Name: CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda o método CIRCLE-seq para identificar sites de clivagem fora do alvo em edição genética CRISPR-Cas9 usando células-tronco pluripotentes induzidas. Esta técnica bioinformática melhora a segurança de terapias gênicas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Detectando eventos de clivagem CRISPR-Cas9 fora do alvo com CIRCLE-Seq

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de parede fina de 0,2 mL e tampas planas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>PippinHT de 1,5% Pipetas</td> sorológicas <td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>150 x 25 mm Prato para Cultura de Tecidos&nbsp;</td><td>Reservatório</td> de Reagente <td>FisherScientific 877224</td><td></td></tr><tr><td>25 mL&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Sorológicas de 5 mL&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 50 mL</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Eletroforese TAE 50x&nbsp;</td>Placa de Cultura de Células <td>de 6 Poços ThermoFisher</td><td>Scientific B49</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Reagente Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td><td>Microcentrífuga de Bancada Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>Tampão New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 nuclease, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq Preparação da Biblioteca e NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz Qualificada para ESCH Corning</td><td></td><td>354277</td><td>Matriz Extracelular (ECM) para cultura de iPSCs</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix para Sondas&nbsp;</td><td>Suporte de</td><td>cartucho Bio-Rad 1863010</td><td></td></tr><tr><td>DG8</td><td>Cartuchos Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Juntas Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Feito pela Invitrogen</td></tr><tr><td>Óleo de Geração de Gotículas para Sondas&nbsp;</td>Óleo de Leitor <td>de</td> Gotículas 1863005 <td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M), pH 8.0, Livre de RNase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Feito por Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; ThermoMixer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, Pure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro&nbsp;</td>Pontas de Pipeta Estéril <td>Filtradas FB0875713</td><td></td> <td>da FisherScientific</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focado&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr>Isolamento <td></td><td></td><td></td>de<td>DNA Genômico</td></tr><tr><td>Cisalhamento</td><td></td><td></td><td></td>de DNA Genômico</tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Core Kit&nbsp;</td><td>GRNAs Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Incubadora de Cultura de Tecidos Umidificados Tri-gas</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 51030411</td><td>Necessidade de cultura e expansão de iPSCs (37 &deg; C/5% CO2/5% O2)</td></tr><tr><td>Fita de Tela de DNA D1000 de Alta Sensibilidade Agilent</td><td></td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes D1000 de Alta Sensibilidade</td> Kit de Preparação para Biblioteca HTP <td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Solução Antimistótica Antibiótica</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> Invertido <td>Necessidade de imagens de colônias iPS em canais de campo claro e fluorescentes</td></tr><tr><td>Cultura</td><td></td><td></td><td></td>iPSC</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease Lambda&nbsp;</td><td>Pontas de Carregamento New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr><tr><td>, pacote com 10</td><td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate&nbsp;</td>Tubo de Microcentrífuga <td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo Fibra AFA Pré-Fenda Snap-Cap&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x Suplemento</td><td>StemCell Technology</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)</td><td>StemCell Technology</td><td>85851</td><td>Mídia para manter iPSC em cultura</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEB Oligos Multiplex Extinto para Illumina&nbsp;</td><td>Conjunto de Primers de Índice Duplo New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>1</td></tr><tr><td>Tampas de tira de tubo óptico, 8x tira</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo óptico, 8x tira</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Outros Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seladora de Placa PCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Número do Modelo PX1</td></tr><tr><td>PEG/NaCl SPRI Solution&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Selagem Térmica Perfurável&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DNase dependente de ATP segura para plasmídeos</td><td>Epicentro</td><td>E3110K</td><td></td></tr><tr><td>Primers, adaptadores e sondas As sequências</td><td>IDT</td><td></td><td>estão listadas na Tabela 1</td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td>Kit de Extração de Gel <td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;</td>Sistema de Análise de Gel <td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel&nbsp;</td><td>Tubos de Ensaio Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de Ensaio&nbsp;</td><td>Kit de Ensaio ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR&nbsp;</td>Kit de Ensaio <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS&nbsp;</td><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Q32854</td><td></td>da ThermoFisher</tr><tr><td>Scientific&nbsp;</td>Sistema de PCR Digital de Gotículas QX200 <td>Q33226</td><td></td> <td>da ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>1864001 Bio-Rad</td><td></td><td>Contém um gerador de gotículas QX200 e um leitor de gotículas QX200</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR Semi-saiada</td>Placa <td>de Seq 14230244</td><td></td> <td>Científica ThermoFisher</td></tr><tr><td>GTG Agarose&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase (PNK)</td><td>Frascos New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler com funcionalidade programável de passo de temperatura</td><td>Base Tris Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 poços, semi-saia, verde</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Água Destilada&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzyme&nbsp;</td><td>BioLabs da Nova Inglaterra</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

circle-seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Aqui, o CIRCLE-seq é utilizado para investigar os locais de clivagem induzidos por nuclease de Cas9 em um complexo com o gRNA projetado para atingir o local de integração do vírus adeno-associado 1 (AAVS1) usando DNA isolado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Este gRNA foi descrito anteriormente em nossa publicação27. Aproximadamente 25 μg de gDNA foram isolados de iPSCs, cortados por ultrassom focalizado e o tamanho selecionado usando purificação de esferas AMPure XP para produzir fragmentos de aprox. 300 bps. A partir desses 25 μg de DNA, aprox. 2-5 ng de DNA foram circularizados com sucesso para clivagem in vitro de Cas9: gRNA. Todo o procedimento é representado na Figura 1.
Seguindo um procedimento e análise CIRCLE-seq usando nosso fluxo de trabalho de computação, uma visualização de todos os locais de clivagem dentro e fora do alvo detectados é apresentada na Figura 2A. O pipeline CIRCLE-seq também forneceu 'leituras mescladas', analisadas por meio de software estatístico R para produzir um gráfico de Manhattan mostrando os locais de clivagem induzidos por nuclease detectados mapeados ao longo de cada cromossomo (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquemas de fluxo de trabalho CIRCLE-seq. As principais etapas do protocolo são indicadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualização CIRCLE-seq e Manhattan Plot. (A) Alinhamento de locais fora do alvo contra o alvo pretendido para o locus AAVS1. A sequência de destino é exibida na parte superior, onde os alvos fora são classificados por contagem de leitura em ordem decrescente. As diferenças nas sequências alvo originais são mostradas por nucleotídeos coloridos. Uma amostra dos principais locais de clivagem não intencionais para o locus AAVS1 é mostrada. (B) Gráfico de Manhattan ilustrando os locais de clivagem não intencionais detectados para o locus AAVS1. As alturas das barras representam contagens de leitura para cada posição cromossômica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cartilha</td>
			<td>Sequência (5'-3')</td>
			<td>Comentários/Descrição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 RNA guia único (sgRNA)</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>Para AAVS1 Locus' Fluorescent Protein Knock-In</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Primer Direto</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATATG</td>
			<td>Para teste de clivagem in vitro de gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Primer Reverso</td>
			<td>ATTCCCAGGGCCGGTTAATG</td>
			<td>Para teste de clivagem in vitro de gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>Adaptador de grampo de cabelo CIRCLE-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1274</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAG</td>
			<td>TruSeq F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>TruSeqF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>Sonda TruSeq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>Sonda TruSeq</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sequências de gRNA e primers usados para análise CIRCLE-seq do locus AAVS1 .

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Aqui, apresentamos um protocolo que integra a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que são cruciais para a capacidade proliferativa anormal de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras.

Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

A eficiência do método de Edição Aprimorada do Genoma via Entrega de Ácidos Nucléicos Ovidutais (I-GONAD) é comparável à microinjeção tradicional, que requer coleta de zigoto de fêmeas doadoras e transferência para fêmeas pseudo-grávidas. Este protocolo demonstra sua eficácia introduzindo mutações induzidas por CRISPR/Cas9 no locus ROSA26 no cromossomo 6.

Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda o método CIRCLE-seq para identificar sites de clivagem fora do alvo em edição genética CRISPR-Cas9 usando células-tronco pluripotentes induzidas. Esta técnica bioinformática melhora a segurança de terapias gênicas.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

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