Name: Dissecção de ovários, intestino médio e glândulas salivares de mosquitos para análises de microbioma no nível do órgão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:25:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: Aprenda técnicas de dissecação de ovários, intestino médio e glândulas salivares de mosquitos para análises de microbioma em nível de órgão. Este método previne contaminação cruzada e auxilia no estudo de simbiontes microbianos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento de órgãos de mosquitos de alta precisão para análises de microbioma

<ol><li>Achee, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+strategies+for+mosquito-borne+arbovirus+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Alternative strategies for mosquito-borne arbovirus control.</a> PLOS Negl Trop Dis. 13 (1), e0006822(2019).</li>
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<li>Garrigós, M., Garrido, M., Panisse, G., Veiga, J., Martínez-de La Puente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+West+Nile+Virus+and+the+microbiota+of+Culex+pipiens+vectors%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interactions between West Nile Virus and the microbiota of Culex pipiens vectors: A literature review.</a> Pathogens. 12 (11), 1287(2023).</li>
<li>Zheng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holobiont+perspectives+on+tripartite+interactions+among+microbiota%2C+mosquitoes%2C+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Holobiont perspectives on tripartite interactions among microbiota, mosquitoes, and pathogens.</a> ISME J. 17 (8), 1143-1152 (2023).</li>
<li>Flores, G. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+dominance+influences+the+Culex+quinquefasciatus+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Wolbachia dominance influences the Culex quinquefasciatus microbiota.</a> Sci Rep. 13 (1), 18980(2023).</li>
<li>Hegde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkingdom+interactions+shape+the+fungal+microbiome+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Microbiome%22%5BJournal%5D)">Interkingdom interactions shape the fungal microbiome of mosquitoes.</a> Anim Microbiome. 6 (1), 11(2024).</li>
<li>Suo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+midgut+bacterial+diversity+in+Culex+quinquefasciatus+populations+in+Haikou+city%2C+Hainan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of midgut bacterial diversity in Culex quinquefasciatus populations in Haikou city, Hainan province, China.</a> Biology. 11 (8), 1166(2022).</li>
<li>Gruber-Vodicka, H. R., Seah, B. K. B., Pruesse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phyloFlash%3A+Rapid+small-subunit+rRNA+profiling+and+targeted+assembly+from+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">phyloFlash: Rapid small-subunit rRNA profiling and targeted assembly from metagenomes.</a> mSystems. 5 (5), e00920-e00920 (2020).</li>
<li>Graña-Miraglia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spirochetes+isolated+from+arthropods+constitute+a+novel+genus+Entomospira+genus+novum+within+the+order+Spirochaetales%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spirochetes isolated from arthropods constitute a novel genus Entomospira genus novum within the order Spirochaetales.</a> Sci Rep. 10 (1), 17053(2020).</li>
<li>Reveillaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wolbachia+mobilome+in+Culex+pipiens+includes+a+putative+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Wolbachia mobilome in Culex pipiens includes a putative plasmid.</a> Nat Commun. 10 (1), 1051(2019).</li>
<li>Ghousein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pWCP+is+a+widely+distributed+and+highly+conserved+Wolbachia+plasmid+in+Culex+pipiens+and+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Commun%22%5BJournal%5D)">pWCP is a widely distributed and highly conserved Wolbachia plasmid in Culex pipiens and Culex quinquefasciatus mosquitoes worldwide.</a> ISME Commun. 3 (1), 40(2023).</li>
<li>Juma, E. O., Kim, C. -H., Dunlap, C., Allan, B. F., Stone, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Culex+restuans+egg+rafts+harbor+diverse+bacterial+communities+compared+to+their+midgut+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Culex restuans egg rafts harbor diverse bacterial communities compared to their midgut tissues.</a> Parasit Vectors. 13 (1), 532(2020).</li>
<li>Lee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GToTree%3A+a+user-friendly+workflow+for+phylogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GToTree: a user-friendly workflow for phylogenomics.</a> Bioinformatics. 35 (20), 4162-4164 (2019).</li>
<li>Parks, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+domain-to-species+taxonomy+for+bacteria+and+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A complete domain-to-species taxonomy for bacteria and Archaea.</a> Nat Biotechnology. 38 (9), 1079-1086 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Álcool 96&deg;</td><td>Lupa binocular Fisher scientific</td><td>10332562</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>RAJA</td><td>145517</td><td>150 comprimidos de 1,5 g de</td></tr><tr><td>kit de preparação de DNA</td><td>Illumina</td><td>Fornecido pela plataforma de sequenciamento MGX</td><td>Anteriormente conhecido como Nextera DNA Flex</td></tr><tr><td>DNA-RNA Shield (50 mL)</td><td>Zymo research</td><td>ZR1100-50</td><td>Tampão de preservação</td></tr><tr><td>DNeasy Kit de Sangue e Tecidos&nbsp;</td><td>Kit de extração de DNA</td> <td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>Pontas de filtro 20 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro 200 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-8710</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro 1000 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1122-1730-C</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST (Ferramentas de Belas Ciências)</td><td>11252-20</td><td>Fórceps Dumont #5</td></tr><tr><td>Kit de quantificação</td><td>de biblioteca Roche</td><td>Fornecido pela plataforma de sequenciamento MGX</td><td>Biblioteca KAPA Kits de Quanitificação</td></tr><tr><td>Micropipetas 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291704</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 20-200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291703</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 100-1000 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>7.648488</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio&nbsp;</td><td>Epredia</td><td>J1800BMNZ</td><td>dimensão: 75 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Terumo</td><td>AN*2719R1</td><td></td></tr><tr><td>Kit NGS&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Fornecido pela plataforma de sequenciamento MGX</td><td>Sistemas de Analisador de Fragmentos HS Genomic DNA 50kb Kit</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>Fornecido pela plataforma de sequenciamento MGX</td><td>Sequenciador</td></tr><tr><td>PBS Phosphate Buffered Saline (Estéril)</td> <td>Fisher scientific</td><td>10212990</td><td></td></tr><tr><td>Marcador</td><td></td><td></td><td></td>preto permanente</tr><tr><td>Estéril Eppendorf&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>33871</td><td>Suporte de 1,5 mL</td></tr><tr><td>para agulhas</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>26016-12</td><td>Suporte de pino Moria MC1 12 cm</td></tr></tbody></table>

dissecção de ovários, intestino médio e glândulas salivares de mosquitos para análises de microbioma no nível do órgão

Dissection of Mosquito Ovaries, Midgut, and Salivary Glands for Microbiome Analyses at the Organ Level

x'Dissecações de mosquito Seguindo o protocolo, coletamos e isolamos os ovários, intestino médio, glândulas salivares e a carcaça de dois espécimes de Culex pipiens molestus (incluindo uma fêmea grávida) de uma colônia de laboratório. Confirmamos dissecções limpas após a observação de órgãos inteiros (ou seja, intactos) e bem isolados, sem detritos remanescentes sob o binóculo. Todo o corpo, cabeça e tórax, glândulas salivares dissecadas, ovários e intestino médio de um espécime de Culex pipiens molestus são mostrados na Figura 2. Como esperado, o intestino médio e as glândulas salivares eram uma ordem de magnitude menor do que os ovários do mosquito. Os ovos de um espécime de Culex grávida, juntamente com seus túbulos do intestino médio e de Malpighi, são apresentados na Figura 3. É importante notar que as dissecções são mais propensas a falhar quando o material não é fresco e o tecido provavelmente se romperá (Figura 4B, C). Portanto, sugerimos dissecar o material logo após a coleta (em menos de 12 h), quando possível, pois os tecidos ainda são elásticos (Figura 4A). Da mesma forma, a dissecção de material congelado pode ser realizada, mas há um risco muito maior de falha e contaminação cruzada entre órgãos devido a tecidos frágeis (Figura 4).
Dados do microbioma Além disso, coletamos e separamos o intestino médio e os ovários de três espécimes individuais de Culex quinquefasciatus de Noumea, Nova Caledônia, seguindo o mesmo procedimento. Extraímos DNA de cada órgão, preparamos amostras para sequenciamento do genoma completo e realizamos análises de dados de microbioma conforme detalhado no Arquivo Suplementar 1. Uma análise de diversidade taxonômica bacteriana em leituras curtas filtradas por qualidade não montadas usando PhyloFlash12 mostrou táxons dominantes distintos no intestino médio em comparação com os ovários (Figura 5A). Notavelmente, as comunidades bacterianas ovarianas foram dominadas por Wolbachia, com a presença adicional de um filotipo de Spirochaetaceae nos ovários do indivíduo 3, enquanto as comunidades do intestino médio exibiram uma diversidade mais ampla, incluindo Gammaproteobacteria, Spirochaetaceae e Firmicutes. A partir dos mesmos dados de sequenciamento, reconstruímos quatro genomas montados no metagenoma (MAGs) com &gt; de completação de 80% e redundância &lt; 5%, pertencentes às classes Spirochaetia, Alpha- e Gammaproteobacteria (Tabela 1).
Como esperado, os MAGs reconstruídos aqui não cobriram toda a diversidade taxonômica prevista pelos resultados do PhyloFlash devido às deficiências específicas da reconstrução do genoma usando leituras curtas metagenômicas. O MAG atribuído a Wolbachia (Ref. MAG 3 na Tabela 1) foi detectado em todos os ovários e dois dos intestinos médios e teve maior cobertura nos ovários (Figura 5B). Também reconstruímos dois MAGs pertencentes à família Enterobacteriaceae , incluindo o gênero Pantoea (Ref. MAG 1 e 2 na Tabela 1), no intestino médio obtido dos indivíduos 2 e 3 de Culex , que não foram detectados nos ovários correspondentes (Figura 5B). Finalmente, também reconstruímos um genoma bacteriano de Spirochaetaceae , Ref. MAG 4 (Tabela 1), atribuído ao gênero BR149 que foi isolado com sucesso do intestino médio de Culex pipiens por Graña-Miraglia e colegas13. Curiosamente, esse MAG foi detectado no intestino médio dos indivíduos 1 e 3, bem como nos ovários do indivíduo 3 (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema do método resumindo as diferentes etapas. Preparação de material, coleta de mosquitos, limpeza de mosquitos, dissecações de mosquitos e armazenamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig02.jpg"> Figura 2: Culex pipiens molestus fêmea. (A) Corpo inteiro. (B) Cabeça e tórax. (C) Glândulas salivares dissecadas. (D) Ovários dissecados. (E) Intestino dissecado com túbulos de Malpighi. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig03.jpg"> Figura 3: Abdômen dissecado de uma fêmea grávida de Culex pipiens molestus . O intestino anterior, o intestino médio, o intestino posterior, os túbulos de Malpighi e os ovos da amostra são mostrados. Traços vermelhos indicam onde cortar para separar o intestino médio do intestino anterior e do intestino posterior. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: F = intestino anterior; M = intestino médio; H = intestino grosso; E = ovos; MT = túbulos de Malpighi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig04.jpg"> Figura 4: Dissecção de espécimes de mosquitos Culex frescos e congelados. Retângulos brancos ilustram (A) tecidos de mosquitos com órgãos intactos de uma amostra recém-dissecada e (B, C) material biológico quebrado de amostras que foram congeladas antes da dissecação. Barras de escala = 720 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig05.jpg"> Figura 5: Exemplo de análise de microbioma em três indivíduos de Culex quinquefasciatus . (A) Visualização da diversidade bacteriana estimada através da extração de SSU rRNA lê com PhyloFlash12 no intestino médio e ovários dos três espécimes. (B) Cobertura média dos MAGs reconstruídos sobre as amostras. Abreviaturas: MAG = Genoma Montado no Metagenoma; Ind = Individual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>MAG</td>
			<td>Ref. MAG 4</td>
			<td>Ref. MAG 2</td>
			<td>Ref. MAG 1</td>
			<td>Ref. MAG 3</td>
		</tr><tr><td>Comprimento (bp)</td>
			<td>1,287,790</td>
			<td>4,910,866</td>
			<td>4,751,276</td>
			<td>1,298,266</td>
		</tr><tr><td>Número de contigs</td>
			<td>9</td>
			<td>162</td>
			<td>149</td>
			<td>123</td>
		</tr><tr><td>GC %</td>
			<td>34.05</td>
			<td>55.45</td>
			<td>54.05</td>
			<td>34.15</td>
		</tr><tr><td>Conclusão (%)</td>
			<td>84.5</td>
			<td>97.18</td>
			<td>98.59</td>
			<td>91.55</td>
		</tr><tr><td>Redundância (%)</td>
			<td>0</td>
			<td>2.82</td>
			<td>4.22</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Domínio</td>
			<td>Bactéria</td>
			<td>Bactéria</td>
			<td>Bactéria</td>
			<td>Bactéria</td>
		</tr><tr><td>Filo</td>
			<td>Spirochaetota</td>
			<td>Proteobactérias</td>
			<td>Proteobactérias</td>
			<td>Proteobactérias</td>
		</tr><tr><td>Classe</td>
			<td>Spirochaetia</td>
			<td>Gamaproteobactérias</td>
			<td>Gamaproteobactérias</td>
			<td>Alfaproteobactérias</td>
		</tr><tr><td>Ordem</td>
			<td>WRBN01</td>
			<td>Enterobacterales</td>
			<td>Enterobacterales</td>
			<td>Rickettsiales</td>
		</tr><tr><td>Família</td>
			<td>WRBN01</td>
			<td>Enterobacteriaceae</td>
			<td>Enterobacteriaceae</td>
			<td>Anaplasmataceae</td>
		</tr><tr><td>Gênero</td>
			<td>BR149</td>
			<td>Pantoea</td>
			<td>-</td>
			<td>Wolbachia</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: MAGs reconstruídos a partir dos três indivíduos de Culex quinquefasciatus . Tamanho do genoma, número de contigs, proporção de GC, estimativas de conclusão e redundância com base na coleção de genes de núcleo de cópia única disponível em Anvi'o17 e taxonomia obtida usando GTDB18.
Arquivo Suplementar 1: Exemplo detalhado de procedimento para análise de dados de microbioma a partir da coleta de amostras, extração de DNA e sequenciamento do genoma completo, seguido pelo fluxo de trabalho de bioinformática para reconstrução do genoma e estimativa da proporção de leitura procariótica e eucariótica <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67128_SupplementaryMaterial_15.07.2024_JR_fin.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Dissecção de ovários, intestino médio e glândulas salivares de mosquitos para análises de microbioma no nível do órgão

The global burden of mosquito-transmitted diseases, including malaria, dengue, West Nile, Zika, Usutu, and yellow fever, continues to increase, posing a ...

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Research

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Biology

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Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

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