Name: Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo in vitro integrando rigidez do substrato e fluxo laminar para estudar respostas de células endoteliais humanas. Este sistema avança a pesquisa em mecanotransdução vascular e doenças como aterosclerose.

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Os autores estendem sua gratidão a Robert Egan por sua ajuda na fabricação da câmara de fluxo. Os autores agradecem a Lucas McCauley por sua ajuda durante os experimentos. Além disso, eles gostariam de agradecer às instalações centrais do Instituto de Imagens Químicas de Sistemas Vivos (CILS) da Northeastern University por conceder acesso a microscópios confocais. Os autores reconhecem o apoio financeiro fornecido pelo National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 concedido ao SB) e pela National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 ao SB e CMMI 1846962 ao EE).

Estudo da rigidez tecidual e dos efeitos do estresse de cisalhamento nas células endoteliais

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
<li>James, B. D., Allen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+behavior+in+complex+mechanical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).</li>
<li>Yeh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulates+endothelial+cell+proliferation+through+septin+9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9.</a> PLoS One. 7 (10), e4688(2012).</li>
<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Comm Biol. 4 (1), 764(2021).</li>
<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram que um pedido provisório de patente (nº 63/634.853) foi depositado com o título Câmara de Fluxo com Substrato Mecanicamente Sintonizável, e que não existem outros interesses conflitantes.

O sistema vascular é um ambiente dinâmico onde várias forças influenciam significativamente o comportamento celular. Estudar eventos biológicos em doenças cardiovasculares sem considerar essas forças seria impreciso. Assim, modelos celulares capazes de emular o ambiente mecânico vascular são cruciais. Os pesquisadores já fizeram progressos significativos ao destacar o efeito dessas forças no comportamento celular11. No entanto, para entender o comportamento celular em condições patológicas e fisio...

O endotélio, que reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos, desempenha um papel fundamental na manutenção da saúde vascular. As células endoteliais (CEs) são fundamentais para regular várias funções cardiovasculares, incluindo controle do tônus dos vasos, permeabilidade seletiva, hemostasia e mecanotransdução 1,2. A pesquisa ligou firmemente a disfunção da CE a um papel primário no desenvolvimento da aterosclerose. Notavelmente, os CEs encontram diversas forças mecânicas nas interfaces onde interagem com o fluxo sanguíneo e os tecidos dos vasos subjacentes 3,4. Vários estudos associaram a disfunção da CE a alterações anormais em fatores mecânicos dentro do ambiente vascular, como a tensão de cisalhamento do fluido do fluxo sanguíneo e a rigidez do tecido 5,6,7.
No entanto, pesquisas anteriores receberam atenção limitada na compreensão dos efeitos combinados da rigidez do tecido e da tensão de cisalhamento na função do CE. Para aumentar a capacidade de traduzir os resultados da pesquisa em tratamentos eficazes para aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, é essencial melhorar os modelos celulares usados no campo. Um progresso significativo foi feito na humanização de modelos celulares, empregando CEs humanos e submetendo-os a tensões de cisalhamento ou substratos com níveis de rigidez variados 8,9,10. No entanto, a adoção e o refinamento de modelos celulares que integram ambientes de fluxo dinâmico com substratos EC que possuem propriedades de rigidez ajustáveis progrediram lentamente. O desafio está na criação de substratos de EC sem inchamento para evitar alterações nos parâmetros de fluxo dentro do canal de fluxo, ao mesmo tempo em que facilita o cultivo de monocamadas de EC intactas e bem aderidas. Um modelo in vitro capaz de superar esses obstáculos poderia facilitar investigações mais eficazes sobre como a hipertensão, o envelhecimento e as condições de fluxo influenciam de forma colaborativa a mecanotransdução da CE, a saúde vascular e, em última análise, o desenvolvimento da aterosclerose. Vários métodos foram desenvolvidos para aplicar tensão de cisalhamento nas células enquanto controla a rigidez do substrato, incluindo placas rotativas e dispositivos microfluídicos. No método da placa rotativa, as células são colocadas entre duas placas e a tensão de cisalhamento é aplicada através do movimento rotacional das placas. Este método é menos complicado e fornece um modelo rápido; no entanto, sofre de variação espacial da tensão de cisalhamento, com tensão de cisalhamento zero no centro e tensão de cisalhamento máxima na periferia11.
Por outro lado, os dispositivos microfluídicos representam a nova geração de ferramentas com a capacidade de controlar a rigidez do substrato e as condições de fluxo. Esses sistemas são adequados para imitar microvasculaturas sob condições de fluxo laminar. No entanto, o estudo da aterosclerose com esses dispositivos é impraticável, pois a aterosclerose ocorre em grandes vasos com fluxo perturbado11. Este artigo tem como objetivo contribuir para o domínio crítico de pesquisa dos estudos de EC, apresentando um sistema econômico capaz de examinar os efeitos de níveis variáveis de rigidez em substratos de EC sob diferentes condições de fluxo. O sistema integra substratos com diferentes rigidezes para emular vasos sanguíneos patológicos e fisiológicos. Este protocolo descreve o método para a criação de hidrogéis à base de gelatina sem níveis de inchaço e rigidez de 5 kPa e 10 kPa, representando rigidez fisiológica e patológica, respectivamente. Além disso, é detalhada a construção de uma câmara de fluxo de placas paralelas capaz de integrar esses substratos. A fluidodinâmica computacional (CFD) foi empregada para avaliar a tensão de cisalhamento e as condições de escoamento. A preparação de hidrogéis para cultura de CE e a execução de um experimento de fluxo de 6 h são descritas, seguidas de uma discussão sobre a imunomarcação pós-experimento.

<table><tbody><tr><td>(trimetoxissilil)metacrilato de propil, tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Fabricação de hidrogel</td></tr><tr><td>3-(trimetoxissilil)metacrilato de propila</td><td>Salinização</td><td>de vidro 440159</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) - contendo mídia de montagem Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Faloidina&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>8953S</td><td>Persulfato de</td></tr><tr><td>Amônio Imunocolorido (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Fabricação de Hidrogel</td></tr><tr><td>Folha de Acrílico Fundido Transparente Resistente a Arranhões e UV (45/64'')</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>Fabricação de Câmara de</td></tr><tr><td>Fluxo Microscópio Confocal</td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Seringas Rígidas Covidien Monoject 60 mL sem Agulhas</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>22-031-375</td><td>Kit de crescimento EC Flow Experiment</td></tr><tr><td></td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td> <td>PCS-100-041</td><td>Etanol de Cultura</td></tr> de <tr><td>Células 200 Prova</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>Gelatina de Salinização</td></tr><tr><td>de Vidro Tipo A (300 bloom) de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Síntese</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Salinização de Vidro</td></tr><tr><td>Silicone de Alta Pureza e Alta Temperatura Folha de borracha</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>Fabricação de câmara de fluxo</td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)</td> <td>Coleção de cultura de tipo americano (ATCC)</td> <td>PSC-100-010 Parafusos de</td> máquina de <td>cultura celular</td></tr><tr><td>M3x30mm Parafuso de cabeça redonda de soquete hexagonal 304 Parafusos de fixação de aço inoxidável 20pcs</td><td>Uxcell</td><td>B07Q5RM2TP</td><td>Fabricação de</td></tr> <tr><td>câmara de fluxoDrive Digital Masterflex L/S com Easy-Load&reg; 3 Cabeça de bomba para tubulação de precisão; 115/230 VAC</td><td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td><td>Experiência de Fluxo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>Flow Experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>Anidrido metacrílico (MAH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA Síntese</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td> geral <td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA Síntese</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr>Versão <td></td><td></td><td></td><td>educacional do SOLIDWORKS</td></tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Flow Chamber Design</td></tr><tr><td>Vascular Basal Medium</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>Cell Culture</td></tr></tbody></table>

modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

Apresentamos um modelo in vitro inovador com o objetivo de investigar os efeitos combinados da rigidez tecidual e do estresse de cisalhamento na função das células endoteliais (CE), que são cruciais para a compreensão da saúde vascular e o aparecimento de doenças como a aterosclerose. Tradicionalmente, os estudos têm explorado os impactos da tensão de cisalhamento e da rigidez do substrato nos CEs, de forma independente. No entanto, este sistema integrado combina esses fatores para fornecer uma simulação mais precisa do ambiente mecânico da vasculatura. O objetivo é examinar a mecanotransdução de EC em vários níveis de rigidez tecidual e condições de fluxo usando ECs humanos. Detalhamos o protocolo para sintetizar hidrogéis de metacrilato de gelatina (GelMA) com rigidez ajustável e semeá-los com CEs para obter confluência. Além disso, descrevemos o projeto e a montagem de uma câmara de fluxo econômica, complementada por simulações computacionais de dinâmica de fluidos, para gerar condições fisiológicas de fluxo caracterizadas por fluxo laminar e níveis apropriados de tensão de cisalhamento. O protocolo também incorpora marcação de fluorescência para microscopia confocal, permitindo a avaliação das respostas do EC às condições de complacência do tecido e fluxo. Ao submeter CEs cultivados a múltiplos estímulos mecânicos integrados, este modelo permite investigações abrangentes sobre como fatores como hipertensão e envelhecimento podem afetar a função da CE e as doenças vasculares mediadas pela CE. Os insights obtidos com essas investigações serão fundamentais para elucidar os mecanismos subjacentes às doenças vasculares e desenvolver estratégias de tratamento eficazes.

A Figura 1 mostra a configuração experimental, descrevendo o processo de síntese de GelMA por meio de uma reação de metacrilação. O produto resultante foi então usado para fabricar o substrato de hidrogel, no qual os CEs foram semeados. Posteriormente, as células foram introduzidas na câmara de fluxo para um experimento de fluxo de 6 h a 12 dinas/cm2.
1A espectroscopia de RMN H foi usada para avaliar o sucesso da reação de metacrilação <stron...

Sintetizamos e caracterizamos um substrato ajustável à base de gelatina para cultura de células endoteliais vasculares (CEs) sob condições relevantes de fluxo vascular. Esta superfície biomimética replica condições fisiológicas e patológicas, permitindo o estudo de forças mecânicas no comportamento da CE e avançando nossa compreensão da saúde vascular e dos mecanismos de doença.

Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Este estudo concentra-se na mecanobiologia no que se refere à aterosclerose e hipertensão. As principais questões que pretendemos abordar são: primeira, como podemos replicar com maior precisão o ambiente vascular sob condições fisiológicas e patológicas? Segunda, quais são as respostas celulares das células endoteliais quando expostas simultaneamente a esses estímulos mecânicos?O estudo tem como objetivo fornecer uma simulação mais precisa do ambiente vascular ao integrar rigidez do substrato e condições de fluxo em um único sistema. Modelos in vitro anteriores ou investigam a rigidez do substrato em condições estáticas ou estudam o efeito do fluxo sobre células endoteliais cultivadas em um substrato rígido, ambos fisiologicamente irrelevantes. Para começar, adicione 10 gramas de gelatina tipo A, 300 bloom, proveniente da pele de suíno, a 100 mililitros de tampão bicarbonato de carbonato.Dissolva a gelatina em banho-maria a 55 graus Celsius, agitando a solução a 700 rpm usando um agitador magnético. Após completa dissolução, ajuste o pH da solução de gelatina para 9,5 utilizando hidróxido de sódio 0,1 molar. Para iniciar a metacrililação, adicione 938 microlitros de anidrido metac

in-vitro-model-integrating-substrate-stiffness-flow-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado "chip larva 'para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Aqui, é descrito um método que permite a preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. O método não requer nenhum equipamento especializado e pode ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa. Seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

cultura de órgão inteiro do disco intervertebral (IVD) preserva a matriz extracelular nativa, fenótipos celulares, e interacções de matriz celular. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura IVD utilizando lombar do mouse e IVDs caudal em suas unidades da coluna vertebral funcionais e várias aplicações que utilizam este sistema.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

Aprenda a desenvolver um modelo in vitro integrando rigidez do substrato e fluxo laminar para estudar respostas de células endoteliais humanas. Este sistema avança a pesquisa em mecanotransdução vascular e doenças como aterosclerose.

Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais

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