Finalmente, uma calculadora online usando dados do Resipher é introduzida para permitir determinar se as culturas de EPR estão em condições hipóxicas, normóxicas ou hiperóxicas. Essas informações são críticas para tirar conclusões sobre o metabolismo do EPR a partir de estudos de cultura de EPR in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td> <td># 25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3 ', 5-triiodo-L-tireonina sal de sódio</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32 canais Tampa Resipher</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A para Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A de streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inibidor do Complexo III da cadeia de transporte de elétrons</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Agente de desacoplamento para aumentar a respiração mitocondrial</td></tr><tr><td>DMSO, grau de cultura de células</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Veículo para reconstituição de drogas mitocondriais</td></tr><tr><td>Substratos de revestimento de matriz extracelular: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Matriz extracelular para hfRPE</td></tr><tr><td>Substratos de revestimento de matriz extracelular: Vitronectina</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Matriz extracelular para iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>Agente de desacoplamento para aumentar a respiração mitocondrial Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona-Ciclodextrina</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de hipóxia</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Suplemento de Mídia</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Sensor Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Tecnologia Sensit ou Detectores Forenses</td><td>P100 ou FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante TGF&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Fator de crescimento transformador beta-2 para induzir a transição epitelial-mesenquimal</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Inibidor do Complexo I da cadeia de transporte de elétrons</td></tr><tr><td>Placa compatível com o sistema</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Modificação Alfa da Mídia da Águia)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

O metabolismo mitocondrial é crítico para a função normal do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células na retina importante para a sobrevivência dos fotorreceptores. A disfunção mitocondrial do EPR é uma marca registrada da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido, e da vitreorretinopatia proliferativa (RVP), uma complicação ofuscante dos descolamentos de retina. As condições degenerativas do EPR foram bem modeladas por sistemas de cultura de EPR que são altamente diferenciados e polarizados para mimetizar o EPR in vivo . No entanto, o monitoramento das taxas de consumo de oxigênio (OCR), um proxy para a função mitocondrial, tem sido difícil em tais sistemas de cultura porque as condições que promovem a polarização e diferenciação ideais do RPE não permitem medições fáceis de OCR. 
Aqui, apresentamos um novo sistema, o Resipher, para monitorar o OCR por semanas a fio em culturas de EPR bem diferenciadas, mantendo o EPR em substratos de crescimento ideais e meios de cultura fisiológicos em uma incubadora de cultura de células padrão. Este sistema calcula o OCR medindo o gradiente de concentração de oxigênio presente no meio acima das células. Discutimos as vantagens deste sistema sobre outros métodos para detectar OCR e como configurar o sistema para medir OCR em culturas de EPR. Abordamos as principais dicas e truques para usar o sistema, cuidados sobre a interpretação dos dados e diretrizes para solucionar problemas de resultados inesperados. 
Também fornecemos uma calculadora on-line para extrapolar o nível de hipóxia, normóxia ou hiperóxia que as culturas de EPR experimentam com base no gradiente de oxigênio no meio acima das células detectadas pelo sistema. Finalmente, revisamos duas aplicações do sistema, medindo o estado metabólico das células RPE em um modelo PVR e entendendo como o RPE se adapta metabolicamente à hipóxia. Prevemos que o uso deste sistema em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas aumentará nossa compreensão do metabolismo mitocondrial de EPR, tanto em estados fisiológicos quanto em estados de doença.

Apresentamos um novo dispositivo para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) em culturas epiteliais pigmentares da retina (RPE). O dispositivo pode medir o OCR por semanas a fio em RPE cultivado em placas de cultura de células padrão com meio padrão, enquanto as placas estão em uma incubadora de cultura de células padrão.

Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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