Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo
10 de janeiro de 2025
A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.
Nossa pesquisa se concentra na leucemia, especificamente nas síndromes mielodisplásicas ou neoplasias mielodisplásicas. É uma doença com células-tronco originada de células-tronco hematopoiéticas. Afeta várias linhagens de células sanguíneas, particularmente a linhagem eritróide, que é responsável pela produção de células sanguíneas do coração.
A ruptura dessa linhagem pode levar à anemia, que é comumente observada em pacientes com SMD. O pipeline que fornecemos neste artigo permite um método robusto e simplificado para avaliar a eficiência do eritroblasto humano in vitro após modificação genética ou tratamento medicamentoso. As células-tronco hematopoiéticas estão presentes desde o nascimento até o último momento de nossas vidas.
Não há mais tecido proliferativo em nosso organismo com trilhões de células produzidas todos os dias. Ainda há muitas coisas para entender, então continuaremos estudando essas células incríveis em tecidos aminoácidos saudáveis com forte ênfase na proteostase e na biologia do RNA. Para começar, descongele 100.000 células CD34 + UCB mergulhando o frasco por 30 segundos em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius.
Adicione um mililitro de meio de descongelamento gota a gota ao frasco e, em seguida, ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão da célula ressuspensa gota a gota para cinco mililitros de meio de descongelamento. Em seguida, centrifugue a suspensão da célula durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Lave as células em 10 mililitros de classificação de células ativadas por fluorescência ou tampão FACS com DNAse. Depois de centrifugar as células novamente, ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de estimulação. Transfira dois mililitros de suspensão celular para uma placa de 24 poços e incube a placa por quatro a seis horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, colete as células em tubos de classificação de células ativadas por fluorescência e complete-as com um mililitro de meio de células-tronco. Depois de descongelar o vírus, adicione o volume necessário ao meio de estimulação para atingir uma multiplicidade de infecção de 30. Ressuspenda as células peletizadas em meios contendo vírus a uma densidade de 100.000 células por 100 microlitros de vírus e transfira-as para um poço de uma placa de 96 poços.
Adicione PBS aos poços vazios e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira todo o volume da suspensão celular do poço da placa de 96 poços para tubos FACS com um mililitro de meio de células-tronco. Lave o poço e a ponta da pipeta com meio de células-tronco para adicionar dois mililitros de meio de células-tronco ao tubo FACS.
Depois de centrifugar o tubo FACS, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em dois mililitros de meios de expansão. Transfira a suspensão para um poço de uma placa de 24 poços e incube as células. Para começar, transfira o volume total de células CD34 + transduzidas com o repórter EGFP para um tubo FACS separado.
Centrifugue a 320 g por oito minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células peletizadas em 100 microlitros de tampão FACS. Adicione cinco microlitros de anticorpo CD34 por tubo e incube os tubos no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, ressuspender as células em um mililitro de tampão FACS contendo DAPI e centrifugar por oito minutos a 320 G à temperatura ambiente. Depois de ressuspender as células em 200 microlitros de tampão FACS contendo DAPI, filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros antes da classificação. Em seguida, adicione 0,5 microlitros de anticorpo CD34 a uma gota de grânulos em 100 microlitros de PBS.
Incube a mistura no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de PBS à mistura. Centrifugar durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione células leucêmicas GFP-negativas e GFP-positivas a um tubo FACS. Lave as células em um mililitro de tampão FACS.
Depois de centrifugar as células, ressuspenda 100.000 células GFP-negativas e 100.000 células GFP-positivas, cada uma em 500 microlitros de tampão FACS. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de 40 micrómetros antes da triagem. Em seguida, colete as células classificadas em meio de células-tronco.
Centrifugue as células durante oito minutos a 320 G à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células em três mililitros de meios de diferenciação eritróide. Agora dispense um mililitro das células ressuspensas em três poços de uma placa de 24 poços.
Encha todos os poços externos com PBS. Para atualizar a mídia, certifique-se de que as células tenham se acomodado na parte inferior da placa. Incline suavemente a placa e remova 500 microlitros de mídia.
Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de diferenciação eritróide de citocina 2X para refrescar a placa. No sexto dia, transfira as células para uma placa de 12 poços e adicione um mililitro de meio a cada poço para atingir um volume final de dois mililitros. Colete 200 microlitros de células de cada poço da placa de 12 poços.
Substitua o volume removido por 250 microlitros de meios de diferenciação eritróide 2X. Adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo de coleta. Depois de centrifugar os tubos, ressuspenda as células peletizadas em 100 microlitros de tampão FACS.
Adicione um microlitro de cada um dos anticorpos CD71, CD34 e CD235a aos tubos. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de tampão FACS contendo DAPI. Centrifugar os tubos durante oito minutos a 320 g à temperatura ambiente.
Ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão FACS com DAPI. Defina DAPI versus dispersão lateral ou SSC para excluir células mortas. Defina a altura do SSC versus a área do SSC para excluir agregados e selecionar células únicas.
Defina a área de dispersão avançada versus SSCA para remover detritos com base no tamanho. Conjunto CD235a versus CD71. Conjunto CD34 versus SSCA.
Execute grânulos de células positivas para GFP e células coradas com DAPI. Compense as leituras e aplique a compensação às configurações do citômetro. As células CD34-positivas do sangue do cordão umbilical exibiram um aumento nas células apoptóticas positivas para Anexina V de 14,4% no quarto dia para 34,2% no dia 17.
O gráfico de barras mostra um aumento significativo na porcentagem de células positivas para Anexina V no dia 17, atingindo aproximadamente 40%
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Visão Geral
Este estudo investiga a diferenciação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas CD34+ ex vivo, abordando os processos críticos envolvidos na eritropoiese e suas implicações para o tratamento de distúrbios relacionados, como as síndromes mielodisplásicas. Ao fornecer um método simplificado para avaliar a eficiência de eritroblastos, a pesquisa tem como objetivo aprimorar a compreensão das alterações que levam à anemia nesses pacientes.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Eritropoese
- Síndromes mielodisplásicas
- Biologia das células-tronco hematopoiéticas
Antecedentes
- As síndromes mielodisplásicas são doenças das células-tronco que afetam as linhagens de células sanguíneas.
- A interrupção da linhagem eritróide pode levar à anemia.
- Compreender as células-tronco hematopoiéticas é fundamental, pois elas persistem durante toda a vida humana.
Métodos Utilizados
- Descongelação e ressuspendimento de células de CB CD34+
- Transdução celular com modificações genéticas
- Classificação de células ativada por fluorescência (FACS)
Resultados Principais
- Células CD34+ exibiram aumento nas taxas de apoptose ao longo do tempo.
- Foi demonstrada diferenciação eficiente em eritroblastos.
- Os métodos específicos desenvolvidos permitem a avaliação após modificação genética ou tratamento com fármacos.
Conclusões
- O estudo demonstra um método robusto para a diferenciação de células hematopoiéticas que pode levar a tratamentos mais eficazes para a anemia causada por síndromes mielodisplásicas.
- Este trabalho enfatiza a importância de compreender a diferenciação celular na biologia das células-tronco.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação eficiente da eritropoiese humana é fundamental para reduzir riscos na descoberta precoce de fármacos em hematologia e para compreender os mecanismos subjacentes à anemia e às síndromes mielodisplásicas. Este fluxo de trabalho permite uma avaliação robusta e quantitativa da diferenciação eritoide e da função gênica em sistemas humanos saudáveis e em condições relacionadas a doenças. A abordagem oferece confiança preditiva na validação de alvos e orienta decisões sobre portfólios de terapias que modulam a eritropoiese.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função gênica e do impacto de vias na linhagem eritróide.
- Auxilia na desmistificação biológica ao quantificar os efeitos de perturbações genéticas ou compostas na eritropoiese.
- Facilita a validação funcional de alvos em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas primárias.
- Fornece insights mecanicistas sobre interrupções relevantes para doenças, como as observadas nas síndromes mielodisplásicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Estabelece sistemas validados in vitro e ex vivo para triagem de compostos que afetam a diferenciação eritróide.
- Permite leituras quantitativas reprodutíveis utilizando citometria de fluxo e identificação celular baseada em marcadores.
- Apóia a padronização de ensaios para comparação entre estudos e entre equipes.
- Prepara plataformas escalonáveis para avaliação de estratégias de modulação gênica e resgate farmacológico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com modelos derivados de pacientes ex vivo para continuidade translacional.
- Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos com efeitos demonstrados sobre a eritropoiese.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores por meio do acompanhamento de marcadores de diferenciação e apoptose ao longo dos pontos temporais.
- Oferece desvio de risco mecanicista para a seleção pré-clínica de candidatos em portfólios de hematologia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica em pipelines voltados para a hematologia.
- Biologia da Descoberta: Quantifica os efeitos de genes e compostos na especificação e maturação da linhagem eritróide.
- Triagem: Fornece ensaios padronizados e reprodutíveis baseados em citometria de fluxo para triagem de compostos e genética.
- Análises: Fornece saídas quantitativas, como taxas de apoptose e expressão de marcadores, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro e ex vivo a modelos de doenças relevantes para pacientes.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho modular e reutilizável, adaptável a diversas bibliotecas de compostos e alvos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na compreensão mecanicista da eritropoiese.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho para reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e reduz riscos biológicos tardios em programas de hematologia.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e compostos com efeitos eritroides validados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco hematopoiéticas e análise de citometria de fluxo.
- Necessita de acesso a instrumentação FACS e painéis de anticorpos validados para marcadores eritróides.
- Exige padronização entre equipes nas estratégias de aquisição e interpretação de dados.
- Adaptável a amostras de doadores saudáveis e de pacientes, ampliando sua aplicabilidade.
- Depende de fontes celulares robustas e controle de qualidade para resultados reprodutíveis.
