Name: Neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda neuromodulação por ultrassom focalizado e fotometria de fibra simultâneas em camundongos livres. Este método permite detectar neuroatividade modulada por ultrassom e estudar dinâmicas de cálcio em tempo real.

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Este trabalho é apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32371151), Instituto de Pesquisa de Inovação de Alto Nível de Guangdong (2021B0909050004), Fundo de Pesquisa Colaborativa do Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (C5053-22GF), Fundo Geral de Pesquisa (15224323 e 15104520), Fundo de Tecnologia de Inovação de Hong Kong (MHP/014/19), financiamento interno da Universidade Politécnica de Hong Kong (G-SACD e 1-CDJM), e a Fundação de Ciências Naturais da Província de Liaoning - Fundo Aberto Conjunto do Laboratório Estadual de Robótica (2022-KF-22-03). Os autores gostariam de agradecer às instalações e ao apoio técnico do Centro de Pesquisa Universitária em Ciências da Vida (ULS) e do Centro de Pesquisa Universitária em Neurociência Comportamental e de Sistemas (UBSN) da Universidade Politécnica de Hong Kong.

Todos os procedimentos e manejo dos animais cumpriram as diretrizes de ética da NSFC e os requisitos de protocolo aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Ciência e Tecnologia de Inteligência de Guangdong.
1. Preparação do transdutor
<ol><li>Prepare uma placa piezoelétrica com um diâmetro interno de 3 mm, um diâmetro externo de 7 mm e uma frequência central de 500 kHz. NOTA: O diâmetro externo pode ser ajustado com base na região específica do cérebro que está sendo alvo e deve ser maximizado, mantendo a precisão da estimulação e sem exceder o limite do crânio do camundongo.</li>
	<li>Prenda o fio nos dois lados da placa piezoelétrica usando pasta de prata epóxi (Figura 1). Depois que a pasta de prata epóxi solidificar, use um multímetro para medir a resistência em ambas as extremidades do fio para garantir que seja aproximadamente 0.</li>
	<li>Aplique uma camada de fita dupla-face em uma superfície de folha de vidro limpa. Aderir firmemente à placa piezoelétrica e ao anel de cobre, com altura de 8 mm, diâmetro externo de 8 mm e diâmetro interno de 7,6 mm, firmemente à folha de vidro. NOTA: O diâmetro interno do anel de cobre é determinado pelo tamanho da placa piezoelétrica para garantir que a placa seja coberta pelo anel de cobre.</li>
	<li>Insira firmemente o tubo de polipropileno com diâmetro externo de 3 mm no centro da placa piezoelétrica e cole-o firmemente à folha de vidro (Figura 1).</li>
	<li>Prepare uma quantidade adequada de cola de resina epóxi e aspire. Extraia o epóxi usando uma seringa descartável e injete-o lentamente no anel de cobre. Aguarde cerca de 10 h até que o epóxi solidifique (Figura 1).</li>
	<li>Solde as pontas soltas de dois fios no conector da porca de baioneta usando um ferro de solda eletrônico. Remova a folha de vidro. Limpe a superfície do transdutor com álcool (Figura 1).</li>
</ol>2. Parâmetros de relatório para FUN
<ol><li>Coloque o hidrofone e o transdutor em um tanque de água cheio de água deionizada (Figura 2A). Certifique-se de que o feixe central (eixo Z) do sistema de posicionamento esteja alinhado com o eixo do transdutor. Esse alinhamento pode ser alcançado pela primeira vez, descobrindo um campo máximo no plano focal por meio de varredura 2D; em segundo lugar, identificar um máximo de campo em outro plano com um máximo claro; em terceiro lugar, comparar as coordenadas X e Y dos dois máximos e, em seguida, ajustar iterativamente a posição e/ou orientação do transdutor, se necessário28.</li>
	<li>Ajuste a ponta do hidrofone com a superfície do transdutor a uma distância de 1 mm, mantendo essa distância constante enquanto posiciona o hidrofone no meio da borda direita do transdutor. Inicie o programa de varredura para capturar o campo acústico livre no plano XZ (Figura 2B). NOTA: O método de construção do hidrofone pode ser encontrado em https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.</li>
	<li>Mova o hidrofone ao longo do eixo Z para determinar as profundidades associadas à pressão de pico espacial. Neste experimento, a pressão de pico espacial aparece a uma distância de 3,4 mm da superfície do transdutor; mantenha essa distância ao mover o hidrofone para o canto inferior direito do transdutor no plano XY. Ligue e inicie o programa de varredura para capturar o campo acústico livre no plano XY (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque o transdutor no crânio de um camundongo que foi submetido à cirurgia conforme descrito na etapa 4. Adquira o campo acústico transcraniano no plano XZ e no plano XY (Figura 2D) por meio de varredura de hidrofone, conforme descrito em 2.1-2.3.</li>
	<li>Leia as amplitudes de pressão no ponto focal, que é a região de pico espacial no campo acústico livre e no campo acústico transcraniano. A amplitude de pressão no ponto focal no campo acústico livre é de 730k Pa e no campo acústico transcraniano é de 580k Pa. Leia as dimensões focais em -3 dB (Figura 2C, E) e a posição nos planos XY e XZ dentro do campo acústico transcraniano para avaliar se o campo acústico deste transdutor pode cobrir as áreas alvo do cérebro.</li>
	<li>Calcule o Índice Mecânico (MI), que é limitado pelo documento de orientação da FDA a estar abaixo de 1,9 para mitigar a cavitação. O cálculo do IM é dado pela equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) onde pr,.3 representa a pressão de pico raro em MPa ajustada por um coeficiente de atenuação de 0,3 dB cm-1 MHz-1, e f0 é a frequência de operação em MHz. A pressão rara de pico do campo transcraniano medida é de 580 kPa, , 3,4 mm do transdutor, o f0 é 500 kHz, então o pr reduzido O MI é 0,82.</li>
	<li>Calcule a intensidade média do pulso de pico espacial (Isppa), que deve estar abaixo de 190 W/cm2 na direção do plano de acordo com o documento de orientação da FDA. O cálculo da intensidade é dado pela equação: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) onde psp (t) é a pressão acústica variável no tempo no local do pico espacial, Z é a impedância acústica característica do meio (aproximadamente 1.5 x 106 Rayls para tecidos moles), e PD é a duração do pulso. No caso do envelope quadrado, isso se reduz à equação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) onde A é a amplitude de pressão do pico espacial. O A medido no local focalizado no ultrassom é de 580 kPa, e o Z do cérebro é de cerca de 1,58 x 106 Rayls, então o Isppa do envelope quadrado é 10,65 W / cm2 e o Isppa do envelope senoidal é 10,65 W / cm2.</li>
	<li>Calcule a intensidade média do tempo de pico espacial (Ispta), que é limitada pelo documento de orientação da FDA a estar abaixo de 430 mW / cm2 na direção do plano. O cálculo da intensidade é dado pela equação: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) onde T é o período de tempo durante o qual a média é calculada. No caso do envelope quadrado, isso se reduz à equação: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) onde otrem de pulso DC é o ciclo de trabalho do pulso. Aqui, o trem de pulso DC é de 1% porque ondas contínuas foram usadas, então o Ispta é igual à intensidade média do pulso de pico espacial, 106,5 mW / cm2 para um envelope quadrado. O IM, ISPA e Ispta podem ser calculados usando o software (Figura 3A). Um código baseado em MATLAB para fácil uso pode ser encontrado em https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.</li>
	<li>Relate os parâmetros de tempo de pulso, incluindo Amax, duração do pulso, intervalo de repetição de pulso, duração do trem de pulso e envelope (Figura 3B).</li>
</ol>3. Preparando o animal para a cirurgia
<ol><li>Pesar camundongos transgênicos GCaMP6s machos de 8 semanas de idade, com um peso aproximado de cerca de 20 g. Prepare uma solução contendo cetamina a 10 mg / mL e xilazina a 2 mg / mL em solução salina estéril. Administre a solução de cetamina/xilazina por injeção intraperitoneal na dosagem de 100 mg/kg de cetamina e 20 mg/kg de xilazina usando uma agulha 26G e 1 mL de seringa descartável. Inicie a preparação cirúrgica quando o animal não responder a estímulos dolorosos, como beliscar o dedo do pé.</li>
	<li>Use um fader para aparar o cabelo da cabeça do animal e desinfete a área com etanol 70% e iodopovidona antes do procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição de bruços na estrutura estereotáxica e certifique-se de que o crânio esteja nivelado. Coloque uma pomada oftálmica protetora sobre os olhos do animal para manter a umidade.</li>
</ol>4. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Faça uma incisão ao longo da sutura sagital, começando do osso occipital até o início do osso nasal. Use uma tesoura cirúrgica para remover a pele que cobre os dois hemisférios.</li>
	<li>Use solução salina estéril para limpar o crânio e eliminar qualquer periósteo restante.</li>
	<li>Aplique peróxido de hidrogênio a 3% no crânio exposto usando um cotonete por aproximadamente 2 s-3 s para criar microporos. Enxágue bem com soro fisiológico estéril e certifique-se de que a área esteja completamente seca.</li>
	<li>Crie uma craniotomia com orifício de rebarba de 0,6 mm de diâmetro usando uma broca esterilizada e autoclavada acima da localização da área do cérebro, conforme determinado pelo atlas estereotáxico alinhado a bregma e lambda. Lave todos os detritos com solução salina estéril e certifique-se de uma secagem completa. Tenha cuidado para não danificar nenhum tecido.</li>
	<li>Insira a ponteira de fibra óptica (implante) no suporte da sonda e conecte-a ao braço estereotáxico.</li>
	<li>Alinhe o implante diretamente acima da região de interesse usando o braço estereotáxico. Ao inserir a fibra óptica no tecido cerebral, avance a fibra lentamente a uma taxa de aproximadamente 2 mm/min.</li>
	<li>Misture o cimento dentário para obter uma viscosidade que permita uma fácil aplicação em todo o crânio. Use um palito estéril para espalhar uma fina camada de cimento dental sobre o crânio e na parte inferior do implante. Deixe secar completamente.</li>
	<li>Retire o suporte da sonda com cuidado. Prepare um tubo de polipropileno com uma altura de 3 mm, um diâmetro externo de 3 mm e um diâmetro interno de 2,6 mm e, em seguida, corte o tubo em todo o seu comprimento.</li>
	<li>Prenda o tubo na parte inferior do implante usando uma pinça. Despeje o pó de cimento dental no tubo, garantindo comprimento suficiente acima do implante para registrar o sinal da fibra óptica. Adicione o líquido necessário e aguarde alguns minutos para que o cimento dentário solidifique.</li>
	<li>Localize a abertura do tubo e prenda-o cuidadosamente para remover o tubo usando uma pinça. Prepare a mistura de cimento dental para aplicação, garantindo que uma camada uniforme e fina seja espalhada pelo crânio. Cubra o máximo possível de área de superfície no crânio com cimento dentário. Aguarde alguns minutos para que o cementário dentário solidifique. NOTA: Não deixe o cimento dental entrar em contato com a pele do mouse.</li>
	<li>Faça três furos (1 mm de diâmetro) no anel impresso em 3D, dividido uniformemente no horizonte, com uma altura de 7 mm, um diâmetro externo de 10 mm e um diâmetro interno de 8,4 mm. Prenda os parafusos (1 mm de comprimento) em seus respectivos orifícios.</li>
	<li>Insira a parte superior do implante no orifício do transdutor pré-fabricado. Certifique-se de que a parede interna do anel impresso em 3D seja lisa e, em seguida, coloque-a ao redor do transdutor posicionado no crânio do rato. Certifique-se de que o transdutor esteja centralizado dentro do anel.</li>
	<li>Aplique cimento dental na junção entre o anel e o crânio e aguarde alguns minutos para que o cimento dental solidifique. Evite colocar o cimento dental na conexão entre o transdutor e o crânio.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o transdutor e aperte bem os parafusos. Transfira o mouse para uma gaiola quente e certifique-se de que ele seja monitorado até que esteja totalmente recuperado antes de devolvê-lo à gaiola original.</li>
	<li>Após a cirurgia, administre carprofeno subcutâneo (2 mg / kg) para analgesia e continue a cada 24 h por 3 dias para controlar a inflamação e a dor. Monitore os animais diariamente em busca de sinais de angústia, perda de peso anormal, dor ou infecção. Normalmente, no3º dia após a cirurgia, todos os camundongos devem estar exibindo comportamento normal. Se algum sinal de angústia ou doença for observado em um camundongo após o3º dia, siga as diretrizes institucionais para a eutanásia.</li>
</ol>5. Estimulação e gravação de sinal
<ol><li>Aos 7 dias após a cirurgia, ligue o suprimento de oxigênio para a máquina de anestesia com gás e ajuste o regulador de fluxo de oxigênio para definir o fluxo de gás para 300-500 mL / min.</li>
	<li>Coloque o mouse na câmara de indução e feche a entrega de gás anestésico à máscara. Gire o botão do vaporizador para ajustar a concentração anestésica apropriada (2%-2,5%).</li>
	<li>Depois que o mouse estiver anestesiado, coloque-o na estrutura estereotáxica com uma máscara anestésica. Feche a linha de indução para permitir que o gás anestésico flua para a máscara anestésica. Ajuste a concentração anestésica de manutenção apropriada (1%-1,5%).</li>
	<li>Limpe a superfície superior do implante com álcool e, em seguida, insira o patch cord de fibra óptica no centro do transdutor preparado.</li>
	<li>Injete água no espaço entre o implante e o anel impresso em 3D usando uma agulha 26G e uma seringa descartável de 1 mL para umedecer o crânio. Use toalhas de papel para absorver o excesso de água.</li>
	<li>Injete um agente de acoplamento no espaço entre o implante e o anel impresso em 3D usando uma agulha 26G e uma seringa descartável de 1 mL para facilitar a fácil propagação do ultrassom do transdutor para o cérebro.</li>
	<li>Conecte o implante ao patch cord de fibra óptica. Insira cuidadosamente o transdutor na área que está preenchida com um agente de acoplamento e aperte bem os parafusos.</li>
	<li>Coloque o mouse em um campo aberto e deixe-o acordar. Conecte o transdutor ao sistema de excitação ultrassônica e conecte o patch cord de fibra óptica ao sistema de gravação de fibra óptica, permitindo liberdade de movimento para o mouse. NOTA: O patch cord de fibra óptica tem um comprimento de 2m e um diâmetro de 1,25 mm. A intensidade da luz para o canal 405 é de 20 μW e para o canal 470 é de 40 μW.</li>
	<li>Ative o dispositivo de excitação ultrassônica e o sistema de gravação de fibra óptica para sincronizar a modulação neural ultrassônica com a gravação de sinal de fibra óptica.</li>
</ol>

Protocolo integrado para FUN e fotometria de fibra em camundongos de movimento livre

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
<li>Niu, X., Yu, K., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+induces+sustained+synaptic+plasticity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus.</a> Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+torpor-like+hypothermic+and+hypometabolic+state+in+rodents+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metabol%22%5BJournal%5D)">Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound.</a> Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote%2C+brain+region-specific+control+of+choice+behavior+with+ultrasonic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves.</a> Sci Adv. 6 (21), 4193(2020).</li>
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<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Essa abordagem combina FUN com registro de fotometria óptica, permitindo a investigação da função cerebral do camundongo e do mecanismo FUN in vivo . O processo operacional completo, desde a fabricação do transdutor até os procedimentos cirúrgicos, é descrito, permitindo que os pesquisadores realizem o FUN de forma independente de fora do campo.
Um aspecto crucial do protocolo é garantir que o implante óptico seja inserido suavemente no transdutor, o cimento dentário no crânio seja fino o suficiente para a penetração do ultrassom no cérebro, o implante óptico esteja firmemente conectado ao crânio para evitar o deslocamento durante o experimento e a saída de energia do transdutor é suficiente para uma neuromodulação eficaz. A espessura do cimento dentário ao redor do implante deve ser igual ou menor que o diâmetro do orifício do transdutor. Portanto, é aconselhável usar o mesmo tubo de polipropileno tanto para o processo de fabricação do transdutor quanto para a cirurgia. Como o tubo de polipropileno não adere ao cimento dentário, ele é selecionado para moldar o cimento dentário ao redor do implante, com um corte lateral, para facilitar a remoção do tubo de polipropileno.
O registro eletrofisiológico e o registro de fotometria óptica são tecnologias comumente utilizadas para monitorar a atividade cerebral in vivo, oferecendo alta resolução temporal-espacial. No entanto, o registro eletrofisiológico captura o sinal de atividade de disparo dos neurônios ligados diretamente aos eletrodos. As ondas de ultrassom podem vibrar diretamente os eletrodos, induzindo efeitos de confusão desnecessários. Felizmente, a tecnologia de fotometria de fibra, que é menos invasiva, captura a atividade dos neurônios abaixo dela, o que poderia reduzir o efeito de confusão da vibração do ultrassom noimplante 7,19,26. Como resultado, a tecnologia de neuromodulação simultânea por ultrassom focalizado e registro de fotometria de fibra em camundongos em movimento livre permite o estudo de mecanismos in vivo de neuromodulação ultrassônica e permite a observação das respostas comportamentais dos camundongos sem a interferência da anestesia.
No entanto, a resolução espacial da fotometria de fibras é restrita, pois é incapaz de monitorar a atividade de subcelulares e microcircuitos24. Além disso, fornece uma representação indireta da atividade neuronal, uma vez que não registra diretamente os sinais elétricos produzidos pela atividade neuronal.

A neuromodulação por ultrassom focalizado (FUN) surgiu como uma ferramenta de neuromodulação promissora e versátil, permitindo a exploração da função e organização cerebral com grande potencial1. O FUN é capaz de fornecer energia acústica de forma não invasiva a qualquer posição dentro do tecido cerebral com precisãomilimétrica 2. Sua capacidade de modular transitório e reversivelmente a neuroatividade em estruturas cerebrais profundas, com alta especificidade espaço-temporal, de forma segura e não invasiva, apresenta um atributo atraente que complementa a técnica de neuromodulação clínica existente3. A demonstração de FUN eficaz foi confirmada em seres humanos 4,5,6 e em vários modelos animais, abrangendo espécies pequenas 7,8,9,10 e grandes 11,12,13,14,15,16,17.
Ao observar o efeito do FUN em tipos neurais específicos por meio do monitoramento da neuroatividade durante o FUN, podemos nos aprofundar no mecanismo por trás desse processo18,19. A fotometria de fibra baseada em indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) tornou-se amplamente utilizada na última década como um método versátil para rastrear a atividade populacional específica do tipo de célula in vivo20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Portanto, a aplicação simultânea de FUN e fotometria de fibra pode enriquecer significativamente nossa compreensão abrangente de FUN. No entanto, o uso de transdutores individuais volumosos requer fixação em um quadro, enquanto os animais precisam ser submetidos à anestesia e imobilizados em um quadro estereotáxico 7,19,25,26. Essa abordagem pode não ser adequada para certos tipos de experimentos relacionados à percepção, cognição e avaliação do comportamento. É crucial estabelecer um protocolo que facilite a fusão de FUN e fotometria de fibra sem impedir a mobilização dos camundongos7.
Neste estudo, apresentamos um protocolo refinado usado em nossos estudos anteriores para complementar de forma perfeita e graciosa o método de confecção de um único transdutor e sua fixação temporária nos camundongos, bem como a fixação segura de um implante de fibra óptica para facilitar a passagem suave do transdutor 7,19,26. Ele permite que os pesquisadores registrem a neuroatividade modulada pelo ultrassom em camundongos desenfreados. Optou-se por um envelope mais liso, como o envelope sinusoidal, para reduzir o confundimento auditivo27. A viabilidade deste protocolo é confirmada através do registro simultâneo da neuroatividade no núcleo talâmico anterior de camundongos em movimento livre durante a FUN. Ele demonstra que a energia do transdutor é suficiente para atingir a neuromodulação, e os métodos de fixação para o implante de fibra óptica e o transdutor podem garantir sua estabilidade.

<table><tbody><tr><td>Seringa descartável de 1ml</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>Agulhas de injeção</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 26</td><td>Jin mao</td><td>JM-J02</td><td>Agulhas de preparação</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Dong de álcool&nbsp;</td><td>0.7</td><td>Desinfetar</td></tr><tr><td>álcool</td><td>Dong de álcool&nbsp;</td><td>0,75</td><td>Limpe a superfície do transdutor</td></tr><tr><td>Conector da porca de baioneta</td><td>Risym</td><td>75-5</td><td>A outra extremidade do fio de conexão é conectada ao anel de cobre do dispositivo de excitação ultrassônica</td></tr><tr><td></td><td>Guowei Metal Materials</td><td>Diâmetro externo, espessura da parede, altura (8 mm, 0,2 mm, 8 mm)</td> <td>A caixa protetora externa da seringa descartável do transdutor</td></tr><tr><td></td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>A inalação de resina epóxi permite que pequenas quantidades precisas sejam injetadas no tubo de cobre</td></tr><tr><td>fita dupla face</td><td>3M</td><td>3M55236</td><td>É usado para fixar o transdutor e o fio para garantir que a cola epóxi prata não se mova antes de secar</td></tr> o <tr><td>ferro de solda eletrônico</td><td>Victor</td><td>868A+</td><td>Os fios soldados são conectados à</td></tr><tr><td>cola de resina epóxi</td> BNC <td>Kraft</td><td>K 9741</td><td>Selar a parte traseira do transdutor</td></tr><tr><td>epoxy silver paste</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td><td>O fio é anexado aos pólos positivo e negativo da folha de cerâmica piezoelétrica e a resistência é mantida baixa</td></tr><tr><td>fader&nbsp;</td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td><td>Remova o cabelo da cabeça da máquina de</td></tr><tr><td>anestesia a gás</td> de camundongo <td>RWD</td><td>R500</td><td>É usado para anestesia em</td></tr><tr><td>camundongos folha de vidro</td><td>Vidro quadrado</td><td>80mm*80mm</td><td>Uma superfície de operação temporária para colocar cerâmicas e fios piezoelétricos pode ser usada para revestir a superfície da placa de vidro com fita dupla face</td></tr><tr><td>cetamina/xilazina&nbsp;</td><td>Shutai/shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>Anestesia o</td></tr><tr><td>agente de acoplamento médico</td> do mouse <td>Bestman</td><td>120g</td><td>O acoplante atua como um meio para conduzir o sinal de ultrassom</td></tr><tr><td>do mouse</td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td> para cobaia <td>Yun Zhi</td><td>0,5% x 2,5 g x1</td><td>Umedece a área dos olhos para prevenir a cegueira</td></tr><tr><td>&nbsp; placa piezoelétrica</td><td>Jiaming Electronics Factory</td><td>Diâmetro, poro, espessura (7 mm, 3 mm, 3,56 mm)</td><td>A energia elétrica é emitida na forma de tubo de polipropileno ultrassônico</td></tr><tr><td></td><td>Baihao Pipe Factory</td><td>Diâmetro externo, diâmetro interno, comprimento (3 mm, 2 mm, 500 mm)</td><td>Evite que a resina epóxi tampe os orifícios e deixe os orifícios</td></tr><tr>de<td>iodo-povidona</td><td>lefeke</td><td>500ml</td><td>Desinfetar</td></tr><tr><td>registro de sinal de fibra</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>Sistema de gravação de fibra óptica de canal único de três cores</td><td>Registro de sinais de fotometria de fibra</td></tr><tr><td>quadro estereotáxico</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>Fixe a cabeça do mouse e localize a região do cérebro</td></tr><tr><td>solução salina estéril</td><td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML,4.5g</td><td>Como solvente, dissolve a estimulação</td></tr><tr><td>de drogas do ultrassom&nbsp;</td><td>Deep Brain Technology</td><td>DB-USNM</td><td>Fornece entrada estável para a</td></tr><tr><td>máquina de pesagem</td> do transdutor <td>Qin bo shi</td><td>1718</td><td>Pese o fio do mouse</td></tr><tr><td></td><td>Jinpeng Cable Factory</td><td>0,3 mm 2 </td><td>Voltage é fornecido ao transdutor</td></tr></tbody></table>

neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

A neuromodulação por ultrassom focalizado (FUN) representa uma abordagem promissora para a perturbação não invasiva de circuitos neuronais em regiões cerebrais profundas. É compatível com a maioria das modalidades existentes para monitorar as funções cerebrais in vivo. A integração com modalidades de registro de funções cerebrais não apenas nos permite abordar ordens e distúrbios de funções cerebrais específicas com feedback de circuito fechado, mas também nos fornece insights mecanicistas sobre o próprio FUN. Aqui, fornecemos um protocolo modificado, simples, confiável e robusto para a aplicação simultânea de FUN e fotometria de fibra GCaMP6s registro de fluorescência em camundongos em movimento livre. Isso envolve a fabricação de um único transdutor de bom tamanho e sua colocação temporária nos camundongos, juntamente com a fixação segura de um implante de fibra óptica para facilitar a passagem suave do transdutor. A combinação de FUN e fotometria de fibra fornece o registro óptico de respostas de circuitos neurais sobre FUN em tempo real em regiões cerebrais profundas. Para demonstrar a eficiência deste protocolo, camundongos Thy1-GCaMP6s foram usados como exemplo para registrar a neuroatividade no núcleo talâmico anterior durante o FUN enquanto os camundongos estão se movendo livremente. Acreditamos que este protocolo pode promover o uso generalizado do FUN tanto no campo da neurociência quanto no campo do ultrassom biomédico.

A distribuição da pressão acústica no campo acústico livre no plano XY e no plano XZ localizados a 3,4 mm de distância da superfície do transdutor, correspondendo à posição do núcleo talâmico anterior do camundongo, é mostrada na Figura 2B, C. Essas medidas foram adquiridas por meio de varredura de hidrofone no domínio XY e no domínio XZ. A distribuição da pressão acústica no campo acústico transcraniano no plano XY e no plano XZ localizados a 3,4 mm de distância da superfície do transdutor é mostrada na Figura 2D,E. A pressão acústica livre medida é de 730 kPa e a pressão acústica transcraniana medida é de 580 kPa para a frequência central de 500 kHz. A espessura do crânio medida é de cerca de 0,2 mm, em média. Assumimos que a relação de dispersão é aproximadamente linear, então o crânio tem um coeficiente de atenuação de 19,98 dB / cmMHz. O transdutor leve, pesando cerca de 1,66 g, permite que o mouse se mova facilmente, facilitando a observação do comportamento de resposta do mouse sob FUN e a trilha de movimento.
Os sinais da fibra óptica foram registrados sob FUN (Figura 4B,D), sendo o envelope quadrado e senoidal, respectivamente. Cinco camundongos machos foram utilizados no experimento. O quadrado durou 300 ms, enquanto o sinusoidal contínuo durou 471 ms, o que pode garantir que a energia total seja a mesma em dois FUNs diferentes (Figura 4A, C). Um aumento no sinal da fibra óptica indica um aumento na atividade neural. A resposta neural é rápida sob o FUN, sugerindo que o transdutor tem energia suficiente e excelentes capacidades de foco.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> Figura 1: Processo de produção do transdutor. Isso envolve, por sua vez, conectar uma folha piezoelétrica a um fio e, em seguida, embalá-la. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> Figura 2: Configuração e caracterização da medição de campo de ultrassom para transdutor ultrassônico. (A) A configuração para medição de campo de ultrassom inclui um hidrofone, sistema de motor, software de controle, gerador de sinal e osciloscópio. (B, D) Diagrama esquemático de medições de transdutores ultrassônicos em campos acústicos livres e transcranianos e os resultados de medições de campo sonoro transversal e longitudinal. (C, E) Diagrama do campo sonoro transversal na posição focal do transdutor, com a linha vermelha indicando o campo sonoro na posição de -3 dB. (F, G) Diagrama de forma de onda da saída medida pelo hidrofone para o transdutor. A área dentro da caixa tracejada vermelha e a área dentro da caixa tracejada azul representam os períodos antes que a forma de onda atinja uma amplitude estável e o período de toque do transdutor no final, respectivamente. A área dentro da caixa tracejada laranja representa a parte estável da forma de onda, que é usada para calcular a amplitude de pressão, anotada como p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> Figura 3: Software de cálculo e parâmetro de ultrassom. (A) Uma interface caseira de cálculo de parâmetros de ultrassom. MI, Isppa e Ispta foram calculados. A interface pode ser obtida a partir de https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) Esquemas de formas de onda de pressão de ultrassom. Um envelope de pulso senoidal e um envelope de pulso retangular são usados. O período (T) representa a duração de um único ciclo da frequência de operação. Um pulso, conhecido como sonicação contínua única, dura uma duração especificada chamada duração do pulso (PD). Normalmente, os pulsos são repetidos em uma sequência conhecida como trem de pulso. O intervalo de tempo entre dois pulsos consecutivos em um trem de pulso é chamado de intervalo de repetição de pulso (PRI), calculado como o recíproco da frequência de repetição de pulso (PRF). Toda a sequência de pulsos, conhecida como trem de pulso, tem uma duração específica conhecida como duração do trem de pulso. O intervalo de tempo significa a duração de uma única tentativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> Figura 4: Sinal de fotometria de fibra durante o FUN. (A, C) Parâmetros ultrassonográficos envoltos por quadrado (B) e senoidal (D). (B, D) O sinal de fotometria de fibra, respectivamente, durante o FUN de (A) e (C). A sombra verde é a duração de FUN. A linha sólida é a média, e os tons de azul e vermelho são a média e o desvio padrão dos sinais registrados. Cinco camundongos machos foram utilizados no experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo inclui fabricação de transdutores, relatórios de parâmetros, procedimento cirúrgico e gravação de sinal para todo o fluxo de trabalho operacional de neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em camundongos em movimento livre.

Neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para registrar a atividade neural em um mouse que se move livremente usando fotometria de fibra. Nesse método, os neurônios em uma região específica do cérebro expressam um indicador de cálcio geneticamente codificado. Um estímulo é aplicado a essa região do cérebro e a mudança dependente do estímulo na fluorescência é medida para identificar a atividade neural.

Registrando a atividade neural em camundongos que se movem livremente usando fotometria de fibra

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Este protocolo detalha como aplicar e executar gravações da fotometria da multi-fibra, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e considerações importantes para a imagem latente da fotometria da duplo-cor.

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Este protocolo descreve a quantificação de variações hemodinâmicas cerebrais volumosas no cérebro do camundongo usando ultrassom funcional (fUS). Procedimentos para mapa de ativação funcional 3D após estimulação sensorial, bem como conectividade funcional de estado de repouso são fornecidos como exemplos ilustrativos, em camundongos anestesiados e acordados.

Ativação 3D do cérebro inteiro e mapeamento de conectividade funcional em camundongos usando imagens de ultrassom funcional transcranário

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

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Usando uma abordagem totalmente óptica, o AVC isquêmico é induzido enquanto registra simultaneamente a atividade neuronal de Ca2+ usando um biossensor fluorescente no núcleo emergente do AVC de um camundongo acordado e comportado.

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Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.

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Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

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Aprenda neuromodulação por ultrassom focalizado e fotometria de fibra simultâneas em camundongos livres. Este método permite detectar neuroatividade modulada por ultrassom e estudar dinâmicas de cálcio em tempo real.

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