Name: Melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda a clonar plasmídeos usando Gibson Assembly em um formato CURE para biologia molecular. Este método aumenta a confiança dos estudantes em técnicas de clonagem molecular e biosíntese de produtos naturais.

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<meta charset="utf8"></head><body>Implementando a Gibson Assembly para aprimorar a educação e as habilidades em biologia molecular

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

Treinar alunos de graduação em conceitos fundamentais de biologia molecular e técnicas laboratoriais é crucial para seu desenvolvimento científico e profissional, pois essas metodologias são comuns em vários ambientes de pesquisa, incluindo academia e indústria. Como tal, os alunos dos cursos de biologia (concentração de biologia molecular e celular) e bioquímica da California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) são obrigados a fazer um curso de laboratório de biologia molecular de divisão superior para aprender e aplicar esses tópicos (CHEM / BIO 475). Um currículo básico para este curso foi desenvolvido anteriormente, no qual os alunos realizam clonagem baseada em topoisomerase (TOPO) para montar um plasmídeo contendo actina que é preparado a partir de um modelo de DNA complementar de levedura (cDNA)1. Os alunos projetam experimentos com base em perguntas que imitam hipóteses de pesquisa autênticas, aumentando sua familiaridade com as práticas de laboratório e o aprendizado baseado em investigação. O avanço contínuo no campo da biologia molecular exige que os currículos correspondentes se adaptem para preparar os alunos com competências modernas para a força de trabalho. Em particular, o uso de Gibson Assembly tornou-se mais predominante na comunidade científica; embora o método tenha sido originalmente estabelecido para sintetizar cromossomos artificiais2, mais de 5.000 publicações no momento deste relatório fizeram referência ao trabalho original de Gibson et al. O Gibson Assembly é único em comparação com as metodologias tradicionais de clonagem: é altamente personalizável e pode facilmente ligar vários fragmentos lineares de DNA sem a necessidade de locais de restrição para produzir as junções. Assim, vimos a oportunidade de reformular o currículo CHEM / BIO 475 para incorporar técnicas modernas de clonagem molecular e melhorar o modelo de curso baseado em investigação.
Foi estabelecido que as experiências de pesquisa dos alunos contribuem para aumentar a compreensão conceitual, o desenvolvimento de habilidades e a persistência na ciência3, mas nem todos os alunos de graduação têm a oportunidade de participar diretamente de um laboratório de pesquisa. Para enfrentar o desafio da capacidade limitada dos alunos em laboratórios de pesquisa, experiências de pesquisa de graduação baseadas em cursos (CUREs) foram desenvolvidas e empregadas para aumentar a acessibilidade à ciência por meio de pesquisas autênticas em sala de aula. Embora os CUREs variem em sua implementação, práticas comuns que abordam os cinco princípios da pesquisa científica foram estabelecidas. Em um CURE bem projetado, os alunos irão 1) usar práticas científicas, 2) colaborar em um projeto de pesquisa, 3) tentar fazer novas descobertas, 4) contribuir para o trabalho relevante fora da sala de aula e 5) reavaliar e revisar hipóteses e métodos em caso de falha experimental4. Semelhante às experiências tradicionais de pesquisa dos alunos em um laboratório, os CUREs demonstraram fortalecer a confiança dos alunos na ciência, nas habilidades científicas, na propriedade do projeto e na persistência em ciência, tecnologia, engenharia e matemática (STEM)5. Embora CUREs envolvendo clonagem molecular tenham sido relatados anteriormente 6,7,8,9,10,11,12,13, não temos conhecimento de nenhum que enfatize a adaptabilidade da Gibson Assembly para fazer uma biblioteca de plasmídeos de pesquisa autênticos.
Aqui, relatamos uma expansão do atual currículo CHEM / BIO 475 baseado em investigação na California Polytechnic State University, San Luis Obispo, com duas grandes melhorias: experiência prática usando Gibson Assembly e participação dos alunos em um CURE, que forneceu construções de plasmídeo originais para projetos de pesquisa financiados pela National Science Foundation (NSF-1708919 e NSF-2300890). Ao longo de três implementações deste currículo, os alunos contribuíram para dois projetos de pesquisa distintos focados na biossíntese de produtos naturais de moléculas bioativas produzidas por Actinomycetota. Os produtos naturais geralmente contêm farmacoforos com atividades antibióticas, antifúngicas e/ou anticancerígenas, dando a essas pequenas moléculas importância nos esforços de descoberta de medicamentos e potencial de relevância clínica14. Esta pesquisa requer a criação de bibliotecas de plasmídeos para permitir investigações da função e do potencial de engenharia das enzimas biossintéticas bacterianas. Neste CURE, os alunos projetaram e realizaram experimentos de montagem Gibson para clonar as bibliotecas de plasmídeos exclusivas pertinentes a esses projetos de pesquisa (Figura 1). Além disso, o formato e o design do módulo são distintos porque são facilmente adaptáveis para gerar quaisquer plasmídeos de interesse para outros projetos de pesquisa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do papel da Gibson Assembly em nosso laboratório de pesquisa. Actinomycetota produz produtos naturais de pequenas moléculas com bioatividades clinicamente relevantes usando clusters de genes que codificam enzimas biossintéticas. Em nossa pesquisa, plasmídeos contendo um gene biossintético são montados via Gibson Assembly para investigações a jusante da função da enzima codificada. Ícones da ciência de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Visão geral do laboratório
O Laboratório de Biologia Molecular é um curso de divisão superior necessário para graduados em bioquímica e biologia com concentração em biologia molecular e celular. Outros alunos que atendam aos pré-requisitos são bem-vindos para fazer o curso como uma eletiva de divisão superior. O curso é co-listado entre o Departamento de Química e Bioquímica e o Departamento de Biologia da Cal Poly. O corpo docente de ambos os departamentos se reveza no ensino do curso a cada semestre (dois trimestres de Biologia, um quarto de Química e Bioquímica).
A turma se reúne no laboratório duas vezes por semana por períodos de 170 minutos e uma vez por semana para uma palestra de 50 minutos. As seções de laboratório contêm no máximo 16 alunos e 2 a 3 seções de laboratório são oferecidas a cada trimestre. O curso dura 10 semanas e o exame final é administrado durante a última reunião da semana 10. O tempo de aula é gasto discutindo a teoria por trás de muitas das técnicas experimentais conduzidas no laboratório, bem como tópicos atuais em biologia molecular que não são abordados no laboratório. O currículo básico do laboratório abrange o processo de clonagem do gene da actina da levedura1, que leva aproximadamente 7 semanas (13 a 14 reuniões de laboratório). As técnicas incluem micropipetagem, isolamento de RNA de levedura, amplificação de um gene de levedura usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), clonagem TOPO, triagem azul-branca, isolamento de plasmídeo e verificação de inserção por digestão de restrição e PCR, análise in silico de clones e análise de sequência de DNA. O currículo das últimas 3 semanas do curso fica a critério do instrutor, mas envolve os alunos concluindo um "projeto independente" com resultados indefinidos.
Visão geral do experimento
Um foco do nosso grupo de pesquisa são as vias biossintéticas em Actinomycetota. Ao projetar o projeto independente, imaginamos que os alunos criassem plasmídeos por meio da Gibson Assembly para uso em nossos projetos de pesquisa que investigam a biossíntese de produtos naturais. Embora as iterações do módulo do curso avaliadas aqui sejam específicas para plasmídeos que permitem a manipulação de vias biossintéticas, o fluxo de trabalho da Gibson Assembly é extremamente adaptável para outros projetos de clonagem molecular (Figura 2). O fluxo de trabalho foi dividido em três experimentos diferentes (A, B e C) que foram concluídos em dois períodos de aula e seis períodos de laboratório (3 semanas no total) (consulte o Arquivo Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 2). Os experimentos foram precedidos por planilhas para apoiar a preparação do aluno e avaliar a compreensão do aluno (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5). O fluxo de trabalho é apresentado em um formato flexível às necessidades e interesses de um instrutor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Fluxo de trabalho do módulo Gibson Assembly. O dia 1 e o dia 4 são períodos de aula em que os alunos concluem a análise de sequência in silico e o projeto experimental. Os dias 2 a 3 e 5 a 8 são reuniões de laboratório onde são realizadas as etapas para clonar novos plasmídeos por meio da Gibson Assembly, seguidas de isolamento e triagem. O fluxograma pictórico é agrupado pelos três experimentos que os alunos realizam (A, B e C). Instruções e protocolos mais detalhados podem ser encontrados nos Manuais do Instrutor e do Aluno fornecidos como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2, respectivamente. Ícones da ciência de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O módulo de projeto independente da Gibson Assembly foi testado pela primeira vez no trimestre da primavera de 2019 no CHEM/BIO 475. Em 2020 e 2021, o curso foi ministrado online devido à pandemia de SARS-CoV-2. Quando as aulas presenciais foram retomadas na primavera de 2022 e 2023, os alunos do curso foram convidados a participar de um estudo avaliando os resultados de aprendizagem de um projeto independente da Gibson Assembly, onde plasmídeos originais e relevantes para a pesquisa seriam clonados. Em 2019, os alunos criaram uma biblioteca de plasmídeos consistindo em de genes do genoma de Micromonospora echinospora ATCC 15837 que foram clonados em pKC1132 (Figura 3). Esta biblioteca de plasmídeos está sendo utilizada em nosso laboratório de pesquisa para inativar genes de interesse em um suposto cluster de genes biossintéticos para o produto natural TLN-0522015. Para complementar nossos estudos de inativação gênica, os alunos em 2022 clonaram uma pequena biblioteca de genes do suposto cluster de genes TLN-05220 em pUC19 (Figura3); nosso grupo de pesquisa utilizou esses plasmídeos para subclonar genes em vetores de expressão, incluindo pET28b, para superexpressão e purificação de proteínas. Os alunos da coorte de 2023 contribuíram para o trabalho em andamento em um projeto de engenharia biossintética sobre a epoxomicina sintetase16. Em equipes de 3 a 4, os alunos clonaram domínios de engenharia de módulos de peptídeo sintatética17 não ribossômico em vários vetores de expressão de proteínas para otimizar a superexpressão e purificação dessas enzimas em nosso laboratório de pesquisa (Figura 3). A redundância foi incorporada ao plano de clonagem para cada coorte. Por exemplo, a coorte de 2019 continha 44 alunos e 15 plasmídeos foram designados para a turma para clonagem. Assim, a clonagem de cada plasmídeo foi tentada duas ou três vezes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Resumo dos plasmídeos clonados e dos alunos participantes durante as iterações independentes do projeto de 2019, 2022 e 2023. O projeto Gibson Assembly foi implantado três vezes. Em cada oferta, os alunos participantes clonaram uma biblioteca diferente de plasmídeos para serem utilizados em projetos de pesquisa que exploram vias biossintéticas. Projetos em 2019 e 2022 apoiaram nosso trabalho contínuo no produto natural TLN-0522015 com duas reações de fragmento (um de genes ou gene e um vetor) Gibson Assembly. O projeto de 2023 envolveu a troca de domínio nos módulos 1 e 2 de uma enzima peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) que está envolvida na biossíntese de epoxomicina16. Os fragmentos hachurados representam dois mutantes diferentes do domínio trocado e as cores sólidas representam domínios que não foram trocados. No total, oito fragmentos de genes diferentes (quatro para o módulo 1 e quatro para o módulo 2) foram gerados com saliências compatíveis para Gibson Assembly. Para cada módulo, duas combinações diferentes de três fragmentos de genes foram montadas com um dos dois vetores diferentes (pBAD33 e pET28, quatro fragmentos totais por conjunto), para o potencial de gerar oito plasmídeos NRPS projetados. Ícones da ciência de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Visão geral da avaliação
Pelo menos 1 semana antes do início do projeto independente Gibson Assembly, os alunos das coortes de 2022 e 2023 foram convidados a participar de uma investigação de resultados de aprendizagem, projetada de forma semelhante a um estudo realizado em uma pesquisa do curso de laboratório de bioquímica na Cal Poly18. Os alunos participantes preencheram um pré-questionário de múltipla escolha na reunião de laboratório antes do início do projeto independente e um pós-questionário de múltipla escolha durante a reunião final do laboratório (ou seja, depois de terem concluído o módulo Gibson Assembly). Os pré e pós-questionários consistiram em 28 questões idênticas com duas perguntas adicionais no pós-questionário (30 no total). Dez questões de conteúdo foram escritas para avaliar o conhecimento dos alunos sobre enzimas e mecanismos envolvidos na clonagem molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR], Gibson Assembly, transformação, triagem azul-branco). As sete perguntas a seguir pediram aos alunos que autoavaliassem sua familiaridade com os termos de clonagem molecular (por exemplo, DNA polimerase, exonuclease, ligase). As próximas 10 perguntas permitiram que os alunos autoavaliassem sua capacidade de realizar técnicas de clonagem molecular (por exemplo, análise de sequência de DNA, reações de digestão de restrição, eletroforese em gel de agarose). Os alunos também relataram se se sentiriam confortáveis em seguir uma carreira em biologia molecular com base em seu conhecimento de técnicas de clonagem molecular. Duas perguntas adicionais foram incluídas no pós-questionário para que os alunos autoavaliassem seu compromisso com o aprendizado no curso e se o curso foi uma experiência de aprendizado valiosa (Arquivo Suplementar 6 e Arquivo Suplementar 7). Todos os dados das respostas pré e pós-questionário dos alunos de 2022 e 2023 foram combinados para análise e estão disponíveis na Tabela Suplementar S1.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de desoxirribonucleotídeo (dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Componente MasterMix caseiro'</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Componente MasterMix da Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>Homemade'</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 unidades</td></tr><tr><td>Incubadora Microbiológica Fisherbrand Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp Banho de Água Fisher</td><td>Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Ácido Nucleico Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10,000X</td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Escada de DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 aplicações</td></tr><tr><td>LB Caldo, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Componente MasterMix caseiro'</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 16</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Bactéria Micromonospora echinospora Coleção</td><td>de Cultura Tipo Americano</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Forno Microondas</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Biologia Molecular Grau Agarose Fisher</td><td>BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0,05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 reações</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Agitador Orbital de Bancada</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Componente MasterMix caseiro</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Componente MasterMix caseiro</td></tr><tr><td>Balança portátil</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vetor</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 reações</td></tr><tr><td>T5 Exonuclease</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Componente MasterMix caseiro Taq</td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Componente MasterMix caseiro</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Componente MasterMade Caseiro</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Thermo Kit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep de Plasmídeo Zyppy Scientific</td> FERR1161 5 x 1 mL <td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Componente MasterMix' caseiro</td></tr></tbody></table>

melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

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