Name: Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda experimentos de relaxação de RMN 15N para investigar a dinâmica estrutural de proteínas intrinsecamente desordenadas em escalas de picossegundos a nanossegundos. Este protocolo permite análise específica de resíduos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para Relaxamento de RMN 15N e Experimentos de hetNOE no Estudo de Dinâmica de Proteínas

Este protocolo descreveu a configuração de experimentos de relaxamento de RMN 15N por Lakomek et al.69 e Stief et al.70. Nós nos concentramos nas sequências de pulso de RMN usando um esquema de detecção HSQC aprimorado por sensibilidade. Os experimentos 15N R1 e R1ρ são implementados conforme descrito em detalhes por Stief et al.70, e o experimento hetNOE é descrito por Lakomek et al.69.
Ao configurar os experimentos de relaxamento de RMN, o 15N R1ρ é o mais crítico, pois a escolha de um período de relaxamento máximo muito longo ou uma amplitude de RF muito alta do bloqueio de rotação pode danificar a sonda. Para o período de relaxamento, é desejável amostrar a curva de decaimento total igualmente de 100% a 25% de intensidade (em comparação com o experimento de referência). Para proteínas de relaxamento lento, como IDPs, com longos 15N T2 vezes, freqüentemente não será acessível amostrar a curva de decaimento em toda a extensão porque a deposição de energia na sonda precisa ser limitada.
Para a amplitude de radiofrequência (RF) de 15N, teoricamente, quanto maior a amplitude de RF, νspin-lock, melhor, pois mais processos de troca podem ser reorientados. Como regra geral, os processos de troca mais lentos que 1 / (2π νspin-lock ) podem ser reorientados. No entanto, aplicam-se limitações de potência de RF. Por exemplo, em nossa mão, não excederíamos um período máximo de bloqueio de rotação de 65 ms quando uma amplitude de RF de 2 kHz é aplicada para permanecer no lado seguro. Ao mesmo tempo, a amplitude de RF spin-lock em um espectrômetro de 600 MHz deve ser superior a 1 kHz, por exemplo, 1,4 kHz a 600 MHz, o que provou ser suficiente para a pequena proteína globular gb369. Para cobrir as larguras espectrais e evitar efeitos fora da ressonância em intensidades de campo mais altas, a amplitude de RF correspondente deve ser dimensionada com o campo magnético, por exemplo, 1,5 vezes maior a 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). No entanto, ele deve permanecer dentro das limitações da investigação. (Consulte a lista local de limitações de potência do espectrômetro e entre em contato com o gerente da instalação de RMN para obter orientação.)
Para a escolha do espaçamento dos atrasos de relaxamento entre o experimento de referência (atraso em curto-circuito) e o período de atraso mais longo (determinado pelos fatores discutidos acima), preferimos o espaçamento igual dos pontos de dados do atraso de relaxamento e escolhemos um número de 8 (se o tempo de medição alocado e o sinal-ruído permitirem). O primeiro incremento (e os subsequentes) será dominado pelos resíduos mais intensos (e frequentemente mais lentos). Portanto, dependendo da faixa dinâmica da proteína, os sinais de RMN de vários resíduos na sequência da proteína podem já ter decaído após o período máximo de relaxamento escolhido. Ao espaçar igualmente os pontos de atraso, garantimos que as curvas de relaxamento dos resíduos de relaxamento rápido também sejam cobertas por um número suficiente de pontos de dados que amostram a curva de relaxamento.
Além disso, uma boa escolha de atraso de recuperação é essencial para obter dados precisos de relaxamento e evitar danos a longo prazo à sonda. Escolhemos um atraso de recuperação de pelo menos D1 = 2 s para evitar qualquer dano à sonda. Para resultados precisos, a polarização longitudinal das proteínas 1H e 15N também deve ter tempo suficiente para retornar ao equilíbrio ou pelo menos a um estado estável e estacionário. O 1H T1 geralmente varia entre 1 s e 4 s a 600 MHz para uma proteína de tamanho pequeno ou médio (até 20 kDa); para proteínas maiores e campos mais altos, o 1H T1 aumentará ainda mais. Para a pequena proteína globular gb3, encontramos D1 = 3,5 s suficiente para os experimentos de 15N R1 e R1ρ . Para o pequeno IDP Syb-2 apresentado neste protocolo, mostramos recentemente que D1 = 2 s foi adequado70.
O 15N hetNOE tem a menor sensibilidade, pois a excitação começa em 15N, e nenhum 1 H-15N INEPT no início da sequência de pulso é aplicado. Além disso, o período de saturação de 1H e o atraso de recuperação de 15N devem ser 5 vezes 15N T1 para obter dados precisos. Enquanto para o IDP Syb-2 apresentado aqui, um atraso de saturação / recuperação de 5 s mais um atraso de recuperação D1 extra de 2 s (total de 7 s) foi suficiente, para proteínas maiores e / ou proteínas deuteradas, esse tempo pode ser substancialmente mais longo, por exemplo, 10 s ou mais. No entanto, se os dados qualitativos forem bons o suficiente, um ligeiro deslocamento sistemático pode ser aceito. Nesse caso, resultados razoáveis podem ser obtidos já em 3 vezes 15N T1, pois 95% da saturação será alcançada. Nesse caso, os valores de hetNOE resultantes mostrarão um deslocamento sistemático para valores mais altos.
Neste protocolo, trabalhamos com 15N Syb-2 totalmente protonado, que é o mais econômico. A deuteração de cadeia lateral é recomendada para reduzir o número de vias de relaxamento e trabalhar com os pares de spin de amida da espinha dorsal 1 H-15N mais isolados. No entanto, comparando 15N2H Syb-2 e 15N syb-2, notamos apenas poucas diferenças entre amostras deuteradas e totalmente protonadas70. Para fins práticos, os dados de relaxamento de RMN são freqüentemente registrados nas amostras marcadas dupla ou tripla (15N13C ou 2H15N13C). As sequências de pulso de RMN discutidas são capazes de reorientar a evolução do acoplamento J entre 13C com núcleos de 1H ou 15N. Obviamente, também as vias de relaxamento aumentarão quando a marcação de 13C for introduzida. No entanto, em nossas mãos, para fins práticos, o erro introduzido, se for o caso, é inferior a 5% e pode ser aceitável quando apenas dados qualitativos são necessários.
Ao trabalhar com proteínas de diferentes tamanhos para detecção, freqüentemente há a questão de escolher experimentos detectados por HSQC com sensibilidadeaprimorada 70 ou experimentos detectados por TROSY69. Para proteínas pequenas, os experimentos de RMN detectados por HSQC com sensibilidade aprimorada oferecem um ganho de duas vezes em relação sinal-ruído (desde que uma boa supressão de água possa ser obtida). Para proteínas maiores, os experimentos detectados pelo TROSY vencerão. O ponto de equilíbrio é de aproximadamente 20 kDa para proteínas dobradas. Para IDPs, para os quais podem ser obtidas constantes de taxa R2 baixas que aumentam aproximadamente linearmente com o aumento do comprimento da cadeia, o ponto de equilíbrio pode ser deslocado para pesos moleculares mais altos. Para fins práticos, recomendamos a implementação dos experimentos detectados por HSQC ou detectados por TROSY com sensibilidade aprimorada em caso de dúvida. Em seguida, escolha aquele que fornece a melhor relação sinal-ruído no primeiro incremento.
A discussão sobre a escolha dos experimentos detectados por HSQC ou TROSY com sensibilidade aprimorada só se aplica quando a relação sinal-ruído é o critério principal. Quando as menores larguras de linha e a resolução mais alta são necessárias, o TROSY sempre vencerá. A TROSY também oferece sempre a melhor supressão de água, pois são necessários menos pulsos de prótons e nenhum desacoplamento de prótons. Referimo-nos ao artigo69 publicado anteriormente para uma discussão mais extensa.
Mais uma observação sobre a questão da supressão da água. Embora definir o ganho do receptor (rg) para 16 possa ser suficiente nos consoles Bruker Avance NEO, um ganho do receptor na faixa de 128-256 geralmente é desejável para consoles Bruker Avance (mais antigos). O rg alcançável (determinado pelo comando ruga de Bruker) é freqüentemente obtido a partir da intensidade do sinal de água residual até o nível de ruído. Uma supressão de água ruim sempre introduzirá ruído adicional nos espectros. Assim, mesmo que um rg = 16 possa ser alcançado em um console Bruker Avance NEO, o sinal de água restante pode contribuir substancialmente para o nível de ruído. Portanto, a relação sinal-ruído seria reduzida. Consequentemente, recomendamos apontar para um nível rg de 128-256. As sequências de pulso70 apresentadas foram testadas em 600 MHz e 1200 MHz. Ambas as intensidades de campo funcionam com a mesma configuração de gradiente, conforme escrito na sequência de pulsos. Nós os recomendamos pelo menos como um bom ponto de partida para uma otimização adicional.
Conforme mencionado na introdução, os experimentos de relaxamento de RMN discutidos cobrem apenas o intervalo de tempo de picossegundos a nanossegundos. Para obter insights sobre a dinâmica de microssegundos a milissegundos, nos referimos a experimentos de dispersão de relaxamento, experimentos CPMG e uma extensão dos experimentos R1ρ com amplitudes de bloqueio de spin variáveis (ou frequências portadoras) são usados 44,46,58,59,60,61,85,86. Dinâmica mais lenta que microssegundos pode ser capturada 15N CEST (transferência de saturação por troca química) RMN62, espectroscopia de troca (EXSY, milissegundos a segundos) ou RT (tempo real) RMN (segundos a horas)63,64. O efeito PRE (realce de relaxamento paramagnético) das sondas paramagnéticas, bem como os acoplamentos dipolares residuais (RDCs), podem ser usados para avaliar toda a faixa de dinâmica ps a ms 65,66,67,68.
Todos esses experimentos cobrem apenas a dinâmica da espinha dorsal. Para investigar a dinâmica da cadeia lateral, Kay e colegas de trabalho introduziram outra infinidade de experimentos de RMN, fornecendo informações sobre a dinâmica da cadeia lateral para proteínas de até 1 MDa 2,87.
Para obter insights mais quantitativos sobre a dinâmica da estrutura proteica, é necessária uma análise combinada de todos os três parâmetros de RMN, 15N R1, R2 e hetNOE - às vezes envolvendo parâmetros ainda maiores, como constantes de taxa de relaxamento correlacionadas cruzadas. Diferentes métodos de análise sofisticados foram desenvolvidos. A chamada abordagem livre de modelo tem sido amplamente aplicada em RMN biomolecular 43,88,89,90,91. Além disso, o mapeamento da densidade espectral pode fornecer informações valiosas 55,92,93. Embora esses sejam métodos de análise poderosos para proteínas globulares com tempo de correlação rotacional bem definido, sua aplicabilidade é limitada para IDPs. Um domínio dobrado é necessário para definir um tempo de correlação rotacional39. Isso pode ser parcialmente contornado quando a função de correlação C (t) pode ser modelada pela soma de funções exponencialmente decaientes, caso as diferentes escalas de tempo envolvidas possam ser bem separadas23 , 31 , 84 . Na ausência de um tempo de correlação rotacional bem definido, abordagens alternativas envolvendo uma distribuição de tempos de correlação, por exemplo, a análise IMPACT94 ou a análise DETECTOR95,96, são uma alternativa. Além disso, uma análise combinada de dados de relaxamento de RMN e simulações de MD também é promissora para IDPs97; atualmente, ainda estamos enfrentando limitações de amostragem e campo de força para simulações de átomos completos de IDPs maiores31,98.

<table><tbody><tr><td>Espectrômetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>experimentos de RMN realizados&nbsp;</td></tr></tbody></table>

experimentos de relaxamento de rmn 15n para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

A seguir, são apresentados alguns dados exemplares de relaxamento de RMN registrados na proteína SNARE vesicular Synaptobrevin-2 (1-96), freqüentemente chamada de VAMP2 (vesícula-associada à proteína 2). Para registrar os dados de RMN, usamos uma amostra de 171 μM 15N Synaptobrevin-2 (1-96) (apelidada de Syb-2 a seguir) em tampão MES de 50 mM (pH 6,0) contendo 150 mM de NaCl, 0,1 mM de TCEP e 1 mM de EDTA. Todos os dados experimentais foram registrados a 278,15 K usando um volume de 250 μL preenchido em um tubo de amostra de RMN de 3 mm. Os experimentos foram realizados em um espectrômetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD equipado com uma criossonda de ressonância quádrupla Bruker 5 mm QCI 1H, 15N, 13C, 31P.
A Figura 3 mostra as constantes de taxa de relaxamento 15N R1 e R2 específicas do resíduo ajustadas às curvas de relaxamento de RMN obtidas nos experimentos de relaxamento de RMN. No eixo y, as respectivas constantes de taxa de relaxamento são plotadas para os resíduos individuais ao longo da sequência de proteínas (no eixo x). Além disso, são mostrados valores de NOEheteronuclear de 1 H-15N (hetNOE) extraídos das razões de intensidade dos experimentos saturados e não saturados (referência) da medição de RMN heteronuclear de 1 H-15N.
Os dados heteronucleares NOE e as constantes de taxa 15N R2 são mais facilmente interpretados do que os dados 15N R1 . Portanto, vamos começar com eles.
NOE heteronuclear: Os NOE heteronucleares {1H}-15N são sensíveis à dinâmica interna na escala de tempo rápida de picossegundos (&lt;100 ps, devido à sua dependência de relaxamento cruzado), mas também à dinâmica ps - ns (devido à sua dependência R1 ) e podem assumir valores geralmente entre 0 e (um pouco menos que) 1 para proteínas dobradas. Em campos mais altos, eles serão sistematicamente mais altos (mas sempre menores que 1).
Eles descrevem a flexibilidade interna da proteína. Quando os valores de hetNOE nas mesmas intensidades de campo são comparados, ele se mantém: Quanto menor o {1H}-15N NOE, mais dinâmico é o respectivo resíduo. Para IDPs, normalmente são observados pequenos resíduos específicos {1H}-15N NOE, por exemplo, na ordem de 0,5 e menores a 600 MHz. No entanto, NOE negativo {1H}-15N também é encontrado para IDPs, mesmo até -2 a 500 MHz. Para Syb-2 monomérico, {1H}-15N NOE medido a 600 MHz varia entre -0,5 para o terminal N e 0,5 para o domínio do ligante C-terminal. Os valores aumentam gradualmente do terminal N para o C, indicando uma flexibilidade gradualmente decrescente / rigidez crescente (Figura 3C).
15 constantes de taxa N R2 15As constantes de taxa NR2 são sensíveis à dinâmica ps - ns que modula a orientação do vetor de ligação NH pela queda geral da proteína, o movimento dos planos peptídicos e a torção dos ângulos diedros da espinha dorsal. Diferente dos valores de {1H}-15N NOE e R1, as constantes de taxa de 15N R2 são dominadas pela densidade espectral J (0) associada ao tombamento geral (rotacional) da proteína. Portanto, para proteínas dobradas globulares, as constantes de taxa 15N R2 são dimensionadas em tamanho de acordo com a queda geral e o tamanho da proteína. Para IDPs verdadeiros, nenhum tempo de correlação rotacional global pode ser atribuído. Ainda assim, um tempo de correlação lento dependente do comprimento da cadeia pode ser ajustado84, como esperado para polímeros, mas a dinâmica interna específica do resíduo tem um impacto maior nas constantes de taxa de 15N R2 . Dentro da mesma proteína, as constantes de taxa 15N R2 permitem a discriminação de estruturas versus regiões não estruturadas com diferentes mobilidades específicas de resíduos internos. Quanto menor a constante de taxa de 15N R2 observada, mais móvel é o respectivo resíduo. Altas constantes de taxa de 15N R2 são características de elementos de estrutura secundária, como α-hélices ou fitas β. Constantes de taxa de relaxamento R2 baixas são características de regiões intrinsecamente desordenadas e de loop. Para Syb-2 monomérico (1-96), observamos constantes de taxa gerais baixas de 15N R2 consistentes com seu caráter intrinsecamente desordenado. A rigidez interna aumenta (a mobilidade diminui) do terminal N até o domínio do ligante C-terminal antes de seguir para o terminal C flexível ( Figura 3B ).
15constantes de taxa NR 1 As taxas de relaxamento de R1 são sensíveis à dinâmica de picossegundos (ps) e nanossegundos (ns) mais rápidas. No entanto, sua interpretação direta da dinâmica interna é mais complexa do que as anteriores. Existe um campo T1 (R1) mínimo (máximo) quando T1 é plotado em função da correlação rotacional τR: T1min em τR, min = 1/ ω. Para moléculas de queda rápida com τR &lt; τR, min, por exemplo, pequenas moléculas ou pequenas proteínas globulares, constantes de taxa R1 mais baixas indicam aumento da dinâmica da estrutura da proteína (o mesmo que para R2). No caso de proteínas maiores, com τR &gt; τR, min, é o oposto, e constantes de taxa de relaxamento R1 mais altas representam dinâmica aumentada (oposta a R2).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67088/67088fig03.jpg"> Figura 3: Dados de relaxamento de RMN. Os dados foram registrados e avaliados seguindo o protocolo e o fluxo de trabalho descritos acima. (A) Constantes de taxa de relaxamento 15N R1 específicas do resíduo ao longo da estrutura proteica de Syb2 (1-96). (B) 15N R2 constantes de taxa de relaxação, calculadas a partir de R1ρ e R1 (C) taxas de transferência de hetNOE ao longo da espinha dorsal de Syb2 (1-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/67088fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Leitura dos parâmetros de RMN. A interface da macro rpar é exibida. (A) Visão geral de todos os conjuntos de parâmetros. A caixa vermelha marca a barra de pesquisa. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. Clique duas vezes para escolher um conjunto de parâmetros. (B) Visão geral dos parâmetros que podem ser importados para o experimento atual. As opções para executar getprosol ou manter parâmetros específicos do experimento atual são marcadas com caixas vermelhas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Posicionando a frequência portadora de 1H para supressão ideal de água. A interface da macro gs é exibida. Enquanto o experimento está em loop, é possível alterar diferentes parâmetros do experimento. O marcador pode ser usado aqui para alterar o parâmetro escolhido durante a aquisição. Clicar acima do marcador aumenta o parâmetro pelo valor especificado em "sensibilidade". O interruptor de sensibilidade pode ser usado para ajustar o tamanho do passo do marcador. No lado direito, o FID ativo é visível. Para a calibração do O1, o objetivo é minimizar a área do FID marcada com uma caixa vermelha, pois o FID geralmente é dominado pelo sinal de água. A redução da área FID anda de mãos dadas com a diminuição do sinal de água e a melhoria da supressão da água. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Um olhar mais atento sobre a sequência de pulso 1 H-15N HSQC e seus parâmetros de aquisição. (A) Parâmetros da sequência de pulso do experimento 1 H-15N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. Clique em "E" para abrir a janela do editor do programa de pulso em B. (B) Editor do programa de pulso do experimento 1 H-15N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. A linha comentada (linha 91) com um pulso de 15N 90 ° mostra a linha original para um experimento HSQC de 1 H-15N. Na linha 92, o pulso de 15N 90° é alterado para um pulso de 15N 180°. Essa mudança torna o experimento HSQC 1 H-15N um programa de pulso de calibração para a calibração de pulso forte de 90 ° 15N. Para editar sequências de pulso, salve a sequência com um novo nome primeiro. Use o seguinte fluxo de trabalho: Clique em Arquivo, Salvar como, insira o novo nome, clique em OK e clique em Definir PULPROG para o conjunto de dados. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura complementar 4: Configurando os gradientes. A interface da macro gpnam para alterar as formas, comprimentos e intensidades do gradiente é mostrada. Para abrir a interface de parâmetros de sequência de pulsos usada, todas as formas de gradiente GPNAM devem ser inseridas. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 5 suplementar: Configurando os atrasos de relaxamento. Interface da macro vplist (idêntica à macro vclist). (A) Interface para escolher uma vplist. Ao clicar nos três pontos, a interface B é aberta. (B) Interface para escolher uma vplist por DoubleClick, ou criar uma nova lista clicando em Arquivo, e Novo. (C) A interface é aberta criando uma nova lista ou editando uma lista existente. A lista pode ser salva clicando em Arquivo e Salvar. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 6: Parâmetros da sequência de pulso do experimento 15N R1ρ. (A-D) Todos os parâmetros essenciais que devem ser alterados no protocolo são marcados com caixas vermelhas e as etapas associadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%206.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 7 suplementar: Interface da macro shapetool . Um I-BURP2 (usado nos experimentos) é aberto como um pulso de forma. (A) Parâmetros do pulso de forma selecionado. Ao clicar no botão Iniciar simulação de RMN marcado com uma caixa vermelha, as janelas de parâmetros de simulação são abertas com os parâmetros de simulação Comprimento de pulso moldado [μs] (= 2000 μs) e Ângulo de rotação [°] (= 180°). Clicar no botão Iniciar NMR-SIM abre a janela de simulação (B), que mostra a largura de banda de inversão do pulso I-BURP2. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%207.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 8 suplementar: Interface da macro calcpowlev . (A) Janela de entrada para o comprimento do pulso cujo poder deve ser calculado. (B) Janela de entrada do pulso de referência (principalmente o pulso forte de 90°). (C) A janela de resultados mostra a diferença da força do pulso em dB entre um pulso com o novo comprimento de pulso e um pulso com o comprimento do pulso de referência. Atenção: Esta diferença só é válida se ambos os comprimentos de pulso corresponderem ao mesmo pulso em relação à forma e ângulo de rotação. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%208.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 9: Processamento de espectros de RMN: Interface da ferramenta de conversão NMRPipe. Clicar em Ler Parâmetros lê automaticamente os parâmetros do experimento. O script de conversão é mostrado à direita. Todos os parâmetros podem ser definidos individualmente. Depois de alterar os parâmetros usando Limpar Script, recomenda-se atualizar oScript . Clique em Salvar script para salvar o script em fid.com, conforme mostrado à direita. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%209.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 10 suplementar: O arquivo nmrproc.com para processamento espectral. O código usado no arquivo nmrproc.com para processar os dados brutos no formato NMRPipe é mostrado. A entrada tauValues e a entrada idxExpmt devem ser definidas antes do processamento. Os tauValues correspondem às entradas vplist em ms para o experimento 15N R1ρ (entradas vclist recalculadas em ms para o experimento 15N R1 ). Em relação ao comprimento do atraso de relaxamento, as entradas idxExpmt correspondem à ordem das entradas vplist (entradas vclist para o experimento 15N R1). No script, as posições para alterar a fase do espectro são marcadas com caixas vermelhas. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2010.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 11: Exibição de espectros de RMN e pico de captação. Uma visão geral do nmrDraw com um espectro aberto é mostrada. Use + e - para alterar o Fator, que acompanha uma mudança no nível de contorno. Alterar a dimensão Z permite a alternância entre o experimento HSQC com diferentes atrasos de relaxamento. Use Desenhar para redesenhar o espectro com os parâmetros alterados. O controle deslizante P0 e o controle deslizante P1 permitem mudanças na fase do espectro. Essas alterações de fase não serão salvas nos dados processados; A mudança de fase deve ser inserida no arquivo nmrproc.com manualmente e o arquivo nmrproc.com deve ser executado novamente. A macro Peak Detection permite escolher os picos do espectro no nível de contorno definido. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2011.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 12: Atribuição de pico de RMN semiautomatizada com NMRDraw. O código do arquivo ass.com é mostrado e deve ser executado para iniciar a atribuição do sinal NMR. Altere -assName para a lista de pico de interesse gerada. Esta lista de picos deve estar no mesmo formato que a lista de picos anexada ass.syb2.hn_1200.tab na pasta peaklist (na pasta zip baixada em https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). O número vermelho refere-se à respectiva etapa do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2012.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 13: Pico de RMN visual e inspeção de atribuição. A interface da macro de atribuição é aberta executando ass.com. Use o botão esquerdo do mouse para atribuir picos e o botão direito do mouse para desatribuir picos. Use Avançar para ir para o seguinte aminoácido e Anterior para ir para o aminoácido anterior. Com + e -, o nível de contorno pode ser alterado usando Desenhar, que redesenha o espectro. Usando o fluxo de trabalho: Sair, Salvar e Sair salva a atribuição e encerra o programa. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2013.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 14 suplementar: Extraindo as constantes de taxa 15N R2 dos dados R1ρ e R1 . Passo 1. O conteúdo do arquivo t1rho.tab é mostrado. Deve ser acrescentado um código marcado com uma caixa vermelha antes de calcular as taxas R2 a partir das taxas R1ρ . O número vermelho refere-se à respectiva etapa do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2014.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 15: Extraindo as constantes de taxa 15N R2 dos dados R1ρ e R1 . Etapa 2. O conteúdo do arquivo crtR1p.tcl é mostrado. Antes de executar, as entradas na caixa vermelha devem ser alteradas conforme descrito no protocolo. Os números vermelhos referem-se às respectivas etapas do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2015.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Este protocolo descreve a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangulares (SEC-MALS) para caracterização absoluta de proteínas e complexos em solução. SEC-MALS determina o peso molecular e o tamanho de proteínas puras, oligomers nativos, heterocomplexos e proteínas modificadas como glicoproteínas.

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

O objetivo deste protocolo é usar simulações de dinâmica molecular para examinar as mudanças estruturais dinâmicas que ocorrem devido à ativação de mutações da proteína quinase EGFR.

Decifrando os efeitos estruturais da ativação de mutações somáticas do EGFR com simulação de dinâmica molecular

Este protocolo permite a preparação de seções transversais de sementes de cereal (por exemplo, arroz) para a análise da morfologia do endosperma e do grânulo de amido usando microscopia eletrônica de varredura.

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

gP2S é um aplicativo web para o rastreamento de experimentos crioEM. Suas principais características são descritas, assim como as etapas necessárias para instalar e configurar o aplicativo. Uma vez configurado, o aplicativo permite gravar com precisão metadados associados a experimentos de manchas negativas e crioEM.

gP2S, um sistema de gerenciamento de informações para experimentos CrioEM

Apresentamos um protocolo para medir a dinâmica micro a milissegundo em 13C/15N rotulado e sem rótulo RNA com 1H R1ρ  de dispersão nuclear de ressonância magnética (NMR). O foco deste protocolo está na preparação e configuração de amostras de alta pureza de experimentos de RMN.

Aspectos práticos da preparação e configuração da amostra de 1H R1ρ Experimentos de dispersão de relaxamento do RNA

Aprenda experimentos de relaxação de RMN 15N para investigar a dinâmica estrutural de proteínas intrinsecamente desordenadas em escalas de picossegundos a nanossegundos. Este protocolo permite análise específica de resíduos.

Experimentos de relaxamento de RMN ¹⁵N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

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