Name: Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda o método eSPAN para analisar a deposição de histonas parentais em leveduras e células-tronco embrionárias de mouse. Esta técnica revela a dinâmica da replicação cromossômica e mecanismos de herança epigenética.

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Esse trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) e pelo Hormel Startup Fund (C.Y.).

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A detecção de proteínas associadas a cadeias de replicação avançadas e atrasadas é importante para entender os mecanismos de replicação da cromatina e o processo associado, que são diretamente relevantes para a pesquisa em câncer humano e os mecanismos de resistência a medicamentos. Vários métodos, como gel 2D, imunoprecipitação nativa de Cromatina (nChIP), iPOND e captura nascente decromatina 29,30,31, foram empregados para estudar a replicação do DNA e processos relacionados, como o reparo do DN...

Em organismos eucarióticos, a duplicação do genoma é iniciada a partir de múltiplos locais chamados origens de replicação, onde o complexo de reconhecimento de origem (ORC) se liga e inicia a maquinaria proteica de recrutamento, incluindo a helicase CMG, para iniciar a replicaçãodo DNA 1. A maquinaria respondesoma em cada origem de replicação forma dois forks de replicação que se movembidirecionalmente 2,3. Os bifurcadores de replicação dupla replicam as duas fitas parentais do DNA por meio da síntese contínua da fita líder e da síntese descontínua da fita retardada. Dada essa natureza assimétrica de cada garfo de replicação, os componentes de replicação, incluindo as DNA polimerases nas fitas dianteira e retardada, são diferentes. Análises genéticas anteriores baseadas em DNA polimerases mutantes demonstram que o DNA Pol ε e o DNA Pol δ são as principais polimerases responsáveis pela replicação da cadeia líder e atrasada,respectivamente 4,5. Vários métodos foram desenvolvidos para detectar a preferência da DNA polimerase pela cadeia, incluindo Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 e emRiboSeq ou RiboSeq 9,10. Esses métodos genéticos para dissecar a especificidade da cadeia são limitados a DNA polimerases e exigem a introdução de mutações em cadaproteína 4,5,11,12. Rastrear a associação de qualquer proteína-alvo com as cadeias dianteiras e atrasadas dos forquilhadores de replicação de DNA fornecerá insights valiosos sobre a replicação do DNA. Neste esforço, primeiro desenvolvemos a técnica eSPAN (enriquecimento e sequenciamento de DNA nascente associado a proteínas, Figura 1) em células de levedura. Como estudo de prova de princípio, mostramos inicialmente que Pol δ e Pol δ são enriquecidos em fios líderes e atrasados, respectivamente. Também descobrimos a preferência de fita dos principais componentes da replicação do DNA, incluindo a helicase replicativa de DNA, a proteína de ligação ao DNA de fita simples (proteína de replicação A), a lâmpada de antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA) e seu fator de replicação carregador C (RFC)13. Importante, nós e outros usamos esse método para descobrir mecanismos de transferência parental de histonas, um processo que foi intratável por mais de 4 décadas14, 15, 16, 17.
O método eSPAN envolve duas etapas sequenciais: enriquecimento da proteína-alvo por ChIP18 ou CUT&Tag 19 e enriquecimento do DNA nascente associado à proteína por imunoprecipitação de BrdU. Em uma cepa padrão de levedura (W303 ou S288C), BrdU ou EdU extracelular não pode entrar nas células e incorporar-se aos cromossomos. Essas cepas não possuem um transportador de nucleósidos adequado para a captação de timidina, bem como a timidina quinase necessária para fosforilar a timidina em TMP, que converte BrdU (ou EdU) em BrdUMP (EdUMP). A expressão do transportador de nucleósidos equilibrados humanos 1 (hENT1) e do vírus do herpes simplex timidina quinase (HSV-TK) aumenta a absorção de timidina e a conversão de BrdU (ou EdU) em BrdUMP (EdUMP)20. Portanto, para realizar o experimento eSPAN em leveduras, as cepas tiveram que ser inseridas com uma estrutura BrdU-Incorporante (BrdU-Inc) (HSV-TK e hENT1)13,21.
Anteriormente, fornecemos o protocolo eSPAN para proteínas de replicação de DNA nalevedura 22. Recentemente, integramos o método CUT&Tag ao protocolo eSPAN em células de mamíferos para abordar etapas tecnicamente desafiadoras que exigem otimização, como reticulação, cisalhamento da cromatina, e para minimizar o número de célulasiniciais 17,23. Aqui, fornecemos eSPAN de histonas para visualização usando células de levedura (Figura 2). Esse método é usado principalmente para analisar a distribuição de formas modificadas de histonas em fitas de DNA replicantes. Embora tenhamos testado várias marcas de histonas, usamos H3K4me3, uma marca na histona parental H3, como exemplo. Para analisar componentes e fatores responsosas envolvidos na reparação do DNA em bifurcações de replicação, recomendamos a cisalhamento da cromatina em pequenos fragmentos usando sonicação, conforme descrito em nossa primeirapublicação 22. Para células de mamíferos, adotamos os procedimentos modificados Cut&Tag para substituir a etapa ChIP descrita nalevedura 23. Essa modificação reduz a quantidade de material inicial (células) e, mais importante, permite a geração de bibliotecas eSPAN para sequenciamento sem o uso de kits de preparação de DNA de fita simples. Para o protocolo de levedura, optamos por não usar o método Cut&Tag porque a quantidade de material inicial era suficiente. Mais importante ainda, descobrimos que os procedimentos Cut&Tag não foram consistentemente eficazes para as células de levedura em nossas mãos.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL de DNA com baixa ligação & nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Ampligase 10x</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 pol. BD PrecisionAgulha Deslizante</td><td>BD em Biociências</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>KIT DE BIBLIOTECA DE DNA ACCEL-NGS 1S MAIS DNA</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>10009817</td><td>kit de preparação de bibliotecas de DNA ssDNA e baixa entrada &nbsp;</td></tr><tr><td>Bioanalisador Agilent 2100 &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Bioanálise de 2100</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA 1000 & nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Manuseie o paraformaldeído com cuidado, pois é sólido inflamável e perigoso.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Reagente SPRI AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-BrdU &nbsp;</td><td>BD em Biociências</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-H3K4me3&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado&nbsp;, modelo TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Benzamidina &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Sólidos Combustíveis</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Manuseie o BrdU com cuidado, pois é um possível mutagênico e teratogênio.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura celular &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Incubadora de CO2 com camisa d'água modelo Forma série II</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura celular &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linha celular ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; Tamanho 400 de malha seca</td></tr><tr><td>Clorofórmio &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Esferas magnéticas revestidas com concanavinina A () &nbsp;</td><td>Policiências</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Manuseie o etanol com cuidado, ele é inflamável</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Manuseie o isopropoñol com cuidado, ele é inflamável</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>Manuseie o KOH com cuidado, é corrosivo</td></tr><tr><td>Vácuo de baixa velocidade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de ímã &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease microcócica &nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação PCR MinElute & nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Batedor de mini-contas</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrífuga &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Agitador multiplataforma</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de shakers multiplataforma</td><td>Referência</td><td>SHAKER INCU 10L</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor multitérmico & nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Termomisturador C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfônico&nbsp; (BATIDAS)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; Tamanho 400 de malha seca</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Manuseie o NaOH com cuidado, ele é corrosivo</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2 vezes; Mistura master PCR</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Termo Científica</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldído</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>Manuseie o paraformaldeído com cuidado, pois é sólido inflamável e perigoso.</td></tr><tr><td>enzima pA-Tn5 &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-clorofórmio-isoamílico álcool &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000, P200, P20 e P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de coquetel inibidor de protease</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de coquetel inibidor de protease & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G-esferas de sefarosa&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Solução de precipitação de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de precipitação de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Manuseie o KOH com cuidado, é corrosivo</td></tr><tr><td>Solução de precipitação de proteínas &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR de purificação & nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro &nbsp;</td><td>Termocientífica.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs, &nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de tampo de mesa &nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>extrato de levedura & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

análise específica de fitas de proteínas em fitas de dna replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de dna nascente associado a proteínas

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

A duplicação do genoma é orquestrada por proteínas respondesomes, incluindo helicases, que desenrolam DNA de fita dupla em fitas simples antiparalelas individuais, cada uma exigindo modos distintos de replicação: contínua (antecipada) e descontínua (atrasada). Compreender as interações das proteínas associadas à cromatina com fitas de DNA replicantes in vivo é crucial para elucidar os mecanismos de montagem da cromatina e reparo do DNA acoplados à replicação do DNA. Este protocolo apresenta o método de enriquecimento e sequenciamento de DNA nascente associado a proteínas (eSPAN), projetado para quantificar os níveis relativos de proteínas em cadeias de DNA nascente e atrasadas em garfos de replicação. O procedimento eSPAN começa com imunoprecipitação de cromatina (ChIP, em levedura) ou clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag; em células de mamíferos) de uma proteína de interesse, seguido pelo enriquecimento do DNA nascente associado à proteína por imunoprecipitação de bromodeoxiuridina (BrdU). O sequenciamento de próxima geração específico para fita é aplicado ao ssDNA isolado. Essa técnica pode ser usada para determinar se uma proteína está enriquecida em forquilhados de replicação dianteiros ou atrasados. O eSPAN fornece preferência de cadeia genômica para proteínas associadas à cromatina, incluindo histonas em bifurcações de replicação.

O eSPAN pode ser utilizado para adquirir informações específicas de fita sobre uma proteína-alvo, como histonas e modificações de histonas. Neste resultado representativo, a coleta de amostras e os processos eSPAN foram realizados seguindo o esquema descrito na Figura 2, utilizando o sistema de levedura de gemação. O tratamento e a coleta da amostra seguem a condição inicial da fase S tratada por hidroxiurea conforme este protocolo. Duas cepas de levedura, WT (tipo selvagem) e mutante mc...

O enriquecimento e sequenciamento do DNA nascente associado a proteínas (eSPAN) foi desenvolvido para detectar a abundância relativa de uma proteína associada à cromatina em duas fitas replicantes de DNA, revelando assim insights moleculares sobre a replicação da cromatina e seus processos acoplados. Este protocolo descreve procedimentos de eSPAN em células-tronco embrionárias (ES) de levedura e camundongo.

Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas e modificações de histonas associadas a DNA recém-sintetizado ou nascente.

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Descrevemos aqui um sistema que utiliza um bloco de proteína in vivo reversível e específico do local para parar e colapsar garfos de replicação em Escherichia coli. O estabelecimento do bloco de replicação é avaliado por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose bidimensional neutro-neutro é usada para visualizar intermediários de replicação.

Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i&gt; E. coli</i&gt; Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

Experimentos de Microarray de ligação proteica (PBM) combinados com ensaios bioquímicos ligam as propriedades vinculativas e catalíticas da primase do DNA, uma enzima que sintetiza os primers de RNA no DNA do modelo. Este método, designado como o perfilamento do primase da elevado-taxa de transferência (HTPP), pode ser usado para revelar testes padrões DNA-Binding de uma variedade de enzimas.

Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aqui, descrevemos o procedimento para analisar a progressão da replicação por meio de repetições patogênicas e propensas à estrutura usando eletroforese em gel bidimensional.

Análise eletroforética da replicação por meio de repetições de DNA propensas à estrutura dentro do epissoma humano baseado em SV40

Aprenda o método eSPAN para analisar a deposição de histonas parentais em leveduras e células-tronco embrionárias de mouse. Esta técnica revela a dinâmica da replicação cromossômica e mecanismos de herança epigenética.

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Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

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