Name: Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a caracterizar plaquetas pró-coagulantes humanas medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas por citometria de fluxo. Este protocolo permite quantificar a ativação plaquetária em estudos de hemostasia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisando a liberação de fosfatidilserina plaquetária e microvesículas

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A tubos de coleta de sangue</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Anexina-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apirase Grau VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glicose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Trombina&nbsp;</td><td>Hífen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2</td></tr><tr><td>O&alpha; Integrina IIb (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

A quantificação de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes é obtida usando a coloração com Anexina-V, com pelo menos 50.000 eventos registrados por amostra. Conforme declarado na etapa 2.2, as medições plaquetárias basais foram obtidas de amostras incubadas com tampão de reação, conforme ilustrado na Figura 1A. Os tamanhos das plaquetas foram medidos usando o valor mediano de dispersão direta (FSC). Embora o FSC seja influenciado por vários fatores, ele continua sendo um proxy comum para a estimativa do tamanho das células, incluindo a das plaquetas. Gráficos de densidade de área (Figura 1A) foram usados para identificar e bloquear plaquetas em repouso e microvesículas liberadas.
No caso de plaquetas não ativadas, menos de 2,9% apresentaram fosfatidilserina (PS) conforme determinado pela coloração com Anexina-V. Após a ativação das plaquetas lavadas com colágeno sozinho ou em conjunto com trombina ou ionóforo de cálcio, houve um aumento observável na exposição ao PS. O colágeno sozinho provocou um aumento de 26,7% nas plaquetas positivas para PS. A trombina teve efeitos mínimos na exposição ao PS (9,1%), mas quando associada ao colágeno, aumentou a porcentagem de plaquetas expostas ao PS para 36,2%. Para referência, o tratamento com ionóforo de 2 μM resultou em 49,6% das plaquetas se tornando pró-coagulantes.
A Figura 1 ilustra que a proporção basal de microvesículas de plaquetas lavadas em um indivíduo saudável foi mínima (0,3%). Enquanto a trombina e o colágeno aumentaram minimamente a formação de microvesículas, foi apenas com a combinação de colágeno e trombina que a formação de microvesículas aumentou significativamente (Figura 1D; 11,4%). A adição de ionóforo de 2 μM resultou em 44,0% das microvesículas formadas por plaquetas de controle expostas ao PS.
A Figura 2 fornece informações sobre a variação, repetibilidade e reprodutibilidade esperadas desse processo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Figura 1: Exposição ao PS e formação de microvesículas em plaquetas de controle em repouso e ativadas. As plaquetas foram ativadas ou não ativadas (repouso) (A), com 30 μg/mL de colágeno (B), com 0,5 U/mL de trombina (C), com combinações de colágeno e trombina (D) com ionóforo 2 μM. Os gráficos de pontos representativos exibem o tamanho das plaquetas (dispersão direta (log FSC)) versus a ligação Annexin-V. As linhas horizontais e verticais (E) delineiam a população plaquetária negativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Figura 2: Repetibilidade e reprodutibilidade da exposição ao PS e formação de microvesículas após incubação com ionóforo. Análise da exposição ao PS e formação de microvesículas após incubação com ionóforo de 2 μM ou 5 μM em plaquetas lavadas, tratadas ou não com citrato (um quelante de cálcio): (A) de 4 controles saudáveis diferentes; (B) de um controle saudável repetido 5 vezes; e (C) de dois controles saudáveis preparados por dois técnicos diferentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Contagem de plaquetas no sangue total (109 por mL)</td>
			<td>Forças centrífugas relativas (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Forças centrífugas relativas para preparação de plasma rico em plaquetas em relação à contagem de plaquetas no sangue total.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrato trissódico di-hidratado (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">O pH da solução não deve ser ajustado. Manter a solução a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Preparação de uma solução aquosa de 1 L de ácido-citrato-dextrose (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajuste o pH em 6,5. Manter a solução a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Preparação da solução de estoque de tampão de lavagem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% de albumina de soro bovino (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apirase</td>
			<td>31,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Preparação de uma solução extemporânea de 50 mL de tampão de lavagem da solução estoque.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>1,19 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM</td>
			<td>0,05 gramas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajuste o pH em 7,4. Manter a solução a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Preparação de uma solução de estoque de tampão de reação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% de albumina de soro bovino (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Preparação de uma solução extemporânea de 50 mL de tampão de reação a partir da solução estoque.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. As células-tronco progenitoras hematopoiéticas - isoladas do sangue do cordão umbilical humano - diferenciam-se em megacariócitos maduros na presença de trombopoietina. Os megacariócitos maduros produzem extensões citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dão origem a plaquetas individuais.

Um método in vitro para a diferenciação de megacariócitos e formação de plaquetas

Este vídeo demonstra o método para avaliar o impacto da tensão de cisalhamento nas plaquetas. O tratamento com anticorpos induz dissociação e alterações conformacionais nos complexos mecanorreceptores, ativando as plaquetas e expressando marcadores na superfície. Esses marcadores são observados por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Os efeitos do estresse de cisalhamento em plaquetas tratadas com anticorpos contra receptores mecanossensoriais

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Gestão de inventário de plaquetas com base no conteúdo de micropartículas em concentrados de plaquetas de rastreio é uma nova iniciativa de melhoria de qualidade em bancos de sangue do hospital. O objetivo é diferenciar registrados de plaquetas não está ativado para otimizar o uso de plaquetas. Fornecimento de plaquetas não está ativado para pacientes de Hematologia-Oncologia pode reduzir seu risco elevado para se tornar refratários.

Método de triagem para micropartículas em transfusões de plaquetas de rotina

Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.

Um ensaio de cisalhamento uniforme para receptores de superfície de células e plaquetas humanas através de Viscometry de cone-Plate

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.

Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

O presente protocolo fornece um conjunto abrangente de procedimentos necessários para analisar plaquetas pró-coagulantes, que exibem características sobrepostas de necrose, apoptose e ativação plaquetária.

Análise abrangente de plaquetas pró-coagulantes exibindo características de necrose, apoptose e ativação plaquetária

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Aprenda a caracterizar plaquetas pró-coagulantes humanas medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas por citometria de fluxo. Este protocolo permite quantificar a ativação plaquetária em estudos de hemostasia.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

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