Name: Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Explore um modelo in vitro para estudar a diferenciação de células epiteliais das vias aéreas murinas expostas a extrato de fumaça de cigarro. Este método auxilia na compreensão dos mecanismos celulares da DPOC.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82090013).

O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020-100) para atender aos requisitos das diretrizes ARRIVE7.
1. Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas das traqueias murinas
<ol><li>Preparação<ol><li>Prepare o meio de expansão completo combinando 1 mL de suplemento 50x e 0,05 mL de estoque de hidrocortisona com 48,95 mL de meio basal de expansão. Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.</li>
		<li>Dissolva 7,5 mg de proteinase e 5 mg de desoxirribonuclease I em 5 mL de F-12 de Ham para preparar uma solução de proteinase. Filtre-o para esterilizar e armazenar a 4 °C e use dentro de 4 semanas.</li>
		<li>Prepare soluções antibióticas adicionando 0,05 mL de penicilina/estreptomicina 100x e 0,01 mL de gentamicina/anfotericina 500x a 5 mL de meio de expansão completo, PBS e solução de proteinase (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 U/mL, gentamicina 10 μg/mL e 0,25 μg/mL de anfotericina B). Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.</li>
		<li>Esterilize os instrumentos cirúrgicos e prepare a cabine de segurança biológica para o isolamento celular. Simultaneamente, certifique-se de que o equipamento padrão de cultura de células esteja pronto para uso.</li>
		<li>Prepare pratos revestidos com colágeno de cauda de rato adicionando colágeno de cauda de rato (100 μg / mL em ácido acético 0,02 N) em placas de cultura de 100 mm e transwells de 24 mm (0,05 mL / cm2). Deixe aberto durante a noite sob luz ultravioleta para esterilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas<ol><li>Use camundongos C57BL / 6 (6-8 semanas de idade, machos, levantados com FPS) para isolamento de células epiteliais traqueais. Eutanasiar com overdose de solução de pentobarbital sódico a 1% (cerca de 200 mg/kg). Use cinco camundongos para obter rendimento celular suficiente.</li>
		<li>Esterilize o camundongo por imersão em solução de etanol a 75%, não mergulhando o nariz e a boca em álcool para evitar que o álcool flua para a traqueia.</li>
		<li>Disseque o mouse.<ol><li>Use lâminas cirúrgicas e fórceps, um conjunto de dispositivos para cortar e abrir a epiderme da mandíbula inferior até a cavidade abdominal do camundongo.</li>
			<li>Use outro conjunto de instrumentos cirúrgicos para separar as glândulas tireoides de ambos os lados e remover as conexões entre a traqueia, o tecido muscular circundante e o esôfago.</li>
			<li>Depois disso, corte cuidadosamente o peito, use uma pinça para mergulhar mais fundo na cavidade torácica, retire todo o pulmão e encontre o final da traqueia.</li>
		</ol></li>
		<li>Processe a traqueia.<ol><li>Corte a traqueia da cartilagem tireóide até o ramo traqueobrônquico e coloque-a em um meio de expansão pré-frio contendo quatro antibióticos.</li>
			<li>Agite o tubo para enxaguar o máximo de sangue possível da superfície da traqueia, mantenha-o no gelo e inicie a cirurgia para o próximo camundongo.</li>
		</ol></li>
		<li>Transfira todas as traqueias coletadas para o tampão PBS pré-resfriado contendo quatro antibióticos (200 U / mL de penicilina, 200 U / mL de estreptomicina, 20 μg / mL de gentamicina e 0,5 μg / mL de anfotericina B) para pré-tratamento antes da digestão.</li>
		<li>Use um conjunto de instrumentos cirúrgicos para remover coágulos e outros tecidos das superfícies da traqueia e, em seguida, corte-os no tamanho 1 cm2 .</li>
		<li>Incubar o tecido traqueal em solução de proteinase a 37 °C durante 40 min.</li>
		<li>Após 40 min, balance o tubo várias vezes e use um filtro de células de 40 μm para remover os tecidos restantes. Lave as traqueias picadas em uma peneira com 5 mL de meio de expansão, centrifugue a suspensão celular a 400 x g por 5 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspenda as células obtidas em 8 mL de meio de expansão.</li>
		<li>Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.</li>
		<li>Suspensão de células da placa P0 em placas de 100 mm (1 x 104 células vivas/cm2) pré-revestidas com colágeno de cauda de rato e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura de expansão e passagem de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas
<ol><li>Substitua o meio para a cultura de células P0 a cada 3 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência, geralmente dentro de 6 dias. Nesse ponto, as células epiteliais traqueais murinas podem formar uma monocamada intacta com aparência de paralelepípedo (Figura 1A-D).</li>
	<li>Pré-aqueça volumes suficientes de PBS, meio de expansão completo e kit de dissociação celular sem componentes animais (ACF) a 37 °C.</li>
	<li>Enxágue suavemente as células com 3 mL de PBS.</li>
	<li>Realize a dissociação enzimática.<ol><li>Adicione 3 ml de solução de dissociação enzimática ACF à cápsula e incube a 37 °C durante 5 min. Após a pipetagem, desalojar as células suavemente e transferir a suspensão celular para 3 ml de solução de inibição enzimática ACF.</li>
		<li>Repita a adição de 3 mL de solução de dissociação enzimática ACF e incube novamente por 5 min para garantir o descolamento máximo das células.</li>
	</ol></li>
	<li>Girar a suspensão celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda as células em 1 mL de meio de expansão.</li>
	<li>Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.</li>
	<li>Suspensão de células da placa P1 em vários pratos de 100 mm (5 x 104 células vivas/cm2) pré-revestidos com colagénio de cauda de rato e cultura das células numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2.</li>
</ol>3. Diferenciação e estimulação de CSE de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas na interface ar-líquido
<ol><li>Confirme o tipo de célula.<ol><li>Verificar a origem epitelial das células isoladas usando um ensaio de imunofluorescência (IFA) com anticorpos contra citoqueratinas. As células da semente em lâminas de vidro revestidas por colágeno de cauda de rato usam paraformaldeído para fixá-las por pelo menos 12 h após as células atingirem 80% de confluência.</li>
		<li>Lave as lâminas 3 vezes com solução de PBS por 5 min e incube-as com 3% de BSA e 0,1% de triton X-100 em solução de PBS em temperatura ambiente (RT) por 1 h.</li>
		<li>Incubar as lâminas durante a noite a 4 °C com anticorpo anticitoqueratina anti-pan comercial a uma diluição de 1:500.</li>
		<li>No dia seguinte, lavar as lâminas 3 vezes com solução de PBS durante 5 min e incubá-las com tampão de anticorpos secundários a uma diluição de 1:1000 em RT durante 2 h no escuro.</li>
		<li>Após a incubação, lave as lâminas 3 vezes com PBS (5 min por lavagem) e adicione DAPI a uma diluição de 1:1000. Após incubação em RT por 15 min, lave as lâminas uma vez com PBS por 5 min.</li>
		<li>Observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência e compare os padrões de expressão com um controle positivo (linha celular A549) e um controle negativo (linha celular Raw264.7) (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Semeie as células para diferenciação.<ol><li>Separar e centrifugar as células P2 conforme descrito anteriormente e ressuspender o sedimento celular em um volume apropriado de meio de expansão para facilitar o plaqueamento de 1 x 104 células vivas/cm2.</li>
		<li>Pipete 1 mL de suspensão celular na câmara apical da inserção da membrana de policarbonato transwell. No compartimento basal do transpoço, adicione 1,5 mL de meio de proliferação.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar as células a 37 °C e mudar completamente todo o meio nas câmaras basal e apical a cada 3 dias usando meio de expansão até atingir a confluência. Isso normalmente leva de 3 a 6 dias.</li>
	<li>Prepare 50 mL de meio de diferenciação completo adicionando 5 mL de suplemento ALI 10x, 500 μL de suplemento de manutenção ALI, 100 μL de solução de heparina e 250 μL de solução estoque de hidrocortisona a 44,15 mL de meio basal ALI.</li>
	<li>Prepare CSE.<ol><li>Borbulhe um cigarro através de 12,5 mL de meio de diferenciação e, em seguida, filtre-o através de um filtro de poros de 0,22 μm para preparar o CSE. Para garantir a padronização entre experimentos e lotes de CSE, medir a absorbância a 320 nm em um espectrofotômetro e definir a densidade óptica (DO) de 1 como 100%8.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizar o meio de diferenciação que contém uma concentração adequada de CSE para estimular as células epiteliais primárias das vias aéreas murinas a fim de detectar efeitos na diferenciação das células.</li>
	<li>Permitir que as células se diferenciem durante 28 dias, durante os quais o meio da câmara basal é mudado e o lado apical é lavado duas vezes por semana, removendo o meio da câmara apical e substituindo o meio da câmara basal pelo meio de diferenciação que contém a concentração adequada de CSE.</li>
	<li>Analise as células pós-exposição.<ol><li>Após a exposição ao meio de diferenciação contendo CSE, colher as células e os sobrenadantes da cultura a qualquer momento (ou seja, 0-28 dias) para detectar alterações morfológicas (ou seja, ensaio de imunofluorescência (IFA) ou coloração de hematoxilina-eosina (HE) ou para procedimentos analíticos de bioinformática (ou seja, transcriptômica, proteômica, metabolômica, etc.).</li>
	</ol></li>
</ol>

Modelo in vitro de células epiteliais das vias aéreas murinas e exposição crônica à fumaça

<ol><li>Ritchie, A. I., Martinez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+defining+early+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population.</a> Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).</li>
<li>Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+cigarette+smoking-induced+stable+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD.</a> Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).</li>
<li>Leino, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+disrupting+effects+of+alternaria+alternata+extract+on+bronchial+epithelium+from+asthmatic+donors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors.</a> PLoS One. 8 (8), e71278(2013).</li>
<li>Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+characteristics+of+the+progenitor+bronchial+epithelial+cell+line+VA10%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10.</a> Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).</li>
<li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respir Res. 14 (1), 135(2013).</li>
<li>Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+stem+cell+differentiation+in+an+in+vitro+airway+model%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosc%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model.</a> Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+research%3A+Reporting+in+vivo+experiments%3A+The+ARRIVE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li>
<li>Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXJ1+prevents+cilia+growth+inhibition+by+cigarette+smoke+in+human+airway+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).</li>
<li>Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+open+chromatin+regions+in+plant+genomes+using+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq.</a> Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).</li>
<li>Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+the+pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.+Smoking-induced+reprogramming+of+airway+epithelial+basal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells.</a> Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).</li>
<li>Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+airway+epithelial+injury+and+abnormal+repair+in+asthma+and+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD.</a> Front Immunol. 14, 1201658(2023).</li>
<li>Zhou, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke-initiated+autoimmunity+facilitates+sensitisation+to+elastin-induced+COPD-like+pathologies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice.</a> Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).</li>
<li>Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), e2513(2011).</li>
<li>You, Y., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).</li>
<li>Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+chloral+hydrate+sedation+in+infants+for+pulmonary+function+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Paul+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests.</a> Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).</li>
<li>Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-liquid+interface+culture+of+human+and+mouse+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).</li>
<li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+contamination+with+Candida+albicans+during+the+fabrication+of+transplantable+oral+mucosal+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets.</a> Regen Ther. 1, 1-4 (2015).</li>
<li>Culp, D. J., Latchney, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucinlike+glycoproteins+from+cat+tracheal+gland+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture.</a> Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+human+air-liquid-interface+organotypic+airway+tissue+models+derived+from+primary+tracheobronchial+epithelial+cells-overview+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).</li>
<li>Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+oxygenation+promotes+CFTR+maturation+and+trafficking+in+MDCK+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes10. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença11. Nesse ponto de vista, esclarecer como as células epiteliais mudam e regulam as células a jusante sob a estimulação de substâncias nocivas é um problema científico que precisa ser resolvido com urgência.
Recentemente, vários modelos animais de DPOC que superaram algumas limitações foram relatados12. Níveis moderados de inflamação neutrofílica das vias aéreas, assinatura inflamatória Th1/Th17, hiperprodução acentuada de muco, aumento da remodelação das vias aéreas, declínio da função pulmonar e aumento do espaço aéreo podem ser observados nesses modelos. Embora esses modelos exijam apenas 1 mês para estabelecer alterações semelhantes à DPOC, o que aconteceu nos camundongos expostos à fumaça do cigarro em 1 mês ainda não está claro. O uso da estimulação CSE de longo prazo tem a vantagem de ser mais facilmente calibrado, o que significa que as células epiteliais das vias aéreas podem ser expostas ao estímulo do cigarro o mais severo possível sem morte, assim como as células epiteliais das vias aéreas em fumantes. Nesse caso, o monitoramento das alterações patológicas dinâmicas que levam à inflamação das vias aéreas e à formação de enfisema é fundamental para uma melhor compreensão da patogênese da DPOC relevante para o tabagismo. Portanto, estabelecemos um modelo in vitro para mimetizar o status de fumaça e tentamos monitorar as mudanças dinâmicas durante a exposição do EFC às células epiteliais das vias aéreas. Além disso, as células epiteliais das vias aéreas relativamente purificadas tornam o estudo multiômico mais fácil do que o de tecidos inteiros, o que pode nos ajudar a encontrar as respostas moleculares e celulares na exposição das células epiteliais das vias aéreas à CSE e a identificar as principais vias e alvos terapêuticos da DPOC em alto rendimento.
Aqui, o protocolo que descreve o isolamento de células epiteliais traqueais murinas é adaptado dos protocolos de Hilaire et al.13 e You et al.14 com algumas modificações. No protocolo utilizado neste estudo, as células epiteliais das vias aéreas murinas foram propagadas e diferenciadas em uma estrutura pseudoestratificada contendo células ciliadas e caliciformes usando uma interface ar-líquido e meio contendo CSE, estabelecendo assim um modelo de aclimatação crônica do CSE. Os eventos a seguir são os pontos-chave do presente modelo.
Considerando que a luxação cervical poderia forçar mecanicamente o pescoço e danificar fisicamente as células epiteliais, e a anestesia com hidrato de cloral também poderia impactar as vias aéreas, o pentobarbital sódico foi usado para a eutanásia15. Durante procedimentos cirúrgicos em camundongos, imergir apenas o pescoço e as áreas inferiores para evitar a entrada de álcool no nariz pode aumentar a viabilidade das células epiteliais das vias aéreas16. Dados preliminares do presente estudo demonstraram que as células epiteliais das vias aéreas submetidas à intubação traqueal ou imersão em álcool apresentaram baixa viabilidade e não se expandiram. Além disso, para obter células epiteliais das vias aéreas sem eritrócitos, deve-se ter cuidado nos procedimentos cirúrgicos para evitar a contaminação do sangue ao isolar as vias aéreas principais.
Mesmo em camundongos livres de patógenos específicos, as vias aéreas colonizaram micróbios significativos. A adição de antibióticos apropriados no meio de expansão das células epiteliais primárias das vias aéreas murinas P0 é essencial para evitar a contaminação por patógenos bacterianos ou fúngicos. Uma solução de coquetel de penicilina, estreptomicina, anfotericina B e gentamicina17 garante efetivamente a expansão das células epiteliais das vias aéreas murinas P0 em um ambiente estéril in vitro . Experimentos preliminares demonstraram que, se não houver inibição efetiva da contaminação bacteriana, as células epiteliais das vias aéreas murinas P0 morrerão antes da primeira passagem.
Nos métodos de digestão, foram testados 4 °C e 37 °C. Os resultados de experimentos preliminares indicaram que a digestão em 37 ° C superou 4 ° C em termos de eficiência de tempo, viabilidade celular e rendimento celular.
Antes da semeadura das células epiteliais, o colágeno da cauda de rato foi dissolvido em ácido acético e usado para revestimento de placas de cultura para melhorar a adesão das células epiteliais18. No entanto, a densidade do revestimento de colágeno não deve ser muito alta ou muito baixa; Uma densidade insuficiente não fornece condições adequadas de adesão, enquanto uma densidade excessiva resulta em resíduo cristalino na superfície da cultura.
Um passo crítico é manter mais células epiteliais vivas e evitar a contaminação por fibroblastos. Para conseguir isso, recomendamos que 1) o uso do kit de dissociação de células livres de componentes animais possa isolar suavemente as células epiteliais e reduzir danos celulares desnecessários e 2) o uso de meio diferencial contendo hidrocortisona pode inibir o crescimento de fibroblastos e promover a proliferação de células epiteliais.
As culturas tradicionais de monocamada submersa de células epiteliais das vias aéreas têm sido um elemento básico na pesquisa respiratória e nos estudos toxicológicos. No entanto, esses métodos não conseguem replicar com precisão as características diferenciadas dos tecidos epiteliais das vias aéreas, conforme encontrado in vivo. Para resolver essa limitação, optamos por um modelo epitelial alternativo das vias aéreas. Este modelo baseia-se no cultivo de células primárias das vias aéreas em andaimes de membrana microporosa, como os fornecidos por sistemas transwell, em uma interface ar-líquido19. A exposição da superfície apical ao ar ambiente nesta configuração de cultura ALI é fundamental para promover a diferenciação celular, imitando assim mais de perto as condições in vivo 20.
Se a diferenciação não for eficaz, é crucial avaliar possíveis razões. Isso inclui a possibilidade de que as células epiteliais das vias aéreas possam ter sofrido passagem excessiva, o que pode comprometer sua capacidade de diferenciação. Além disso, é imperativo garantir que o acúmulo de muco e líquido dentro da câmara apical seja completamente eliminado durante o processo quinzenal de troca de meios, pois o conteúdo residual pode impedir o processo de diferenciação.
Embora esse modelo apresente certas limitações, ele continua sendo uma ferramenta valiosa para a pesquisa. Uma limitação é que o uso de um meio contendo CSE para estimular as células epiteliais das vias aéreas pode não replicar totalmente as condições in vivo experimentadas pelas células epiteliais das vias aéreas em fumantes. Além disso, a viabilidade de células epiteliais ciliadas diferenciadas in vitro é tipicamente limitada a um mês. Apesar dessas restrições, o modelo integra efetivamente vários aspectos-chave: facilita o estudo da diferenciação das células epiteliais das vias aéreas na interface ar-líquido, aclimatação de longo prazo ao CSE e a aplicação de análise multiômica em um determinado período de tempo. Essa abordagem abrangente oferece uma estrutura sofisticada e holística para futuras investigações sobre os mecanismos fisiológicos e patológicos das células epiteliais das vias aéreas. Além disso, auxilia na identificação de potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para doenças das vias aéreas. Esperamos que nossa experiência forneça informações úteis para aqueles que gostariam de usar esse modelo para estudos relevantes.

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens1. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC2, tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar marcadores diagnósticos precoces e alvos terapêuticos para a DPOC.
Para resolver essa lacuna, desenvolvemos um novo modelo in vitro usando células epiteliais das vias aéreas murinas. Essas células foram submetidas a estimulação de longo prazo com extrato de fumaça de cigarro (CSE), permitindo-nos monitorar as mudanças celulares dinâmicas e explorar as mudanças nas células epiteliais das vias aéreas sob estimulação de tabaco de longo prazo e o mecanismo subjacente. Nesse modelo, o transwell foi usado para fornecer a interface ar-líquido das células epiteliais das vias aéreas, e o extrato de fumaça de cigarro foi estimulado no estágio inicial da diferenciação das células epiteliais até o final da diferenciação aos 28 dias. Estudos anteriores investigaram apenas a diferenciação e estimulação de curto prazo das células epiteliais das vias aéreas (dominância da linha celular). Eles foram limitados a uma única via regulatória 3,4,5,6. No entanto, o protocolo apresentado aqui usa células epiteliais primárias das vias aéreas de camundongos e otimiza o processo de extração celular para uma melhor atividade celular do que os métodos anteriores de cultura de células epiteliais das vias aéreas. Este modelo se concentra em alterações na diferenciação celular juntamente com análises transcriptômicas, proteômicas, metabolômicas e epigenômicas abrangentes. Empregando imunofluorescência e técnicas multiômicas avançadas, nosso objetivo foi elucidar as respostas celulares das células epiteliais das vias aéreas à exposição crônica à fumaça do tabaco, contribuindo assim para uma compreensão mais profunda da patogênese da DPOC. Este modelo pode ser usado para explorar as mudanças no padrão de diferenciação das células epiteliais das vias aéreas e seu mecanismo causado pela estimulação de longo prazo de vários poluentes.

<table><tbody><tr><td>100x Solução de Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Transwell de 24 mm com 0.4 &micro; m Inserção de Membrana de Poliéster de Poros, Estéril</td><td>BIOFIL</td><td>TCS016012</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>500x Solução de Gentamicina/Anfotericina</td><td>Gibco</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>acetilada &alfa;-Tubulina</td><td>CST</td><td>#5335</td><td></td></tr><tr><td>Acetil-&alfa;-Tubulina (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb&nbsp;</td><td>cellsignal</td><td>#5335</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Células Livres de Componentes Animais</td><td>Célula-tronco</td><td>05426</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-pan citoqueratina</td><td>abcam ab7753</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cigarro</td><td>Marlboro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Claudin3</td><td>imunoway</td><td>YT0949</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclase I do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclásio I de pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ham» s F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6658</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Heparina&nbsp;</td><td>Célula-tronco</td><td>07980</td><td></td></tr><tr><td>Solução de estoque de hidrocortisona</td><td>Célula-tronco</td><td>07925</td><td></td></tr><tr><td>Mucina 5AC</td><td>abcam</td><td>ab212636</td><td></td></tr><tr><td>Oclusina</td><td>proteintech</td><td>27260-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytosci</td><td>CBS004S-BR500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Célula-tronco Basal Média</td><td></td><td>05002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento PneumaCult-ALI 10x Stemcell</td><td></td><td>05003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Suplemento de Manutenção</td><td>Célula-tronco</td><td>05006</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-Ex Plus 50x Suplemento</td><td>Célula-tronco</td><td>05042</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-Ex Plus Tronco Médio Basal</td><td></td><td>05041</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Célula-tronco</td><td>07050&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

In Vitro Model for Studying Differentiation and Changes of Multi-Omics on Murine Airway Epithelial Cells Stimulated with Cigarette Smoke Extract

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.

Diferenciação As células epiteliais das vias aéreas murinas se diferenciaram com sucesso após a cultura em uma interface ar-líquido com um meio de diferenciação por 28 dias. A presença de células ciliadas e caliciformes foi demonstrada pelo ensaio de imunofluorescência do marcador de cílios acetilado α-Tubulina (verde; Figura 3A) e o marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (vermelho; Figura 3B).
Determinação da concentração de CSE para diferenciação celular Estimular as células epiteliais isoladas com diferentes concentrações de CSE por 24 h. Os resultados mostraram que as células epiteliais diminuíram na viabilidade celular quando a concentração de CSE foi superior a 6% (p &lt;0,05, Figura 4A). Para manter a atividade celular sob estimulação de longo prazo, meios de cultura contendo 2%, 4% e 6% de CSE foram usados para estimular a diferenciação das células epiteliais por 28 dias. Além disso, os resultados mostraram que, com o aumento da concentração de CSE, não houve morte celular significativa nas células epiteliais (Figura 4B), mas houve uma mudança gradual no número de células de resistência transmembrana intercelular (TEER) (Figura 4C) e esfoliadas (Figura 4D). Além disso, uma redução geral nas células diferenciadas e células ciliadas foi observada quando as culturas de células epiteliais das vias aéreas murinas foram cronicamente expostas ao CSE ( Figura 4E-H ). Portanto, o meio de diferenciação contendo 6% de CSE foi escolhido para desregular a função da barreira epitelial e reduzir o número de células ciliadas sem diminuição da viabilidade celular enquanto diferenciava as células epiteliais por 28 dias.
Análise multiômica Dois grupos de células estimuladas com meio diferencial contendo 0% ou 6% de CSE por 28 dias foram colhidos. O mRNA total foi extraído para análise transcriptômica. Após a preparação da biblioteca, sequenciamento, controle de qualidade, mapeamento de leituras para o genoma de referência e quantificação da expressão gênica, a expressão diferencial de genes entre os dois grupos foi analisada. O pacote clusterProfiler R foi utilizado para conduzir uma análise de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) para genes que exibiam expressão diferencial, com ajustes feitos para levar em conta as discrepâncias de comprimento do gene (Figura 5A). A Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) serve como um banco de dados abrangente que facilita a compreensão das funcionalidades e funções do sistema biológico complexo em vários níveis, incluindo celular, orgânico e ecológico, integrando dados em nível molecular derivados de extensos conjuntos de dados, como aqueles produzidos por sequenciamento genômico e metodologias experimentais de alto rendimento (Figura 5B). Para proteômica, as proteínas totais foram extraídas de dois grupos de células aos 28 dias após culturas com meios diferenciais contendo 0% ou 6% de CSE. Após o teste de qualidade da proteína, remoção de sal, hidrólise enzimática de proteínas, marcação de peptídeos Tandem Mass Tags (TMT), separação de frações, análise de LC-MS, identificação de proteínas e quantificação de proteínas, proteínas diferencialmente expressas entre dois grupos podem ser definidas. A análise GO foi conduzida usando o programa interproscan contra o banco de dados de proteínas não redundantes (Figura 6A), e KEGG foi usado para analisar a via (Figura 6B). Para metabolômica, os sobrenadantes da cultura foram coletados de dois grupos de células epiteliais das vias aéreas aos 28 dias após culturas com meio de diferenciação contendo 0% ou 6% de CSE. Após a análise, identificação e quantificação dos metabólitos de HPLC-MS/MS, os metabólitos diferenciais entre os dois grupos podem ser definidos. O banco de dados KEGG (Figura 7A), o banco de dados de metaboloma humano (Figura 7B) e o banco de dados de mapas lipídicos (Figura 7C) foram usados para anotar todos os metabólitos. O banco de dados KEGG foi usado para analisar as funções desses metabólitos diferenciais e vias metabólicas (Figura 7D). Para epigenômica, o ATAC-seq foi realizado conforme relatado anteriormente9. Os núcleos foram extraídos de dois grupos de células aos 28 dias após o cultivo com meio diferencial contendo 0% ou 6% de CSE, e o pellet de núcleos foi ressuspenso na mistura de reação de Tn5 transposase. A reação de transposição foi incubada a 37 °C por 30 min. Depois de adicionar um adaptador, preparação da biblioteca, avaliação de qualidade, agrupamento e sequenciamento, a epigenômica diferencial entre dois grupos pode ser definida. A análise de enriquecimento de GO de genes diferencialmente relacionados ao pico reflete diretamente a distribuição numérica de genes diferencialmente relacionados ao pico em itens GO enriquecidos em processos biológicos, componentes celulares e função molecular (Figura 8A). O banco de dados KEGG foi usado para analisar as funções desses genes e vias diferenciais (Figura 8B).
Genes que codificam proteínas de junção apertada Os dados transcriptômicos mostraram que, após a estimulação prolongada da ECS, houve diminuição da expressão de vários genes que codificam proteínas de junção apertada, incluindo Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 e Ocln (Figura 9A), nos quais a expressão reduzida de Cldn3 e Ocln foi confirmada por Western-Blot e imuno-histoquímica (IHC) (Figuras 9B-E). Esses dados sugerem que a exposição ao CSE reduz acentuadamente a expressão de proteínas de junção apertada das células epiteliais das vias aéreas.
Expressão de citocinas e quimiocinas Além da quebra de conexões estreitas, a transcriptômica também mostrou que, após a estimulação prolongada de CSE, a expressão de algumas citocinas e quimiocinas, incluindo Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 e Il33 aumentou, mas a expressão de Ccl5 diminuiu (Figura 10A). O teste Luminex confirmou ainda que houve aumento das concentrações de CXCL-5, CSF-3 e IL-1α (Figura 10B-D), mas diminuição do CCL-5 (Figura 10E) no sobrenadante das células epiteliais das vias aéreas murinas. Esses resultados sugerem que a exposição à EFC atua seletivamente na expressão de citocinas e quimiocinas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig01.jpg"> Figura 1: Crescimento das células epiteliais primárias das vias aéreas murinas. (A) As células recém-isoladas parecem redondas e transparentes. (B) No dia 2 pós-isolamento, as células expandidas se formaram em pequenas ilhas de células. (C) No dia 4, a formação de ilhas de células maiores. (D) No dia 6, mais de 90% de fusão com a morfologia do paralelepípedo. (ampliação de 4x; barras de escala: 250 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig02.jpg"> Figura 2: Ensaio de imunofluorescência de marcadores de células epiteliais. Expressão de citoqueratina em células epiteliais primárias das vias aéreas murinas, A549 (controle positivo) e Raw264.7 (controle negativo). Núcleos corados com DAPI (aumento de 63x; barras de escala: 40 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig03.jpg"> Figura 3: Ensaio de imunofluorescência para marcadores de células ciliadas e caliciformes. Os marcadores utilizados foram acetilados (A) α-Tubulina e (B) Mucina 5AC para confirmação de células ciliares e células caliciformes, respectivamente (aumento de 100; barras de escala: 10 μm no painel A e 50 μm no painel B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig04.jpg"> Figura 4: Impacto das concentrações de CSE nas células epiteliais. (A) Viabilidade celular em 24 h em concentrações variáveis de CSE. (B) Viabilidade celular em 28 dias. (C) Medição TEER. (D) Contagem de células esfoliadas. (E-H) Imunofluorescência para células ciliadas (verdes) e caliciformes (roxo) em concentrações de CSE de 0%, 2%, 4% e 6% (aumento de 20x; barras de escala: 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig05.jpg"> Figura 5: Análises de enriquecimento GO e KEGG para expressão gênica. (A) Significado do termo GO em processo biológico enriquecido, componente celular e função molecular. (B) Proporção de genes diferencialmente expressos nas vias KEGG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig06.jpg"> Figura 6: Análise da expressão de proteínas. (A) Gráfico de barras de enriquecimento GO mostrando a expressão diferencial de proteínas. (B) Análise da via KEGG com base em proteínas diferencialmente expressas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig07.jpg"> Figura 7: Análise da via KEGG do metabólito. (A) Anotando todos os metabólitos usando o banco de dados KEGG. (B) Anotar todos os metabólitos usando o Banco de Dados de Metaboloma Humano. (C) Anotar todos os metabólitos usando o banco de dados de mapas lipídicos. (D) A distribuição de metabólitos diferencialmente expressos em várias vias KEGG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig08.jpg"> Figura 8: Análise de expressão gênica relacionada ao pico diferencial. (A) Gráfico de barras de enriquecimento GO mostrando a expressão diferencial de proteínas. (B) Análise da via KEGG com base em proteínas diferencialmente expressas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig09.jpg"> Figura 9: Expressão da proteína de junção apertada em células epiteliais das vias aéreas murinas com ou sem estimulação de CSE. (A) Mapa de calor da expressão da proteína de junção apertada no transcriptoma. (BE) Os níveis de expressão de (B,C) Cldn3 e (D,E) Ocln em células epiteliais das vias aéreas murinas foram detectados por Western Blot e imuno-histoquímica para Cldn3 e Ocln (aumento de 80; barras de escala: 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67057/67057fig10.jpg"> Figura 10: Análise da expressão de citocinas. (A) Mapa de calor do transcriptoma da expressão de citocinas. (BE) Ensaio Luminex para níveis de CXCL-5, CSF-3, IL-1α e CCL-5 em células com/sem estimulação CSE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67057/67057fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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