Name: Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro usando células CD34+ e técnicas de FACS. Este método simplificado permite analisar a diferenciação eritroide após modificação gênica ou tratamento farmacológico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modelagem de eritropoiese usando HSPCs de sangue de cordão umbilical e medula óssea

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX meio de montagem&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Solução Giemsa</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>EPO Humano</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Ligante Humano Flt-3</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>G-CSF humano</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 humano</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 humano</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald solução&nbsp;</td>Scanner de Alta Taxa de Transferência <td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Medium Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

As células CD34 + do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea são primeiro descongeladas, estimuladas e transduzidas com um shRNA que expressa GFP (Figura 1A). As células CD34 + GFP + são classificadas 4 dias após a transdução, de acordo com a estratégia de gating ilustrada na Figura 1B. Os resultados representativos mostraram a maturação das células CD34+ após transdução e classificação FACS. As células são anali...

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Aqui nós apresentamos técnicas para medir a deformabilidade eritrócitos e heterogeneidade celular por ektacytometry. Estas técnicas são aplicáveis às investigações gerais de deformabilidade eritrócitos e investigações específicas de doenças do sangue caracterizadas pela presença de eritrócitos rígidas e deformáveis em circulação, tais como anemia falciforme.

Medição de deformabilidade e heterogeneidade de glóbulos vermelhos no sangue por Ektacytometry

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Aprenda a avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro usando células CD34+ e técnicas de FACS. Este método simplificado permite analisar a diferenciação eritroide após modificação gênica ou tratamento farmacológico.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

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