Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Nossa pesquisa visa medir duas propriedades biofísicas críticas do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, que podem ser obtidas diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais em uma interface ar-líquido. Identificamos diferentes características de diferentes vírus respiratórios usando epitélio pseudoestratificado das vias aéreas. Por exemplo, inflamação do citoesqueleto causada pelo vírus sincicial respiratório, que é um mecanismo não canônico da bronquiolite.

Também identificamos que a hiperplasia de células caliciformes aumenta a replicação do SARS-CoV-2 no epitélio das vias aéreas da doença pulmonar obstrutiva crônica. Nós nos concentramos em elucidar o mecanismo de modulação da sinalização do citoesqueleto induzida por vírus sincicial respiratório para identificar novos alvos terapêuticos para combater a infecção por VSR e a bronquiolite induzida por vírus. Para começar, tome suspensão normal de células epiteliais brônquicas humanas, ou NHBE.

Com uma pipeta P200, adicione 50.000 células ressuspensas em 200 microlitros de célula epitelial completa das vias aéreas, ou AEC, média ao lado apical da inserção. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono umidificado de 85% a 95%. Assim que as células estiverem confluentes, transfira as inserções para um poço vazio usando uma pinça estéril.

Usando uma pipeta P1000, aspire todo o meio AEC basal. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de diferenciação ALI completo fresco suplementado com 2% de penicilina-estreptomicina e 1% de anfotericina B ao poço basal. Usando uma pinça estéril, transfira as inserções para o poço basal com o meio ALI completo adicionado.

Com uma pipeta P200, aspire suavemente o meio AEC apical do poço e incuba-o. Após 48 horas, transfira as inserções para um poço vazio com pinça estéril. Usando uma pipeta P1000, aspire o meio antigo e adicione 500 microlitros de meio ALI completo fresco.

Coloque as inserções de volta no poço com meio fresco usando uma pinça estéril. No dia 26, usando uma pipeta P200, adicione 100 microlitros de DPBS ao lado apical das inserções. Incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de células umidificada por 30 minutos.

Em seguida, aspire o DPBS usando uma pipeta P200. Para começar, ligue o microscópio, o computador conectado e a câmara do ambiente. Abra a porta da câmara e coloque a placa contendo os insertos com células NBHE no microscópio stage.

Assim que a placa estiver no palco, feche a câmara. Em seguida, use o botão de operação da platina do microscópio para mover a placa e trazer as inserções à vista. Na tela do computador, clique no ícone do sistema SAVA para abrir o programa SAVA.

Na interface do software, clique em Configurar experimento. Na próxima guia, clique em Criar experimento. Em seguida, na nova guia, insira o diretório em que os dados serão armazenados no campo Inserir nome do diretório do experimento e forneça detalhes no campo Inserir descrição do experimento e clique em OK. Agora, clique no experimento que foi criado e é mostrado no diretório na seção Experimentos.

Depois, clique em Modificar e forneça detalhes da amostra no campo Descrição da amostra. Clique em Adicionar e, em seguida, clique em Sair para sair da guia. Na interface principal do software, selecione o experimento criado no menu suspenso no slot Experimento.

Em seguida, clique em Gravar vídeo para monitorar a frequência do batimento ciliar na tela do computador. A tela mostrará o movimento ciliar focado. Para cada inserção, grave seis campos aleatórios diferentes por 2,1 segundos a 120 quadros por segundo.

Clique em Salvar vídeo para monitorar os dados de frequência de batimentos ciliares. Para analisar os dados, clique em Analisar vídeo na interface do software. E na próxima guia, clique em OK. Em seguida, vá para a guia a seguir e clique em Analisar tudo.

Baixe a planilha gerada para cada experimento na pasta SAVA Data Acquisition do computador. Considere a frequência média gaussiana para apresentação de dados. A frequência de batimentos ciliares atingiu pelo menos três hertz tanto para o epitélio das vias aéreas de adultos saudáveis quanto para aqueles com DPOC, mostrando função ciliar comparável.

Para começar, ligue o ohmímetro de 2 volts EVOM2 usando o botão liga/desliga. Conecte o resistor de teste ao EVOM2 no slot de entrada. Monitore a leitura na tela do EVOM2.

Se a leitura estiver acima ou abaixo de 1.000, gire a chave ADJ no EVOM2 usando uma pinça até que mostre uma leitura uniforme de 1.000 para calibrar o dispositivo. Agora, pegue um encarte vazio para a leitura de controle experimental. Usando uma pipeta P200, adicione 100 microlitros de DPBS ao lado apical do inserto vazio.

Em seguida, adicione 500 microlitros de DPBS ao lado basal com uma pipeta P1000. Em seguida, desconecte o resistor de teste e conecte o eletrodo STX2 ao slot de entrada no EVOM2. Em seguida, limpe suavemente o eletrodo STX2 com etanol 70%.

Insira o eletrodo STX2 no inserto vazio com DPBS, mantendo a perna do eletrodo mais curta na parte apical e a perna mais longa do eletrodo na parte basal. Agora, grave a leitura estável na tela do EVOM2. Em seguida, usando uma pipeta P200, adicione 100 microlitros de DPBS ao lado apical do inserto.

Insira o eletrodo STX2 no inserto com o epitélio diferenciado das vias aéreas de 26 dias, conforme mostrado anteriormente. Em seguida, registre a leitura estável na tela do EVOM2. Os valores de resistência elétrica transepitelial aumentaram em adultos com DPOC, indicando maior impermeabilidade da membrana na DPOC.