Name: Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a usar ensaio de ligação de proximidade combinado com marcação Gamma-H2AX em células U2OS para localizar interações proteicas em locais de dano ao DNA. Este protocolo avança pesquisas em biologia celular e terapia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avaliando a interação e localização de proteínas em danos ao DNA

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placas pretas de 384 poços</td><td>Perkin Elmer Placas transportadoras</td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>Donkey&nbsp; anti- Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Donkey anti Mouse Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td> Duolink diluente de anticorpos Sigma DUO82008 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duolink solução de bloqueio 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de detecção Duolink Far red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti cabra mais</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti coelho mais</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposídeo</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>SC-5517</td><td>cabra anti Nek4 foi usado na diluição 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Leica DMI microscópio Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>mouse anti Ku70 foi usado na diluição 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti TOPII&beta;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Rabbit anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Rabbit anti Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 diluição</td></tr><tr><td>U2OS linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao dna

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Observamos interação Nek4-Ku70 na ausência de tratamento com etoposídeo. No entanto, essa interação pode ocorrer fora do núcleo (Figura 1A). A interação Nek4-Ku70 aumenta após o dano ao DNA e está concentrada no núcleo (Figura 1A). No caso da interação Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), utilizada neste ensaio como controle positivo com base nos resultados da literatura18, a interação é muito aumentada pelo tratamento com etoposídeo (Figura 1B).
O tratamento com etoposídeo promove um incremento de quase 40% (uma média de 9 pontos/núcleo nas células tratadas com veículo versus 12 - 14 pontos/núcleo nas células tratadas com etoposídeo). A interação de Nek4 e Ku70 não é exclusiva das condições de dano ao DNA. De fato, Nguyen et al.12 mostraram que essas proteínas podem interagir na ausência do insulto celular e não são dependentes do DNA, o que significa que a interação nem sempre ocorre em locais de dano ao DNA.
A coloração γ-H2AX está ausente nas condições de controle, mas aumenta após 20 min de tratamento com etoposídeo e é mantida até 3 h de tratamento (Figura 1C). Alguns dos pontos de interação estão próximos da coloração γ-H2AX (Figura 1C). Após 1 h de tratamento, a maioria dos pontos de interação Nek4-Ku70 está concentrada em focos de dano ao DNA (Figura 1C).
O knockdown para Nek4 é de cerca de 70% (dados não apresentados), o que significa que o sinal não será completamente eliminado. Acreditamos que a diferença no número de pontos/núcleos não é equivalente à depleção de proteínas porque a proteína reminiscente será dedicada à resposta a danos no DNA e então interagirá com Ku70. A média de pontos/núcleo encontrados nas células knockdown Nek4 tratadas por 3 h com etoposídeo é de 10, o que significa uma redução de cerca de 30% em comparação com as células PLKO de controle na mesma condição. Se considerarmos que o etoposídeo aumenta a interação Nek4-Ku em 40% em relação às células tratadas com veículo, e tivermos 70% de knockdown de Nek4, as células knockdown apresentarão cerca de 10 pontos/núcleo. A interação de Nek4 e Ku70 não é exclusiva da resposta ao dano ao DNA e, embora seja aumentada após o dano ao DNA, a principal mudança está na localização da interação.
Os resultados aqui apresentados apresentam uma importante ferramenta para localizar a interação de proteínas no contexto da resposta a danos no DNA. Nek4 e Ku70 já foram implicados em DDR, e Nek4 parece ser importante para o recrutamento de Ku70 / Ku80 para os focosde dano ao DNA 12. No entanto, as características espaciais e temporais dessa interação podem ser exploradas usando PLA concomitantemente com a coloração γ-H2AX.
Outras técnicas, como co-imunoprecipitação e imunofluorescência, podem fornecer informações semelhantes, mas separadamente. O uso do marcador γ-H2AX como referência permite o monitoramento temporal e espacial da interação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Figura 1: Interação Nek4 - Ku70 em condições de dano ao DNA. (A) As células U2OS foram incubadas com etoposídeo (25 μM) por 20 min, 1 h e 3 h. DMSO (0,05% por 3 h) foi usado como veículo. Após o tratamento, as células foram fixadas com metanol gelado, e o PLA foi realizado usando anti-Nek4 de cabra e anti-Ku70 de camundongo como anticorpos primários. O núcleo foi corado com Hoechst 33342 e é apresentado em azul; Os pontos de PLA são apresentados em vermelho. As células controle foram tratadas com etoposídeo por 1 h e incubadas apenas com um anticorpo primário (anti-Nek4 de cabra) e ambos os anticorpos secundários. O controle biológico foi de células knockdown de Nek4 (shRNA Nek4) tratadas por 3 h com etoposídeo. (B) Controle positivo do ensaio com base nos resultados da literatura: as células U2OS foram incubadas com 25 μM de etoposídeo por 1 h, e o PLA foi realizado com camundongo anti-Nek5 e coelho anti-TOPIIβ. O gráfico é representativo de um experimento e representa a média mais a média do erro padrão (SEM) de todas as células compreendidas em pelo menos 4 campos diferentes (pelo menos 35 células para controle e 50 células para todas as outras condições). A significância foi obtida por meio do teste t e *: p&lt;0,05, **p&lt;0,01 e *** p&lt;0,001 em comparação com o veículo DMSO. (C) Após o PLA, as células apresentadas em (A) foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo anti-γ-H2AX de coelho. Após 1 h de incubação, o anticorpo secundário contra coelho foi utilizado para detecção de focos de dano ao DNA e é apresentado em verde. As regiões que contêm a co-coloração de PLA e γ-H2AX são ampliadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Estrutura de pastas. As imagens do Nucleus e do PLA devem ser colocadas em pastas diferentes, conforme mostrado aqui. Os nomes dos arquivos devem começar com um prefixo específico (por exemplo, DAPI, PLA) e devem ter uma imagem correspondente em cada pasta (por exemplo, DAPI_control1.tif e PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Janela de parâmetros de macro. Depois de abrir/executar a macro no ImageJ/FIJI, o usuário será solicitado a escolher as pastas de dados e inserir os parâmetros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: Arquivo de macro criado para ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.

Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Enquanto colisões de bifurcação de replicação com adutos de DNA podem induzir quebras de fita dupla, pouco se sabe sobre a interação entre replisomos e lesões de bloqueio. Empregamos o ensaio de ligadura de proximidade para visualizar esses encontros e caracterizar as consequências para a composição do replisome.

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Aprenda a usar ensaio de ligação de proximidade combinado com marcação Gamma-H2AX em células U2OS para localizar interações proteicas em locais de dano ao DNA. Este protocolo avança pesquisas em biologia celular e terapia.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

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