Name: Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Descubra vias compensatórias em parasitas da malária com alelo hipomórfico de quinases essenciais usando edição CRISPR-Cas9. Esta pesquisa revela que a inibição dual de quinases pode prevenir resistência medicamentosa.

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<meta charset="utf8"></head><body>Identificando a religação de quinases no parasita da malária: uma abordagem de genética química

<table><tbody><tr><td>1x coquetel inibidor de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Coelho HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ThermoFisher Centrífuga</td><td>micro 17R</td><td></td>da Scientific Sorvall</tr><tr><td>legend (Para peletização de células bacterianas)</td><td>Centrífuga ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>(Para peletização/processamento de parasitas)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (rotor TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS células competentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Células competentes</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação, espaço de 0,2 cm</td><td></td><td>BioRad 1652086</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP reagente quimioluminescente</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Mancha</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Livre</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonagem HD em fusão</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, desfosforilado</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR kit Mini</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>mesilato de p-nitrobenzila (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA Polimerase</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Kit de Minipreparação Spin Qiaprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL kit de mutagênese dirigida ao local</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr>Kit de síntese de primeira fita <td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo éster de tiofosfato</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

WT CDPK1 recombinante é expresso como uma proteína de fusão com uma etiqueta N-terminal de glutationa S-transferase (GST) e purificado usando cromatografia de afinidade GST. A proteína CDPK1 purificada foi detectada por Western blot usando anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST (Figura 1). O resíduo de gatekeeper treonina (T145) em WT CDPK1 foi substituído por Met e Ser usando mutagênese dirigida ao local para gerar proteínas recombinantes mutantes CDPK1T145M e CDPK1T145S, respectivamente (Figura 2). O ensaio de quinase in vitro foi feito para avaliar a atividade da quinase de todas as proteínas CDPK1 recombinantes. A atividade da quinase foi testada usando uma abordagem de marcação de epítopos semissintéticos34 , detectando o grupo éster tiofosfato usando um anticorpo específico em um formato de Western blot (Figura 3). O impacto da substituição do gatekeeper na atividade de autofosforilação de CDPK1 e na transfosforilação de MBP usado como substrato exógeno de CDPK1 foi avaliado quantificando a intensidade das respectivas bandas de autofosforilação e transfosforilação. O CDPK1 mutante com gatekeeper de metionina reteve ~ 53% da atividade de transfosforilação, enquanto a presença de uma serina na posição de gatekeeper levou à revogação completa da transfosforilação do substrato (Figura 3). Os SNPs que levam à substituição do gatekeeper de Thr para Met (T145M) foram projetados no locus endógeno cdpk1 através do CRISPR-Cas9 usando um sistema de dois plasmídeos (Figura 4 e Figura 5). Parasitas mutantes com substituição T145S não puderam ser gerados, possivelmente devido ao efeito letal do gatekeeper Ser na atividade de CDPK1. Os CDPK1T145M parasitas mutantes foram subclonados usando o método de diluição limitante, e a substituição do gatekeeper foi confirmada por meio de sequenciamento de Sanger para verificar a geração do parasita CDPK1T145M mutante. Os níveis de transcrição de 11 quinases diferentes, incluindo 7 membros da família CDPK e 4 outras quinases envolvidas no desenvolvimento esquizogônico tardio do parasita, foram testados usando PCR em tempo real (Figura 6). Os níveis de expressão de 11 quinases diferentes foram comparados entre os parasitas CDPK1T145M mutantes e selvagens (WT), normalizados para os genes housekeeping. A expressão do transcrito dos membros da família CDPK foi alterada no mutante CDPK1T145M em comparação com o parasita WT (Figura 6). Os transcritos que mostram maior expressão no mutante CDPK1T145M podem estar compensando a função de CDPK1 no parasita mutante CDPK1T145M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Figura 1: Caracterização do tipo selvagem recombinante de comprimento total (WT) PfCDPK1. A proteína WT CDPK1 de comprimento total fundida com a etiqueta N-terminal de glutationa S transferase (GST) foi purificada por cromatografia de afinidade e separada em 10% de SDS-PAGE. CDPK1 migrou para a massa molecular prevista de ~ 87 kDa, conforme mostrado no gel de poliacrilamida corado Coomassie Brilliant Blue R-250. A proteína recombinante separada no SDS-PAGE foi transferida para uma membrana de PVDF e processada para análise de Western blot com anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST. A banda correspondente ao CDPK1 recombinante de comprimento total em SDS-PAGE foi detectada com ambos os anticorpos, confirmando a identidade da proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização de proteínas mutantes gatekeeper CDPK1 recombinantes purificadas. (A) Alinhamento da sequência de aminoácidos primários de TgCDPK1 e PfCDPK1 (Plasmodb acesso nº. PF3D7_0217500). A treonina na posição 145 de PfCDPK1 corresponde à glicina 128, a posição de gatekeeper em TgCDPK1 (destacada em vermelho). (B) Representação do cartunista do resíduo do porteiro Thr (destacado em vermelho) codificado pelo códon triplo ACC (círculo preto) em WT CDPK1. Substituição do resíduo do gatekeeper por mutagênese dirigida ao local para gerar proteínas CDPK1 mutantes recombinantes com Met (destacado em amarelo) em CDPKT145M e Ser (destacado em azul) em CDPKT145S. (C) Perfil SDS-PAGE de WT recombinante e proteínas mutantes de CDPK1. As proteínas mutantes WT recombinantes e gatekeeper foram purificadas por cromatografia de afinidade GST e separadas em SDS-PAGE. Todas as proteínas recombinantes estão em conformidade com o peso molecular esperado de ~ 87 kDa. M- escada de peso molecular. (D) Caracterização de CDPK1 WT recombinante e proteínas mutantes por Western blotting. As proteínas mutantes WT e gatekeeper recombinantes de CDPK1 foram separadas em SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para Western blotting. Bandas correspondentes às proteínas WT recombinantes de comprimento total e CDPK1 mutantes em SDS-PAGE foram detectadas com anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST, confirmando a identidade de todas as proteínas recombinantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Figura 3: A substituição do gatekeeper em CDPK1 leva a uma diminuição na atividade quinase de enzimas mutantes. (A) Representação do cartunista da abordagem de marcação de epítopos semi-sintéticos para detectar a atividade da quinase da proteína CDPK1. Apenas a atividade de transfosforilação é representada aqui. A proteína CDPK1 tiofosforila um substrato exógeno (S, quadrado verde sólido) na presença de ATPγS (triângulo amarelo sólido), uma fonte de grupo tiofosfato terminal transferível). O resíduo tiofosforilado é alquilado por tratamento com mesilato de p-nitrobenzila (PNBM), formando um éster de tiofosfato que é então detectado com um anticorpo que reconhece especificamente o aduto de tiofosfato alquilado. (B) O ensaio de atividade de quinase in vitro usando uma abordagem de marcação de epítopos semissintéticos foi usado para testar o efeito da substituição do gatekeeper no potencial de autofosforilação e transfosforilação de proteínas mutantes CDPK1 recombinantes. Todas as proteínas recombinantes exibem atividade quinase dependente de cálcio. A autofosforilação de CDPK1 e a transfosforilação da proteína básica da mielina (MBP), um substrato exógeno, foram evidentes apenas na presença de cloreto de cálcio (Ca2+), enquanto nenhuma fosforilação foi detectada na presença de EGTA, um quelante específico de íons Ca2+ . Os mutantes gatekeeper mostram atividade de autofosforilação reduzida, enquanto a transfosforilação de MBP foi completamente anulada em CDPK1T145S. CDPK1T145M retém o potencial de transfosforilação (~ 53%), conforme relatado anteriormente32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Figura 4: Construção de plasmídeos para introdução de SNPs na posição de gatekeeper no locus cdpk1 usando CRISPR-Cas9. Uma sequência guia de 20 nucleotídeos correspondentes a 432 a 451 pb foi clonada no sítio de restrição BtgZI no plasmídeo pL6eGFP para gerar pL6CK1G. Um braço de homologia (421 pb) incorporando os SNPs desejados (T145M ou T145S, códon correspondente mostrado em verde) junto com mutações de escudo (mostrado em vermelho) foi clonado em pL6CK1G dentro dos locais de enzimas de restrição AflII e SpeI para gerar pL6CK1GT145M e pL6CK1GT145M, respectivamente. As mutações do escudo impedem o recorte do locus modificado após a edição desejada. Cas9 endonuclease codificada em um segundo plasmídeo, pUF1 é direcionada para o local alvo dentro do locus cdpk1 com a ajuda do RNA guia expresso do plasmídeo pL6CK1GT145M / S . Cas9 introduz quebra de fita dupla no local alvo em direção ao lado 5' da sequência PAM. O DSB é reparado usando braço de homologia no plasmídeo pL6CK1GT145M / S . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Figura 5: Representação esquemática de P. transfecção de falciparum com plasmídeos CRISPR para a introdução da mutação gatekeeper (T145M) no locus cdpk1 . i) P. assíncrono. A cultura de falciparum é tratada com sorbitol para obter parasitas sincronizados em estágio de anel. ii) Os parasitas sincronizados em estágio de anel são coletados em uma cubeta de eletroporação junto com os plasmídeos pL6CK1G, T145M / S e pUF1 ressuspensos em solução tampão. iii) Os parasitas são eletroporados a 310 volts, 950 μF e resistência infinita. iv) Após a transfecção, os parasitas são transferidos para um frasco T25 contendo meio RPMI completo fresco (cRPMI) e cultivados por 48 h. Após 48 h, os parasitas transfectados são trocados para cRPMI suplementado com as drogas WR99210 e DSM267 e expandido no frasco T75. v) No dia 14, as lâminas são preparadas e coradas com a coloração de Giemsa. vi) Posteriormente, o esfregaço de sangue é visualizado ao microscópio óptico para avaliar a presença de hemácias parasitadas. vii) Após a visualização, os parasitas podem crescer na presença de drogas. Posteriormente, os parasitas são processados para obter o molde para PCR e sequenciamento de DNA para verificação da modificação desejada do locus cdpk1 alvo. viii) Após a verificação, os parasitas transgênicos clonais são obtidos estabelecendo diluição limitante em uma placa de 96 poços. ix) Parasitas transgênicos clonais de poços positivos são transferidos para frascos T25 e deixados crescer. x) Os parasitas transgênicos clonais são validados por PCR e presença de SNPs desejados na posição de gatekeeper por meio de sequenciamento de DNA e análise do cromatograma. O número é modificado de32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Figura 6: Representação esquemática das etapas usadas para análise de transcrição de genes-alvo por meio de PCR em tempo real (RT-PCR). A cultura de falciparum com parasitas predominantemente maduros no estágio Schizonte é obtida através do tratamento com sorbitol no mesmo ciclo. ii) Os parasitas são suavemente colocados em camadas em um gradiente de 70/40 Percoll / sorbitol em um tubo cônico de 15 mL para enriquecimento de parasitas maduros em estágio esquizonte. iii) O anel de cor preta na interfase de 40% e 70% pessoal/sorbitol é transferido para um tubo novo de 50 mL, processado e ressuspenso em cRPMI. Os parasitas enriquecidos em estágio esquizonte são incubados com hemácias frescas pré-incubadas a 37 ° C para invasão. iv) Os parasitas são cultivados por 4 h e depois tratados com 5% de sorbitol para obter parasitas em estágio de anel de 0-4 h altamente sincronizados. v) Os parasitas são cultivados por mais 44 h após o tratamento com sorbitol para obter parasitas altamente sincronizados no estágio esquizonte de 44-48 h. vi) Os parasitas sincronizados são tratados com saponina para liberá-los das hemácias e armazenados em reagente de extração de RNA. O RNA total é isolado dos parasitas ressuspensos da extração de RNA. vii) o cDNA é preparado a partir do RNA isolado. viii) Um experimento de PCR em tempo real é configurado com o modelo de cDNA para amplificar os genes-alvo usando primers específicos do gene. A placa é executada em um sistema de PCR em tempo real. ix) Os dados de expressão do transcrito são analisados usando um software de análise. O gráfico representa os níveis diferenciais de expressão de transcritos de 11 quinases em parasitas CDPK1 T145M em comparação com o tipo selvagem (WT). Este número é modificado de32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome do gene</td>
			<td colspan="4">Sequência de primer</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTATTTTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>ck1f1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista de primers usados no estudo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome do gene</td>
			<td colspan="2">Primer Direto</td>
			<td colspan="2">Primer reverso</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PACOTE (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Lista de genes-alvo (número de identificação do PlasmoDB) juntamente com a sequência dos primers usados para a análise de PCR em tempo real.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

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