Name: Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a isolar mitocôndrias de alta qualidade a partir de tecido cardíaco de roedores usando respirometria de alta resolução. Este método permite avaliar funções bioenergéticas e investigar mecanismos de doenças mitocondriais.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento mitocondrial de roedores para estudos bioenergéticos de alta qualidade

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL Copo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de vidro de 10 mL</td><td>Para dissecação e picagem de órgãos</td></tr><tr>Tubos <td></td><td></td> de<td>centrífuga de 50 mL</td><td>Centrifugação</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-difosfato monopotássio sal dihidratado</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>Ensaios de Respirometria</td></tr><tr><td>BSA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scentific</td><td>PI23225</td><td>Quantificação de proteínas mitocondriais</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>Para tampão (CB)</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E4378</td><td>Para tampões (CB e IB) e ensaios de respirometria</td></tr><tr><td>Cânula de vidro</td><td>Radnoti</td><td></td><td>perfusão cardíaca de porquinhos da Índia e ratos</td></tr><tr><td>Heparina sódio mucosa suína</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU</td><td>Injeção IP animal</td></tr><tr><td>Respirômetro de alta resolução Eletrodo</td><td></td><td></td><td>tipo Clark; oxígrafo com câmaras de 2 mL</td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td><td></td>de indução</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>792632</td><td>Anestésico&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido L-málico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>Ensaios de respirometria</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M9272</td><td>Para tampão (RB)</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>Para seringas</td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>microlitros</td> tampão (IB) <td>Tamanhos variando de 5&ndash; 50 &micro; L</td></tr><tr>Leitor <td></td><td></td><td>de microplacas</td><td>Deve ser capaz de incubar a 37 > C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>475898</td><td>Para todos os buffers</td></tr><tr><td>O2 tanque</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador OMNI THQ OMNI</td><td>International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>Homogeneizadores de estator de rotor semelhantes funcionarão</td></tr><tr><td>pipetas</td><td></td><td></td><td>Volumes de&nbsp; 2&ndash; 20 &micro; L; 20&ndash; 200 &micro; L; 200&ndash; 1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Para tampões (RB e CB)</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496</td><td>Para tampões (IB e RB)</td></tr> <tr><td>Protease de Bacillus licheniformis</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9888</td><td>Para tampão (CB)</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP356-100</td><td>Ensaios de respirometria</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>Para tampão (IB)</td></tr> <tr>Kit <td></td><td></td><td>de dissecção cirúrgica</td><td>Depende da fonte animal e do tecido</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> de mesa <td>Deve esfriar a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Após a conclusão do isolamento mitocondrial, a qualidade e a funcionalidade dos isolados devem ser testadas através da quantificação das taxas de consumo de oxigénio (JO2) utilizando respirometria de alta resolução. Para isso, os estoques mitocondriais foram diluídos a 40 mg/mL para permitir concentrações de trabalho de 0,1 mg/mL em 2 mL de RB para todos os ensaios de respirometria usando mitocôndrias cardíacas isoladas. A respiração foi alimentada por piruvato de sódio 5 mM e L-malato 1 mM na presença de EGTA 1 mM, um quelante de cálcio, e foi deixada em equilíbrio por 5 min para estabelecer a respiração do Estado 2. Durante esse estado, as taxas de consumo de oxigênio devem ser em média 45-55 pmol/mL/s ou 27-33 nmol/mg/min. Esteja ciente da taxa de consumo de oxigênio dependente do eletrodo e execute as correções de fundo apropriadas quando necessário. A fosforilação oxidativa (Estado 3) é iniciada na marca de 5 minutos por um bolus de 500 μM de ADP. As adições de substrato e o rastreamento representativo são detalhados na Figura 1. As mitocôndrias funcionais terão um aumento imediato de JO2 após a adição de ADP, que varia de acordo com a fonte tecidual, conforme mostrado na Figura 2. Sem o uso de EGTA, o cálcio residual tem efeitos variáveis nas taxas máximas de JO2 durante o OXPHOS, dependendo da concentração mitocondrial, disponibilidade de substrato e outros fatores ambientais. A composição do tampão é importante para a preservação da integridade e funcionalidade da membrana mitocondrial. Todas as receitas tampão mencionadas ao longo do protocolo são detalhadas na Tabela 1 e podem ser utilizadas para todas as preparações mitocondriais aqui descritas.
O isolamento bem-sucedido das mitocôndrias é denotado pela obtenção de valores de RCR que estão dentro do intervalo determinado para cada espécie e fonte de tecido, conforme mostrado na Tabela 2. Com base nos dados coletados usando este protocolo, se isolar mitocôndrias cardíacas de cobaias, ratos ou camundongos, os RCRs devem ser ≥16, ≥8 e ≥5, respectivamente. Se estiver isolado do fígado ou rim de rato, os RCRs devem ser ≥6, enquanto os RCRs das células são considerados aceitáveis se estiverem acima de 3,8. Se os valores de RCR caírem abaixo dessas faixas ou se houver diferenças qualitativas nos traçados da respirometria, recomenda-se que um ensaio adicional com novo RB e substratos seja realizado para descartar problemas de contaminação. Embora a transformação 1-1/RCR limite valores entre 0 e 1, essa métrica não é recomendada ao comparar a qualidade mitocondrial entre sexos ou espécies quando o valor de RCR é maior que 10. Por esse motivo, os valores padrão de RCR (Estado 3/Estado 2 ou OXPHOS/LEAK) foram quantificados durante toda a experimentação. As informações sobre as modulações que podem ser feitas neste protocolo para isolar melhor as mitocôndrias de corações, fígado, rins e células de camundongos estão detalhadas na Tabela 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> Figura 1: Regiões de interesse para verificações de controle de qualidade usando respirometria de alta resolução. As câmaras respiratórias foram carregadas com 2 mL de RB e deixadas em equilíbrio a 37 °C até que a taxa de consumo de oxigênio estivesse próxima de 0. Uma vez equilibrado, 1 mM de EGTA, um quelante de cálcio, foi adicionado junto com 5 mM de piruvato de sódio e 1 mM de L-malato. Após a adição desses substratos, as mitocôndrias foram adicionadas na concentração de trabalho desejada (0,1 mg / mL) e deixadas respirar por 5 min para atingir a respiração do Estado 2 (amarelo). Na marca de 5 minutos, 500 μM de ADP foi adicionado para iniciar a respiração do Estado 3 (vermelho). Os RCRs foram determinados pela média do tempo das taxas de consumo de oxigênio indicadas pelas caixas vermelha e amarela para comparar o Estado 3 com o Estado 2. O estado 4 é indicado pela caixa verde e representa o período de hidrolisação extramitocondrial da ATPase do ATP e pode ser usado para avaliar a integridade da membrana externa em ensaios do citocromo C. Os dados exibidos foram coletados usando mitocôndrias cardíacas de ratos SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> Figura 2: Traçados representativos de JO2 e taxas de controle respiratório em fontes animais e de tecidos. A qualidade das mitocôndrias isoladas foi testada quantificando as taxas de consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução. A respiração foi alimentada por piruvato de sódio 5 mM e L-malato 1 mM na presença de EGTA 1 mM. As mitocôndrias e substratos foram deixados respirar por 5 min para que a respiração do Estado 2 se estabilizasse. As taxas máximas de consumo de oxigênio após a adição de ADP foram comparadas com as taxas de consumo de oxigênio do Estado 2 antes do ADP para calcular as taxas de controle respiratório (RCRs) para cada tecido. A qualidade mitocondrial foi avaliada ainda mais pelo cálculo dos valores de 1-1 / RCR conforme caracterizado pelos padrões de eficiência de controle PL. Os gráficos de barras à direita de cada traçado denotam RCR médio masculino (azul) e feminino (verde) e os valores de RCR 1-1 / RCR ± DP para um determinado tecido. (A), (B) e (C) referem-se a dados coletados usando cobaias, ratos Sprague Dawley (SD) e corações de camundongos com vírus da leucemia amiga B (FVB), respectivamente. (D) e (E) detalham os resultados do fígado e rim de ratos SD, enquanto (F) se refere a células HEK293. Os três lobos maiores do fígado foram coletados, enquanto ambos os rins foram usados para isolamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Receitas de buffer. O tampão de cardioplegia (CB), o tampão de isolamento (IB) e o tampão respiratório (RB) usados durante todo o processo de isolamento devem ser preparados com antecedência de acordo com as instruções listadas. O CB pode ser armazenado por até um mês a 4 °C, enquanto o IB e o RB podem ser mantidos por 4 meses a -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Análise da razão de controle respiratório. O isolamento mitocondrial para análises funcionais foi realizado em uma ampla gama de espécies e fontes de tecido em roedores machos e fêmeas, bem como em células HEK293. O tamanho da amostra de cada sexo, fonte de tecido e espécie é detalhado junto com os valores médios de RCR e 1-1 / RCR ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Modulações recomendadas para o protocolo de isolamento mitocondrial para diferentes tecidos para aumentar o rendimento de proteínas. As alterações nas quantidades de protease e centrifugações são exibidas de acordo com a fonte do tecido. As quantidades médias de proteína total (mg) foram calculadas a partir dos resultados do ensaio de proteína BSA e do volume de ressuspensão do pellet mitocondrial final. Os valores são relatados como a média ± DP. As instruções em negrito incluídas na coluna de centrifugação informam se o sobrenadante deve ser descartado, retido ou agrupado. O descarte refere-se ao descarte do sobrenadante em um recipiente de resíduos biológicos, enquanto a retenção e o agrupamento referem-se à transferência do sobrenadante para o tubo de centrifugação seguinte ou à coleta para a centrifugação final, respectivamente. Mais detalhes sobre alterações no protocolo podem ser encontrados na seção de discussão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.

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Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

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Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

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Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

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Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Aprenda a isolar mitocôndrias de alta qualidade a partir de tecido cardíaco de roedores usando respirometria de alta resolução. Este método permite avaliar funções bioenergéticas e investigar mecanismos de doenças mitocondriais.

Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores

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