Name: In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprenda a padronizar a injeção intravenosa de Leishmania infantum na veia gengival de hamsters dourados. Este método utiliza imagem bioluminescente para monitorar infecções em tempo real, oferecendo uma rota alternativa menos invasiva para estudos de patogênese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruiz-Postigo, J. A., et al. Global leishmaniasis surveillance, 2022: assessing trends over the past 10 years. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuiz-Postigo%2C+JA+%22WHO%2C+Weekly+epidemiological+record+n%C2%B0+40%22">WHO, Weekly epidemiological record n° 40</a>. , (2023).</li>
<li>Faraut-Gambarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+resistance+of+Leishmania+infantum+to+meglumine+antimoniate%3A+a+study+of+37+strains+collected+from+patients+with+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo resistance of Leishmania infantum to meglumine antimoniate: a study of 37 strains collected from patients with visceral leishmaniasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (4), 827-830 (1997).</li>
<li>Ribeiro-Romão, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+lesion+development%2C+tissue+damage%2C+and+cytokine+expression+in+golden+hamsters+%28Mesocricetus+auratus%29+infected+by+inocula+with+different+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of lesion development, tissue damage, and cytokine expression in golden hamsters (Mesocricetus auratus) infected by inocula with different Leishmania (Viannia) braziliensis concentrations.</a> Infect Immun. 82 (12), 5203-5213 (2014).</li>
<li>Gomes-Silva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+as+an+experimental+model+for+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model for Leishmania (Viannia) braziliensis infection.</a> Parasitology. 140 (6), 771-779 (2013).</li>
<li>Moreira, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hematological+and+biochemical+alterations+in+hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+experimentally+infected+with+Leishmania+infantum+through+different+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">hematological and biochemical alterations in hamster (Mesocricetus auratus) experimentally infected with Leishmania infantum through different routes of inoculation.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 181-194 (2016).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Leishmania+infantum+genetic+marker+associated+with+miltefosine+treatment+failure+for+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Leishmania infantum genetic marker associated with miltefosine treatment failure for visceral leishmaniasis.</a> EBioMedicine. 36, 83-91 (2018).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+resistance+of+Leishmania+infantum+to+miltefosine+contributes+to+the+low+efficacy+in+the+treatment+of+visceral+leishmaniasis+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Natural resistance of Leishmania infantum to miltefosine contributes to the low efficacy in the treatment of visceral leishmaniasis in Brazil.</a> Am J Trop Med Hyg. 101 (4), 789-794 (2019).</li>
<li>Moreira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+continuous+axenic+cultivation+in+Leishmania+infantum+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).</li>
<li>Fortin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+oleylphosphocholine+%28OlPC%29+in+a+laboratory+model+of+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of oleylphosphocholine (OlPC) in a laboratory model of visceral leishmaniasis.</a> J Antimicrob Chemother. 67 (11), 2707-2712 (2012).</li>
<li>Rodrigues, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gingival+vein+is+a+minimally+traumatic+site+for+multiple+blood+sampling+in+guinea+pigs+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The gingival vein is a minimally traumatic site for multiple blood sampling in guinea pigs and hamsters.</a> PLoS ONE. 12 (5), e0177967(2017).</li>
<li>Oliveira, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+report%3A+Gingival+vein+punction%3A+A+new+simple+technique+for+drug+administration+or+blood+sampling+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Technical report: Gingival vein punction: A new simple technique for drug administration or blood sampling in rats and mice.</a> Scand J Lab Anim Sci. 36 (2), 109-113 (2009).</li>
<li>Saeij, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+Toxoplasma+gondii+infection+in+living+mice+reveals+dramatic+differences+between+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of Toxoplasma gondii infection in living mice reveals dramatic differences between strains.</a> Infect Immun. 73 (2), 695-702 (2005).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 41, e1980(2010).</li>
<li>Andriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+in+vivo+of+anti-Trypanosoma+cruzi+compounds+selected+from+a+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Activity in vivo of anti-Trypanosoma cruzi compounds selected from a high throughput screening.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (8), e1298(2011).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mice+infected+with+bioluminescent+Trypanosoma+cruzi+unveils+novel+sites+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mice infected with bioluminescent Trypanosoma cruzi unveils novel sites of infection.</a> Parasit Vectors. 7, 89(2014).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+of+Trypanosoma+cruzi+infection+in+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging of Trypanosoma cruzi infection in Rhodnius prolixus.</a> Parasit Vectors. 26 (5), 214(2012).</li>
<li>Sereno, D., Lemesre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenically+cultured+amastigote+forms+as+an+in+vitro+model+for+investigation+of+antileishmanial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Axenically cultured amastigote forms as an in vitro model for investigation of antileishmanial agents.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 972-976 (1997).</li>
<li>Lachaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+two+PCR+methods+for+the+diagnosis+of+canine+visceral+leishmaniasis+and+the+detection+of+asymptomatic+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Value of two PCR methods for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and the detection of asymptomatic carriers.</a> Parasitology. , 197-207 (2002).</li>
<li>Blood sampling Microsite. , National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in research (NC3RS). 
 <a target="_blank" href=" https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster"> https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster</a> (2021).</li>
<li>Bolhassani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Leishmania+species%3A+development+of+stable+GFP+expression+and+its+application+for+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies.</a> Exp Parasitol. 127 (3), 637-645 (2011).</li>
<li>Mendes Costa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+infection+with+bioluminescent+Leishmania+infantum+axenic+amastigotes+applied+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Murine infection with bioluminescent Leishmania infantum axenic amastigotes applied to drug discovery.</a> Sci Rep. 9 (1), 18989(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Escada de 1 kb</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td></td></tr><tr><td>Acetil coenzima A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, LE, Grau Analítico</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>aprt reverse primer A1715 aprt reverse primer A1715</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-111</td><td></td></tr><tr><td>BamHI 10 U/ mL</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td></td></tr><tr><td>BglII 10 U / mL</td><td>Promega</td><td>R6071</td><td></td></tr><tr><td>infusão de cérebro e coração (BHI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (cloridrato de cetamina 10%)</td> <td>Uso</td> veterinário <td>Syntec</td><td>. Anestésico. Solução injetável contendo um frasco para injetáveis de 10 mL de cloridrato de cetamina a 10%.</td></tr><tr><td>Dextrose Glicose, BD Diagnostics</td><td>Difco</td><td>215530</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina sal de potássio</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>eletroporador Gene Pulser Xcell&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>vitrocell/embriolife</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-plateTM PLUS&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap 1652082</td><td>Bio-Rad</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.4 cm gap 1652081&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Polimerase de platina</td><td>Fischer Scientific</td><td>10-966-034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA Polimerase</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Hemin em pó</td><td>em laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>hyg forward primer A3804</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-109</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>ISOFORINE</td><td>Cristalia</td><td></td><td>Solução inalatória em embalagens contendo 1 frasco de 100 e 240 mL de isoflurano</td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>Perkin Elmer</td><td>ISO838N4625</td><td></td></tr><tr><td>JM109 Células Competentes</td><td>Promega</td><td>&nbsp; L2005</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA/HindIII Marcador</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>SM0101</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem viva</td><td>Perkin Elmer-NotI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6431</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico, 25:24:1 (v/v), Grau de Biologia Molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered sally (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>plasmid pLEXSY-hyg2&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>EGE-232</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midi de Plasmídeos QIAGEN&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & Kit de Limpeza em Gel</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763 Sigma-Al</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax2 microplate reader</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssu forward primer F3001 primer F3001</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-105</td><td></td></tr><tr><td>ssu primer reverso F3002 ssu primer reverso F3002</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-104</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>SwaI 10 U/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1241</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase 1 U/mL</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>T4 sistema de ligação rápida</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td> Placa <td></td><td>de 96 poços Veritiy</td> <td>da Applied Biosystems</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787 Caldo de Soja Tríptico Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>(Meio de Digestão de Soja-Caseína)</td><td>Difco-BD</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Racks ventilados&nbsp;</td><td>Alesco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com Earle&prime; s sais e L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, pó,&nbsp;</td><td>Merck</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (cloridrato de xilazina 2%)</td><td>Uso</td><td></td> <td>veterinário. Sedativo, analgésico e miorrelaxante. Solução injetável contendo um frasco para injetáveis de 10 ml de cloridrato de xilazina a 2%.</td></tr><tr><td>Kit de Clonagem PCR TOPO Zero Blunt&nbsp;</td><td>Thermo Fischer&nbsp;</td><td></td><td></td>451245</tr></tbody></table>

in vivo imagem de hamsters infectados por leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

In Vivo Imaging of Leishmania infantum-infected Hamsters by Gingival Inoculation of Axenic Amastigotes Expressing Luciferase

Expressão estável de luciferase em L. infantum L . infantum geneticamente modificado foi produzido utilizando o plasmídeo da linhagem pLEXSY, que se integra ao genoma de Leishmania no locus ribossômico 18S rRNA (ssu), cuja transcrição é conduzida pela RNA polimerase I. Assim, clones de L. infantum-Luc foram avaliados quanto à integração de plasmídeos no genoma de Leishmania, e quanto à expressão estável por emissão de bioluminescência in vitro. O clone altamente expressivo exibindo bioluminescência &gt;120 vezes acima do fundo foi escolhido para avaliação da integração genômica por PCR. Veja a Figura 1 para eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR para avaliar a integração do plasmídeo no genoma e a emissão de bioluminescência (RLU) de promastigotas do clone de L. infantum-Luc. Fragmentos do tamanho esperado foram obtidos de cada PCR; Um produto de aproximadamente 1,1 kB (5'ssu - UTR1) e outro de 1,8 kb (Hyg-3'ssu) foram amplificados a partir do genoma de L. infantum-Luc (Figura 1A), confirmando a integração do plasmidial e do gene da luciferase no locus ssu do genoma de L. infantum .
A expressão de luciferase de vaga-lume também foi avaliada em promastigotas de L. infantum-Luc por emissão de bioluminescência (RLU) no leitor de microplacas, conforme descrito nos protocolos, seção 2. Mesmo após várias passagens em cultura e em camundongos BALB/c por 5 dias, manteve o nível de bioluminescência; 569,3 ± 19,5 para o tipo selvagem e 59361,9 ± 2673,3 (n = 2) para L. infantum-Luc clonado (Figura 1B). Assim, o clone de L. infantum-Luc expressando de forma estável a luciferase do vaga-lume, foi usado para infectar hamsters por via intragengival ou intraperitoneal.
Inóculo intravenoso na veia gengival Para inocular a Leishmania na corrente sanguínea de hamsters, deve-se tomar cuidado para minimizar a perfuração da veia, sangramento e vazamento do inóculo. Assim, o lábio inferior deve ser puxado suavemente para baixo para expor a veia gengival (Figura 2A); e uma agulha de calibre menor de 30 G deve ser usada para evitar perfuração excessiva da veia. A agulha deve ser posicionada com a moldura voltada para cima para ser inserida na veia em um ângulo adequado (Figura 2B). De fato, para garantir que a agulha foi injetada no vaso - a veia labial mandibular, o êmbolo da seringa deve ser puxado para baixo até que o sangue seja aspirado para o corpo da agulha (Figura 2C). Antes da remoção da agulha, uma leve pressão deve ser aplicada com um cotonete para promover a hemostasia (Figura 2D).
Avaliação longitudinal por imagem de bioluminescência Hamsters infectados intraperitonealmente (IP) ou via intragengival (IG) com L. infantum-Luc foram acompanhados até o50º dpi e avaliados por imagem de bioluminescência até 22 dpi (Figura 3). As imagens foram adquiridas 2 h após a infecção intraperitoneal com 108 parasitas na cavidade peritoneal; As imagens foram adquiridas por 30 s ou 1 min de meio de exposição binning. O sinal de bioluminescência foi &gt;65 vezes mais intenso no abdome nos animais infectados por amastigotas (4,6 × 105 ± 3,7 × 105) do que nos infectados por promastigotas (6,8 × 103 ± 3,8 × 103) (Tabela 1), o que demonstra que as amastigotas diferenciadas in vitro são mais bioluminescentes do que as promastigotas metacíclicas na fase estacionária e purificadas no coxim de Ficoll.
Um dia após a infecção (1 dpi), as imagens de bioluminescência foram adquiridas por 3 min de exposição (Figura 3). Houve uma diminuição de 45% no sinal de bioluminescência na região abdominal em hamsters infectados por promastigotas e 70% de decaimento em hamsters infectados por amastigotas (Figura 3), o que sugere que as amastigotas se degradaram em maior extensão do que as promastigotas metacíclicas (Tabela 1 e Figura 4). Uma semana após a infecção (8 dpi), os animais infectados com promastigotas mantiveram o sinal de bioluminescência (3,3 × 103 ± 5 × 103). No entanto, a emissão de bioluminescência em hamsters infectados com amastigotas caiu 95%, de 1,3 × 105 ± 1,1 × 105 para 6,7 × 103 ± 7,5 × 103 (Tabela 1) e atingiu o mesmo nível de hamsters infectados com promastigotas. Três semanas após a infecção (22 dpi), um sinal de bioluminescência foi adquirido por 5 min de exposição e binning large (Figura 3); o sinal foi muito menor para os animais infectados por promastigotas e amastigotas (Tabela 1 e Figura 4).
Outro grupo de hamsters foi infectado por via intragengival com amastigotas e promastigotas de L. infantum-Luc (10,8); a emissão de bioluminescência foi observada na região maxilar (Figura 3). O acompanhamento começou 1 dia após a infecção, e os hamsters infectados com amastigotas exibiram mais sinal de bioluminescência e radiância (7,3 × 103 ± 4,1 × 103) do que os infectados com promastigotas (1 × 103 ± 5,7 × 102). Uma semana após a infecção (8 dpi), foi observada uma queda de 36% no sinal de bioluminescência nos animais infectados com promastigotas e de 90% nos hamsters infectados com amastigotas; a radiância variou de 7,3 × 103 ± 4,1 × 103 a 7,8 × 102 ± 5,6 × 102 (Tabela 1). Três semanas após a infecção (22 dpi), um sinal de bioluminescência também foi adquirido por 5 min de exposição e binning large (Figura 3). O sinal de bioluminescência foi semelhante e baixo para os animais infectados com promastigotas e amastigotas (Tabela 1 e Figura 4) na cabeça dos animais infectados na gengiva e não foi observada dispersão da infecção para a região abdominal pelo sinal de bioluminescência.
Avaliação da infecção em tecidos e órgãos por PCR Realizamos PCR convencional para investigar infecção em órgãos específicos, como fígado, baço e linfonodos, que poderiam estar abaixo do limite de detecção da imagem in vivo . A região alvo do kDNA foi mais específica para a amplificação do DNA de L. infantum em tecidos e órgãos infectados, e a PCR para a enzima GAPDH do hamster foi um controle da integridade do DNA e da reação de PCR. Apenas as amostras que foram amplificadas para GAPDH foram consideradas na análise. Assim, por PCR, dois dos três hamsters infectados por via intraperitoneal com amastigotas axênicas apresentaram infecção em tecidos e órgãos; animal dois (A2) no baço e animal três (A3) no fígado, a 50 dpi (Figura 5A). Um hamster foi infectado intraperitonealmente com promastigotas axênicos; o animal três (A3) (Figura 5B) apresentou amplificação no linfonodo. Hamsters inoculados intragengivalmente com promastigotas ou amastigotas axênicas a 50 dpi não puderam apresentar uma amplificação clara - apenas uma faixa no fígado do animal um (A1) infectado com promastigotas (Figura 5C). Notavelmente, tivemos três animais mantidos por 8 meses cujo inóculo entregue pela via intragengival com amastigotas vazou levemente durante a injeção. Dois dos três animais apresentaram uma infecção clara no fígado, os animais um e dois (Figura 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig01.jpg"> 
Figura 1: Avaliação do clone de Leishmania infantum-Luc por PCR e emissão de bioluminescência. (A) Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR para avaliar a integração do plasmídeo no genoma: pista 1 - 1 kb escada de DNA; PCR do DNA genômico de L. infantum-Luc, pista 2 - 5'ssu - utr1 (1,1 kb) e pista 3- hyg- 3'ssu (1,8 kb); PCR de DNA genômico de L. infantum-wt, pistas 4 e 5. (B) Emissão de bioluminescência (RLU) de promastigotas do clone de L. infantum-Luc (106) no leitor de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig02.jpg"> 
Figura 2: Injeção intravenosa de Leishmania infantum-Luc na veia gengival. (A) O hamster foi colocado em decúbito dorsal e o lábio inferior foi puxado para baixo. (B) Uma agulha mais fina (8 x 0,30 mm) acoplada a uma seringa de 1 mL foi posicionada abaixo dos incisivos inferiores ao longo da linha média entre o par de dentes em um ângulo de 25º e inserida 2-4 mm na veia labial inferior. (C) Inoculação de 50 μL (108) de amastigotas ou promastigotas em PBS. (D) Hemostasia usando um cotonete e aplicando uma leve pressão no local da inoculação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig03.jpg"> 
Figura 3: Acompanhamento por imagem de bioluminescência in vivo . Imagens representativas de um animal por grupo: Infectado via intraperitoneal (painéis superiores) ou intragengival (painéis inferiores), com amastigotas ou promastigotas de L. infantum-Luc, por 1, 8 e 22 dpi. ROI vermelho representando as regiões sondadas no abdômen e na cabeça, para infecção intraperitoneal ou intragengival, respectivamente. Os dados mostram que a 1 dpi, todos os animais apresentaram sinal de bioluminescência no abdômen ou mandíbula. O sinal estava caindo após 8 dpi e era quase indetectável em qualquer grupo a 22 dpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig04.jpg"> 
Figura 4: Análise comparativa da radiância das imagens de bioluminescência. A quantificação de radiância photons.sec-1.cm-2.sr-1 foi realizada no abdômen ou na cabeça de hamsters com ferramentas manuais de medição de ROI. O ROI médio de fundo foi subtraído do ROI de medição para remover qualquer sinal espúrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig05.jpg"> 
Figura 5: Amplificação de kDNA por PCR. (A) IP-AMA, hamsters infectados por via intraperitoneal com amastigota, 50 dpi (n = 3); (B) IP-PRO, infectado por via intraperitoneal com promastigotas, 50 dpi (n = 3); (C) IG-AMA, infectado por via intragengival com amastigota (n = 2), IG-PRO, infectado por via intragengival com promastigota (n = 2); (D) IG-AMA, infectado por via intragengival com amastigota, 8 meses após a infecção (n = 3). NI, hamsters não infectados como controle negativo (n = 2); C- DNA genômico de L. infantum-Luc, controle positivo de PCR. Tecidos e órgãos: 1- baço, 2- fígado, 3- gânglios linfáticos. MW- marcador de peso molecular, as setas indicam as bandas de peso molecular mais baixas. A1- animal um, A2- animal dois e A3- animal três. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">Dpi</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Amastigotas IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Promastigotas IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Amastigotas IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Promastigotas IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">Significar</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significar</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significar</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significar</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">0</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,6 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,7 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">1</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,3 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,1 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">4.1 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">1.0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,7 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">8</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,7 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5.0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,8 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,4 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,2 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">22</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">9,9 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,6 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">4.6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,0 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,5 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Dados brutos da análise comparativa de radiância de imagens de bioluminescência. Quantificação de radiância média de fótons.seg-1.cm-2.sr-1 por grupo e rota. Abreviaturas: dpi = dias pós-infecção; DP = desvio padrão; N = tamanho da amostra.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

American tegumentary leishmaniasis (ATL) and visceral leishmaniasis (VL) are considered neglected by the World Health Organization. VL can be lethal if ...

in-vivo-imaging-leishmania-infantum-infected-hamsters-gingival

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Otimização do modelo de hamster experimental da leishmaniose cutânea por injeção intradérmica...

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Um ensaio de parasita resgate e transformação com células infectadas...

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de...

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos...

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .

Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

Aqui, apresentamos um protocolo compilado para avaliar a infecção cutânea de camundongos com Leishmania amazonensis. Este é um método confiável para estudar a virulência parasite, permitindo uma visão sistêmica da resposta do hospedeiro vertebrado à infecção.

In Vivo Infecção com Leishmania amazonensis avaliará virulence parasita em camundongos

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Aprenda a padronizar a injeção intravenosa de Leishmania infantum na veia gengival de hamsters dourados. Este método utiliza imagem bioluminescente para monitorar infecções em tempo real, oferecendo uma rota alternativa menos invasiva para estudos de patogênese.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase (Vídeo) | JoVE Journal

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

Explorar mais vídeos