Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

Nossa pesquisa se concentra no mecanismo de herança epigenética. Especificamente, a replicação do DNA acoplou o processo de reciclagem de histonas parentais, que representam a primeira etapa emissora na herança epigenética. A deposição de múltiplas histonas parentais envolvidas na replicação do DNA foi identificada como desempenhando um papel importante na reciclagem de histonas parentais.

Isso inclui complexo D helicase, DNA polimerase e replicação para complexo de proteção. Abordagens genéticas e bioquímicas tradicionais têm sido valores utilizados neste campo de pesquisa. Tradicionalmente, métodos de sequenciamento de alto rendimento estão sendo empregados para entender o processo de transferência de histonas parentais.

Antes do enriquecimento e sequenciamento do DNA associado a proteínas, ou método de experimento, foi desenvolvido O método experimental foi uma ferramenta poderosa para abordar essas questões fundamentais. Para começar, lixe os grânulos de células de levedura e ressuspenda-os por um vórtice suave.

Em seguida, lave o mesmo com 0,4 mililitros de tampão de lise CHIP contendo inibidores de protease e uma mistura de antibióticos para evitar a contaminação bacteriana. Centrifugar a mistura a 5 000 g durante um minuto. Em seguida, adicione 0,1 mililitros de tampão de lise CHIP com inibidores de protease e mistura de antibióticos ao pellet.

Seguido por aproximadamente 100 microlitros de contas de vidro de 0,5 milímetro. Lise as células por beading por três ciclos em uma câmara fria de quatro graus Celsius. Usando uma agulha quente de calibre 16, faça furos na parte inferior do tubo.

Colete o lisado aninhando o tubo perfurado em um tubo de baixa ligação de DNA vazio de 1,5 mililitro e centrifugue a 1.600 G por dois minutos em temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. A fração de detritos celulares conterá a cromatina.

Ressuspenda os grânulos celulares pipetando 0,35 mililitros de nuclease microcócica suplementada ou tampão de digestão MNase. Em seguida, adicione 10 unidades de MNase à suspensão. Misture delicadamente invertendo quatro a seis vezes e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Sacie a digestão da MNase adicionando cinco microlitros de EDTA 0,5 molar a uma concentração final de 10 milimolares. Misture delicadamente por inversão e coloque o tubo no gelo por pelo menos 30 minutos. Usando microtubos Bioruptor de 1,5 mililitro, sonice a mistura de reação em alta potência por três minutos com ciclos de 30 segundos e 30 segundos de desligamento.

Em seguida, centrifugue a 10.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para novos tubos e centrifugar novamente a 10 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, colete aproximadamente 400 microlitros do sobrenadante.

Economize 30 microlitros como DNA de entrada para extração de DNA e congele a menos 20 graus Celsius. Use os 370 microlitros restantes de lisado celular para imunoprecipitação de histona cromatina. Para começar, ferva cerca de 150 microlitros da entrada obtida anteriormente e amostras de H3K4me3 CHIP em um bloco de calor de 100 graus Celsius Por cinco minutos, resfrie imediatamente a amostra no gelo por cinco minutos.

Em seguida, adicione a quantidade necessária dos componentes mencionados à amostra. Mutar a amostra por duas horas em um rotor a quatro graus Celsius e 10 RPM. Transfira a mistura para um tubo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros de grânulos de proteína G Sepharose lavados.

Mute a mistura por uma hora a quatro graus Celsius no rotor a 10 RPM. Girar os tubos à temperatura ambiente a 800 G durante um minuto. Lave as esferas três vezes com um mililitro de bromo-desoxiuridina fria ou tampão de imunoprecipitação BrdU girando por três minutos para cada lavagem.

Centrifugue novamente o tubo e lave com um mililitro de tampão TE por três minutos. Girar novamente os tubos a 800 G durante um minuto à temperatura ambiente e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 100 microlitros de tampão TE com 1% SDS aos grânulos.

Incube a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e gire a 800 G por um minuto em temperatura ambiente. Purifique o sobrenadante em 18 microlitros de tampão de eluição usando colunas de purificação de DNA para obter a imunoprecipitação BrdU e amostras de H3K4me3 eSPAN. Prepare a biblioteca de DNA de fita simples com as amostras mencionadas seguindo o manual do kit de preparação da biblioteca de ssDNA e DNA de baixa entrada.

Purifique o produto de ligadura em 20 microlitros de tampão de eluição de baixo EDTA. Amplifique a biblioteca de DNA usando 50 microlitros de mistura de reação do kit de preparação da biblioteca de DNA de fita simples. Seguindo o ciclo exibido, amplifique a mistura de PCR.

Purifique os produtos de PCR misturando-os com 60 microlitros de grânulos, pré-aquecidos a 30 graus Celsius. Misture bem os produtos de PCR e as contas. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Amarre as contas em um suporte magnético por três minutos e lave-as duas vezes com 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado. Seque as esferas ao ar por dois minutos e dilua o DNA em 20 microlitros de tampão de baixo EDTA fornecido no kit de preparação da biblioteca de DNA. Meça a concentração da biblioteca e a distribuição do tamanho do fragmento usando sistemas de eletroforese de alta resolução.

Reúna quantidades iguais de bibliotecas individuais, incluindo a imunoprecipitação de cromatina H3K4me3 de entrada, imunoprecipitação BrdU, amostras de eSPAN para realizar sequenciamento final emparelhado paralelo. Uma análise de gel típica da biblioteca de sequenciamento de DNA de H3K4me3 eSPAN revelou um padrão de escada de nucleossomos de cromatina. A banda principal do mononucleossomo apareceu em 270 pares de bases, onde os adaptadores foram adicionados ao fragmento de DNA obtido da digestão.

O mapeamento de amostra diferente revelou picos em nucleossomos individuais ao redor da sequência de replicação autônoma de origem 607 em células do tipo selvagem e mcm2-3A. O viés médio da fita revelou que, em células de levedura do tipo selvagem, a deposição de histonas parentais exibiu um leve viés em direção à fita atrasada. No entanto, na histona parental mutante, H3H4 foi transferida para a fita principal.