Name: Detecção de quebras de DNA em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprenda a detectar quebras de DNA em células humanas em divisão usando ensaio de cometa neutro. Este método avalia danos durante a replicação e o papel de SNF2L na síntese de DNA.

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Agradecemos aos membros do laboratório Dungrawala por suas contribuições e comentários. Este trabalho foi financiado por R35GM137800 de bolsas do NIH para HD.

Este protocolo (Figura 1) utiliza principalmente linhagens de células cancerígenas U2OS aderentes, mas é adaptável a uma ampla variedade de células aderentes e em suspensão cultivadas em cultura de tecidos. As soluções e tampões usados neste estudo estão detalhados na Tabela 1. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais
<ol><li>Antes do dia do experimento, coloque a garrafa fornecida com agarose de baixo ponto de fusão (1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS) em banho-maria por 5 a 10 minutos para garantir que a agarose derreta completamente. NOTA: Não aqueça a garrafa no micro-ondas.</li>
	<li>Uma vez derretido, alíquota rápida de 100 μL da agarose para tubos de centrífuga de 1,5 mL conforme necessário e armazene os tubos a 4 °C. A agarose solidificada pode ser armazenada a 4 °C por até 1 ano.</li>
	<li>No dia da experiência, retirar o número necessário de tubos de centrifugação da memória a 4 °C. Derreta a agarose colocando os tubos em um bloco de calor ou banho-maria a 42 °C. NOTA: Coloque os tubos a 42 °C antes de colher as células para garantir que a agarose esteja completamente derretida para ressuspensão (etapa 3.7).</li>
	<li>Preparar um novo tampão de lise e tampão TAE no dia da experiência e armazená-los à temperatura ambiente e a 4 °C, respectivamente, até estarem prontos a utilizar. Além disso, alíquota 1x PBS em tubo cônico de 15 mL e coloque-o na geladeira para usar na etapa de ressuspensão (passo 3.5).</li>
	<li>Marque as identificações de amostra na extremidade fosca das lâminas de cometa de 2 poços e armazene-as em temperatura ambiente até que estejam prontas para uso.</li>
</ol>2. Preparação das amostras
<ol><li>Antes do dia do experimento, semeie as células em um prato de 6 poços e cultive durante a noite a 37 ° C com 5% de CO2. Para células U2OS, aproximadamente 2-3 x 105 células foram semeadas para cada amostra. NOTA: Os números das células podem precisar ser ajustados dependendo do tipo de célula usada para análises.</li>
	<li>No dia do experimento, trate as células com as condições de acordo com o projeto experimental. Como controle positivo para demonstrar a indução de quebra dependente da replicação, trate as células com 1 μM de CPT por 1 h. O CPT é um inibidor da topoisomerase-1 que induz quebras de fita dupla de maneira dependente da replicação14.</li>
</ol>3. Ressuspensão e lise celular
<ol><li>Aspire o meio de cultura celular e enxágue duas vezes com 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 300 μL de tripsina a cada poço. Incube o prato em uma incubadora de cultura de tecidos por 2-3 min. NOTA: A incubação prolongada em tripsina pode gerar resultados espúrios durante as análises de cometas.</li>
	<li>Adicione 700 μL de meio de cultura celular a cada poço. Ressuspenda suavemente e transfira as amostras para tubos de centrífuga de 1,5 mL. NOTA: A contagem de células nesta etapa é recomendada para obter a densidade celular apropriada na etapa 3.6 para reduzir a frequência de caudas sobrepostas durante a análise.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão da célula a 2400 x g por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o meio e ressuspenda as células em 1 mL de PBS 1x frio.</li>
	<li>Repita a etapa 3.4 e a etapa 3.5 duas vezes e ressuspenda as células em PBS frio 1x a uma densidade celular de 2 x 105 células por ml. NOTA: Recomenda-se avaliar a viabilidade celular nesta etapa para garantir que um número adequado de células viáveis esteja presente. Recomenda-se pelo menos 90% de viabilidade.</li>
	<li>Ressuspender 10 μl da suspensão celular em alíquota de 100 μl de agarose derretida e, utilizando a mesma ponta de pipeta, misturar suavemente e espalhar a mistura uniformemente num dos alvéolos da lâmina. Repita esta etapa para todas as amostras, conforme necessário. NOTA: Evite remover todas as alíquotas do banho-maria a 42 °C de uma só vez para evitar que a agarose solidifique. Esta etapa deve ser realizada preferencialmente em banho-maria, e cada amostra é ressuspensa e espalhada de forma escalonada. Evite introduzir bolhas ao espalhar a agarose na lâmina, pois as bolsas de ar afetarão a migração das caudas do cometa durante a eletroforese (etapa 4.5) e introduzirão rachaduras na etapa de secagem (etapa 5.3)</li>
	<li>Armazene as lâminas a 4 °C no escuro por 15-20 min para garantir que a agarose solidifique completamente (Figura 2A).</li>
	<li>Coloque as lâminas em frascos Coplin e mergulhe as lâminas em tampão de lise por 1 h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Enxágue as lâminas uma vez com tampão TAE frio e mergulhe as lâminas em tampão TAE frio por 30 min a 4 °C.</li>
</ol>4. Eletroforese
<ol><li>Configure a câmara eletroforética em uma superfície plana e nivele o sistema usando os quatro botões de nivelamento nas bordas do aparelho. Insira compressas frias na câmara inferior para manter a solução fria durante a eletroforese.</li>
	<li>Despeje aproximadamente ~ 850 mL de tampão TAE 1x frio no aparelho.</li>
	<li>Retirar as lâminas a 4 °C e colocá-las no tabuleiro de electroforese na orientação correcta para permitir a migração do ADN partido. NOTA: A bandeja comporta dez lâminas de 2 poços. Coloque as lâminas no centro da bandeja se estiver trabalhando com menos amostras. Se estiver trabalhando com um número ímpar de slides, inclua um slide em branco de modo que cada poço acomode 2 slides.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente a sobreposição da bandeja deslizante fornecida em cima da bandeja para cobrir as lâminas. NOTA: Para o funcionamento adequado do aparelho, o volume do tampão TAE não deve ser inferior à superfície inferior do revestimento e não deve exceder a superfície superior do revestimento.</li>
	<li>Após conectar os cabos, ajuste a potência em 21 V e faça eletroforese (1 V/cm) por 40 min. NOTA: O tempo de eletroforese pode precisar ser ajustado dependendo do tipo de célula usada para análises. Caudas longas em amostras não tratadas indicam tempo de execução excessivo. Por outro lado, caudas curtas em amostras de controle positivo podem refletir tempo de execução insuficiente.</li>
</ol>5. Coloração
<ol><li>Após a conclusão da eletroforese, remova as lâminas do aparelho e mergulhe-as em solução de precipitação de DNA por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte a solução de precipitação de DNA e mergulhe as lâminas em solução de etanol a 70% por 30 minu em temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte a solução de etanol a 70%. Remover as lâminas e secá-las em estufa de hibridização a 45 °C durante 30 min no escuro (figura 2B). NOTA: As lâminas podem ser deixadas em um local escuro e seco durante a noite para a etapa de secagem.</li>
	<li>Incubar os poços com 100 μL de solução 1x SYBR Green por 30 min em temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Transvase a solução SYBR Green inclinando as lâminas e removendo o excesso esfregando suavemente a borda do poço com um pano sem fiapos.</li>
	<li>Coloque as lâminas em uma gaveta e deixe secar por 30 min.</li>
	<li>Prossiga com a imagem das lâminas.</li>
</ol>6. Imagiologia e análises
<ol><li>Configure o microscópio para fins de imagem. NOTA: Todas as imagens foram adquiridas usando um microscópio de epifluorescência. A ampliação de 10x com abertura numérica de 0,45 foi usada com um tempo de exposição de 1/40s e um ganho de +6dB. O modo de captura de 8 bits monocromático foi utilizado com binning 2 x 2 e correção de balanço de preto.</li>
	<li>Coloque as lâminas na platina do microscópio e comece a criar imagens usando o filtro FITC. NOTA: Use a amostra não tratada primeiro para testar o tempo de exposição. A maioria das células não exibe caudas de cometas, pois o DNA é mais compacto. Mude para o poço com células tratadas com CPT e imagem usando o mesmo tempo de exposição. Caudas de cometas com comprimentos aumentados serão observadas nesta amostra devido à migração de extremidades de DNA quebradas.</li>
	<li>Adquira imagens de pelo menos 100 cometas por amostra usando o mesmo tempo de exposição em três réplicas técnicas. NOTA: As caudas dos cometas no final das lamínulas tendem a migrar de forma desigual e atuam como outliers na distribuição da amostra. A maioria dos cometas capturados para análises está presente perto do centro da lamínula (Figura 3).</li>
	<li>Exporte imagens e marque os cometas manualmente (usando a Imagem J) ou usando o software de pontuação de cometas disponível gratuitamente. Os cometas que são individualmente distinguíveis e totalmente contidos no campo de visão são selecionados para pontuação. Cometas sobrepostos ou parcialmente visíveis não são considerados para análises posteriores (Figura 4). NOTA: Os usuários podem pontuar cometas na Imagem J usando o seguinte plugin: https://cometbio.org/index.html. Detalhes para pontuar cometas usando o software CometScore estão incluídos na Figura 5.</li>
	<li>Plote os momentos da cauda adquiridos das análises como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90. Realize testes de normalidade para determinar se testes paramétricos ou não paramétricos devem ser utilizados para análises estatísticas. NOTA: Na maioria dos casos, os testes não paramétricos são aplicados usando o teste de Mann-Whitney se comparar apenas duas amostras ou o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn se comparar três ou mais amostras.</li>
</ol>

Investigando a extensão das quebras de DNA que ocorrem durante a replicação do DNA 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Este protocolo descreve um ensaio NC para avaliar quebras de DNA em células humanas submetidas a replicação ativa. O protocolo é relativamente simples de executar e os pesquisadores podem adaptá-lo prontamente a condições de pH alto para análises alcalinas8. Ele inclui duas etapas críticas, conforme descrito nas etapas 3.7 e 4.5. Na etapa 3.7, é essencial espalhar a agarose derretida com células uniformemente pelo poço para evitar que os cometas se sobreponham durante a análise. Certifique-se de que os agregados celulares sejam dissolvidos antes de ressuspender as células em agarose. Evitar a liberação da ponta da pipeta enquanto espalha a agarose ajudará a minimizar a introdução de bolhas. As condições para eletroforese são cruciais para alcançar a migração apropriada da cauda do cometa para imagens e análises. Os pesquisadores devem considerar a natureza das linhagens celulares usadas para análise, pois a extensão da migração da cauda e a porcentagem de células que exibem caudas de cometas variam entre os tipos de células (Figura 9). Portanto, recomenda-se determinar empiricamente o tempo de execução da eletroforese antes da experimentação.
Se nenhuma cauda de cometa for observada em amostras de controle positivo (células tratadas com CPT), a eficácia do medicamento deve ser corroborada em paralelo usando abordagens alternativas, como imunocoloração para o marcador de dano ao DNA γH2AX. A migração extensa da cauda pode impedir a análise da indução de ruptura. Minimizar o tempo de eletroforese e avaliar a morfologia celular antes da análise pode impedir a obtenção de caudas de cometas muito longas. A secagem insuficiente das lâminas pode resultar em imagens borradas e nebulosas do cometa. Certifique-se de que a agarose na lâmina do cometa esteja uniformemente seca e achatada antes de corar com 1x solução SYBR. Se a faixa de indução de dobras for estreita, a realização de uma curva dose-resposta com CPT pode ajudar a determinar uma faixa de trabalho ideal para fins experimentais. A aplicação dessas dicas de solução de problemas ajudará a maximizar os resultados desses ensaios.
Esta metodologia de ensaio é econômica e altamente sensível em comparação com outras técnicas usadas para estudar a indução de quebra de DNA, como o ensaio Halo29,30, o ensaio TUNEL31 e a eletroforese em gel de campo pulsado32. No entanto, a técnica de ensaio atual tem certas limitações. Ele não fornece um número preciso de lesões de DNA, mas oferece uma estimativa relativa do acúmulo de quebras em comparação com células não danificadas. Além disso, não pode avaliar a indução de quebra que ocorre de maneira dependente do ciclo celular. Para excluir alterações na indução de ruptura devido a diferenças na progressão do ciclo celular, as análises do ciclo celular por citometria de fluxo devem ser realizadas em paralelo.

O ensaio cometa é um método de eletroforese em gel usado para detectar quebras de DNA no nível de uma única célula. Ele se baseia no princípio de que as quebras de DNA abertas migram sob condições eletroforéticas, enquanto o DNA intacto permanece em grande parte estático. O DNA quebrado migra porque as quebras resultam no relaxamento do DNA superenrolado, causando sua realocação espacial gradual em direção ao ânodo na câmara eletroforética, o que resulta em uma aparência semelhante a um cometa observada por imunofluorescência 1,2. A extensão do dano ao DNA é então medida quantificando a quantidade de DNA quebrado que migrou em relação ao DNA compacto.
Os dois métodos de ensaio de cometa mais comumente usados são o ensaio de cometa alcalino (AC) e o ensaio de cometa neutro (NC). O ensaio AC é realizado em condições de desnaturação usando uma solução de pH alcalino alto, enquanto o ensaio NC é realizado em uma solução com pH neutro. Os ensaios NC e AC podem detectar com segurança quebras de DNA que ocorrem no núcleo. No entanto, a versão alcalina também é vantajosa para detectar sítios alcalino-lábeis3. Ambos os formatos do ensaio requerem o uso de condições de lise para garantir que o DNA esteja livre de proteínas antes da eletroforese.
Este ensaio é um método simples para detectar quebras de DNA e oferece várias vantagens exclusivas para determinar danos ao DNA celular. O método é relativamente fácil de configurar e requer reagentes que podem ser preparados em laboratório ou adquiridos de fornecedores comerciais. Como uma técnica de resolução de célula única, o ensaio requer muito pouco material inicial. Notavelmente, o ensaio NC pode medir quebras com alta sensibilidade, relatadas para detectar entre 50 e 10.000 quebras por célula4. A versatilidade dessa técnica é demonstrada por sua ampla gama de aplicações, incluindo ecotoxicologia5, biomonitoramento humano6 e estudos de genotoxicidade7. O ensaio também pode ser usado de forma confiável em vários tipos de células e adaptado para ensaios de alto rendimento8 e para avaliar quebras em regiões genômicas específicas9. Assim, este ensaio serve como uma técnica rápida e confiável para investigar a formação de quebras no nível de célula única.
O processo de replicação do DNA é constantemente desafiado por vários estressores endógenos e exógenos10,11. A paralisação dos replissomos devido a essas lesões pode causar quebras de DNA e resultar em maior instabilidade do genoma. As quebras de DNA também surgem frequentemente como intermediários de replicação para facilitar o reparo do DNA12. Além disso, vários agentes quimioterápicos induzem quebras de fita dupla dependentes da replicação (DSBs), como a camptotecina (CPT) 13 , 14 , 15e os inibidores de PARP16 , 17 . Assim, este ensaio serve como uma metodologia poderosa para estudar a natureza das lesões de DNA, avaliar o processamento de garfos de replicação e investigar o potencial terapêutico de agentes prejudiciais ao DNA. Adaptações do ensaio que envolvem a marcação de DNA recém-sintetizado com BrdU têm sido úteis para estudar fenótipos de estresse associados à replicação 18,19,20,21. Notavelmente, o ensaio NC é um método confiável para estudar a indução de quebra de DNA no contexto da replicação, conforme demonstrado em estudos envolvendo a caracterização de proteínas fork22 , 23 , análise de intermediários de replicação24 , 25 e investigação de conflitos de transcrição e replicação na manutenção do genoma26 , 27. Aqui, descrevemos um protocolo de ensaio NC com o objetivo de quantificar as quebras de DNA durante a replicação em células humanas. Este protocolo pode ser prontamente implementado por pesquisadores interessados em avaliar os danos associados ao estresse de replicação em uma ampla variedade de células humanas em divisão.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptotecina</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Cometa LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese CometAssay II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Inclui tanque de eletroforese, tampa de segurança, cabos, bandejas deslizantes de 2/20 poços e sobreposição de bandeja deslizante</td></tr><tr><td>Software</td><td>CometScore TriTek</td><td></td><td>de código aberto</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td>Microscópio de epifluorescência <td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Soro fetal bovino Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>- Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Células hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos Estéril Tratada com Superfície</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>Células U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; Incubadora de hibridização HB-1000</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de quebras de dna em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

A replicação do DNA é constantemente desafiada por uma ampla variedade de estressores endógenos e exógenos que podem danificar o DNA. Tais lesões encontradas durante a duplicação do genoma podem paralisar os replissomos e converter garfos de replicação em quebras de fita dupla. Se não forem reparadas, essas quebras tóxicas de DNA podem desencadear rearranjos cromossômicos, levando a uma maior instabilidade do genoma e a uma maior probabilidade de transformação celular. Além disso, as células cancerígenas exibem estresse de replicação persistente, tornando o direcionamento das vulnerabilidades do garfo de replicação em células tumorais uma estratégia atraente para a quimioterapia. Uma técnica altamente versátil e poderosa para estudar quebras de DNA durante a replicação é o ensaio do cometa. Esta técnica de eletroforese em gel detecta de forma confiável a indução e o reparo de quebras de DNA no nível de uma única célula. Aqui, é descrito um protocolo que permite aos investigadores medir a extensão do dano ao DNA em células humanas em divisão mitótica usando agentes de travamento de garfo em vários tipos de células. Acoplar isso com a pontuação automatizada do cometa facilita a análise rápida e aumenta a confiabilidade no estudo da indução de quebras de DNA.

Análise da indução de quebra por reagentes de tensão de replicação As células U2OS foram tratadas com DMSO, 4 de mM de hidroxiureia (HU) ou 100 nM de CPT por 4 h e analisadas quanto ao acúmulo de quebra pelo ensaio NC (Figura 6A). Enquanto o CPT induz quebras durante a fase S, bloqueando a topoisomerase-113, a depleção induzida por HU de pools de nucleotídeos interrompe os garfos de replicação que são progressivamente convertidos em DSBs28. Os dados indicam que a exposição a HU ou CPT desencadeia a indução de quebra na fase S, que é detectável pelo ensaio NC.
Análise da indução de ruptura comparando lise em diferentes temperaturas As células U2OS não tratadas foram incubadas em tampão de lise à temperatura ambiente (RT) ou 4 ° C antes das análises de indução de quebra ( Figura 6B ). Os resultados indicam que a temperatura na qual a lise é realizada tem impacto mínimo na migração de caudas no ensaio.
Análise temporal de quebras por hidroxiureia (HU) As células U2OS foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 4 mM de HU por 4 h e 8 h antes das análises de indução de quebra pelo ensaio NC (Figura 7). Os resultados indicam que a paralisação prolongada de bifurcações de replicação com HU causa o colapso da bifurcação de replicação em DSBs.
Análise dose-dependente das pausas por camptotecina As células U2OS foram tratadas com doses aumentadas de CPT por 1 h e colhidas para análises de quebra usando o ensaio NC (Figura 8). Enquanto o acúmulo de quebra é mínimo em células não tratadas com CPT, o grau de indução de quebra aumenta gradualmente com o aumento da dose de CPT, demonstrando assim a utilidade do ensaio no estudo dos efeitos dependentes da dose no acúmulo de quebra durante a replicação do DNA.
Análise comparativa de quebras em vários tipos de células Os níveis basais de quebras de DNA foram avaliados em três tipos de células mitóticas divergentes - células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas hTERT (hTERT-RPE-1), vírus símio 40 (SV40), grandes células renais embrionárias humanas que expressam antígeno T (HEK293T) e células de osteossarcoma ósseo (U2OS) (Figura 9). Cada linhagem celular demonstrou migração diferencial de momentos de cauda na ausência de estresse de replicação adicionado, o que pode ser devido a diferenças na distribuição do ciclo celular, organização da cromatina ou número de garfos de replicação ativos. Cada tipo de célula também foi exposto a 1 μM de CPT por 1 h para validar um aumento nas quebras de DNA dependentes da replicação.
Análises de indução de ruptura por ensaio AC As células U2OS foram tratadas com DMSO, 4 mM de HU, 1 μM de CPT ou 10 μM de inibidor de PARP (PARPi) Olaparibe e analisadas para indução de quebra (Figura 10). As células foram tratadas com DMSO, HU e PARPi por 2 h, enquanto o tratamento com CPT foi por 1 h. Os resultados indicam que a exposição ao estresse de replicação causa acúmulo de quebras, o que é observável pelo ensaio AC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do ensaio NC. (A) O número necessário de células é semeado no dia anterior em um prato de 6 poços. (B) Após tratamentos medicamentosos, as células são tripsinizadas e colhidas em PBS frio. (C) As células são suavemente ressuspensas em agarose derretida na proporção de 10:1 (10 μL de agarose para 1 μL de suspensão celular) usando uma ponta de pipeta. (D) A suspensão celular é transferida para um poço deslizante usando uma ponta de pipeta e espalhada uniformemente para cobrir completamente a superfície do poço com agarose. (E) Após incubação a 4 °C, as lâminas são imersas em tampão de lise, seguido de tampão TAE 1x frio. F) As amostras são submetidas a electroforese com o aparelho adequado. (G) As lâminas são então imersas na solução de precipitação de DNA, seguida por uma solução de etanol a 70%. (H) Após a secagem, os poços são corados com 1x solução SYBR Green. (I) As lâminas são fotografadas usando um microscópio de epifluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Figura 2: Vista lateral da agarose em poços de deslizamento de cometas. (A) Após a incubação a 4 ° C (etapa 3.8), a agarose solidificada aparece como uma 'bolha' com uma forma convexa. (B) Após secagem a 45 °C (etapa 5.3), a agarose aparece achatada no poço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Figura 3: Imagens e análise de cometas. (A) Os cometas dentro do círculo interno do poço (destacados em azul) são selecionados para análise. Os cometas em direção à borda externa do poço são excluídos devido a momentos de cauda atipicamente mais longos, marcando-os como outliers. (B) Pelo menos 100 cometas representativos são selecionados aleatoriamente da região de cor azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Figura 4: Imagem representativa de cometas obtida a partir do ensaio NC. O painel direito exibe um campo de visão representativo para os núcleos manchados de verde SYBR, enquanto o painel esquerdo destaca a região (contorno verde) usada para pontuar cometas. Os núcleos parcialmente visíveis ou empilhados próximos uns dos outros (contorno vermelho, painel direito) não são incluídos na análise. Os cometas selecionados para pontuação devem ser individualmente distinguíveis, totalmente contidos no campo de visão e exibir intensidade de coloração uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Figura 5: Pontuação representativa de cometas obtida a partir do ensaio NC. (A) Os núcleos individuais são delineados usando o software CometScore. (B) A visualização de espectro total (painel esquerdo) está habilitada e o limite (barra de corte) é ajustado para atingir a intensidade de sinal ideal com fundo mínimo. O sinal de 'espectro total' deve corresponder à imagem de 'matiz único' (imagem superior, painel direito) e não exceder o contorno (imagem inferior, painel direito). (C) A linha amarela vertical na caixa está alinhada com o centro da cabeça do cometa, usando a parte mais larga da cabeça do cometa como referência para consistência. (D) A pontuação para cada cometa analisado é relatada no canto superior direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Figura 6: Análise da indução de quebra por reagentes de estresse de replicação. (A) As células U2OS foram tratadas com DMSO, 100 nM de camptotecina (CPT) ou 4 mM de hidroxiureia (HU) antes da análise de indução de quebra. O gráfico representativo mostra o aumento do acúmulo de quebras em células tratadas com CPT ou HU. (B) As células U2OS não tratadas foram semeadas em lâminas de cometas e incubadas para lise (etapa 3.9) à temperatura ambiente (RT) ou 4 ° C para comparar o efeito da temperatura de lise. Os momentos finais das análises são plotados como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90, com valores medianos representados por linhas horizontais dentro das caixas. Os valores de p foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Figura 7: Análise temporal das quebras induzidas pela hidroxiureia. As células U2OS não foram tratadas ou tratadas com 4 mM HU por 4 h ou 8 h antes da análise de indução de quebra. O gráfico representativo mostra um aumento gradual no acúmulo de quebras em células tratadas com HU. Os momentos finais das análises são plotados como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90, com valores medianos representados por linhas horizontais dentro das caixas. Os valores de p foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Figura 8: Análise dose-dependente das quebras induzidas pela camptotecina. As células U2OS foram tratadas com DMSO ou concentrações crescentes de CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM) por 1 h antes da análise de quebra. Os momentos finais das análises são plotados como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90, com valores medianos representados por linhas horizontais dentro das caixas. O gráfico representativo mostra um aumento dose-dependente nas quebras induzidas pelo TCP. Os valores de p foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Figura 9: Análise comparativa de quebras em vários tipos de células. As células hTERT-RPE-1, HEK293T e U2OS foram tratadas com DMSO ou 1 μM CPT por 1 h. O gráfico representativo mostra a extensão relativa do dano ao DNA nos três tipos de células na presença ou ausência de CPT. Os momentos da cauda das análises são plotados como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90, com valores medianos representados por linhas horizontais dentro das caixas. Os valores de p foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Figura 10: Análise da indução de ruptura pelo ensaio AC. As células U2OS foram tratadas com DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT ou 10 μM de inibidor de PARP Olaparib antes da análise de indução de quebra. As células foram tratadas com inibidores de DMSO, HU e PARP por 2 h, enquanto o tratamento com CPT foi por 1 h. O gráfico representativo demonstra aumento do acúmulo de quebra em células tratadas com inibidores de CPT, HU ou PARP. Os momentos finais das análises são plotados como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90, com valores medianos representados por linhas horizontais dentro das caixas. Os valores de p foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Solução de trabalho</td>
		</tr><tr><td>Tampão de lise</td>
			<td>0,5% SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x tampão TAE</td>
			<td>40 mM Tris Base, 20 mM de ácido acético, 1 mM EDTA em pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>Solução de precipitação de DNA</td>
			<td>1 M de acetato de amônio, 87% de etanol</td>
		</tr><tr><td>Solução de etanol a 70%</td>
			<td>70% de etanol em água destilada</td>
		</tr><tr><td>1x solução SYBR Green</td>
			<td>1x SYBR Green em 1x tampão TAE</td>
		</tr><tr><td>Meios de cultura DMEM</td>
			<td>DMEM com 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Meios de cultura DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 com 7,5% de FBS</td>
		</tr><tr><td>Solução de desenrolamento alcalina (para uso em ensaio de cometa alcalino)</td>
			<td>200 mM de NaOH, 1 mM de EDTA em pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista de buffers e soluções.

Este protocolo é projetado para investigar a extensão dos danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA. Em condições neutras, a indução de quebras de DNA pode ser prontamente avaliada em um curto período de tempo. Além disso, o protocolo é adaptável a outros tipos de células e vários reagentes de estresse de replicação.

Detecção de quebras de DNA em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Aqui descrevemos duas modificações do ensaio de fibra de DNA para investigar lacunas de DNA de uma única vez na replicação do DNA após indução da lesão. O ensaio de fibra S1 permite a detecção de lacunas pós-replicativas usando a endonuclease S1 específica do SSDNA, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas permite visualização e quantificação do reparo de lacunas.

Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA

O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Este protocolo descreve um método eficaz para quantificar a diferença no dano ao DNA induzido por inibidores do tipo I e tipo II em células mutantes FLT3 por meio da aplicação do ensaio cometa.

Ensaio cometa para quantificar danos ao DNA em células 32D que expressam mutantes FLT3 após exposição a inibidores de FLT3 tipo I e tipo II

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Nós demonstramos a montagem e aplicação de um dispositivo em escala molecular alimentado por uma proteína topoisomerase. A construção é um sensor de bio-molecular que rotula dois principais tipos de quebras de DNA em cortes de tecido, anexando dois fluoróforos diferentes para os seus fins.

Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

Aprenda a detectar quebras de DNA em células humanas em divisão usando ensaio de cometa neutro. Este método avalia danos durante a replicação e o papel de SNF2L na síntese de DNA.

Detecção de quebras de DNA em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro

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