Técnica de natação horizontal em forma de U para preparar espermatozóides de alta qualidade com baixo índice de fragmentação de DNA

[Narrador] A pesquisa se concentra em um método para otimização de espermatozoides, com o objetivo de determinar se a técnica UHS oferece vantagens na preparação de espermatozoides de alta qualidade com baixo Índice de Fragmentação de DNA. A tecnologia microfluídica tem sido utilizada para otimizar a seleção de espermatozoides de alta qualidade com DFI mais baixo. A principal limitação do método UHS é sua alta dependência da capacidade de autonatação de espermatozoides de alta qualidade. O método UHS não é adequado para pacientes com espermatozóides completamente imóveis. A tigmotaxia desempenha um papel crucial na separação de espermatozoides. A órbita em forma de U tem um limite mais longo, o que facilita a livre circulação de espermatozoides de alta qualidade, permitindo sua separação completa de espermatozoides imóveis, impurezas e outros componentes. Comparado com a técnica DGC, o método de pista UHS envolve menos etapas de operação manual para o pessoal do laboratório, e os espermatozoides de alta qualidade obtidos através do método de pista UHS não passam por procedimentos de centrifugação repetidos, resultando em um DFI mais baixo. Para começar, adicione 20 microlitros de meio de fertilização ao prato de operação para criar faixas em forma de U. Sugue 10 microlitros de meio de fertilização com uma pipeta para criar uma gota circular no ponto inicial esquerdo da pista em forma de U. Usando meio de fertilização, crie duas gotículas tampão de 10 microlitros cada em intervalos ao longo da seção intermediária esquerda da trilha em forma de U. Conecte todas as gotículas com meio de fertilização para formar uma trilha contínua. Use 2,5 microlitros de polivinilpirrolidona, ou PVP, para criar uma longa faixa de gotícula de líquido no lado direito da pista em forma de U. Faça seis microgotículas usando o meio de processamento de oócitos no lado direito da tira de PVP. Adicione sete mililitros de óleo de cultura ao prato, garantindo que o óleo cubra completamente o ponto mais alto das gotículas. Coloque o prato em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 6% durante a noite para equilibrar. Após a coleta do sêmen, meça seu volume usando o método de pesagem, garantindo precisão de 0,01 mililitros. Coloque a amostra de sêmen em um ambiente de 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos e aspire-a em uma pipeta descartável de plástico de calibre largo. Se o sêmen não se liquefazer em 60 minutos, adicione uma quantidade igual de meio de fertilização. Inspire e expire repetidamente a mistura usando uma pipeta de transferência de plástico descartável até que ela se liquefaça completamente. Meça o valor do pH do sêmen usando papel de teste de pH de precisão com um intervalo de seis a 10. Pegue 10 microlitros de sêmen totalmente liquefeito e pingue-o em uma câmara de contagem macular. Avalie a motilidade dos espermatozoides em um campo de 200X usando um microscópio óptico. Adicione cinco microlitros de sêmen à microgota do meio de fertilização no ponto inicial esquerdo da pista em forma de U na placa de operação ICSI. Ajuste o ângulo e a posição da agulha de retenção de oócitos e da agulha de injeção sob a lente objetiva 4X. Depois de verificar a configuração, transfira o oócito selecionado para a microgota do meio de processamento de oócitos na placa de operação ICSI. Coloque o prato de operação contendo os oócitos no estágio quente do operador de microscópio preparado. Depois de ajustar o foco, abaixe a agulha de injeção na tira PVP do prato de operação ICSI. Mova a agulha de injeção para a tira longa no lado direito da pista em forma de U e extraia espermatozóides de alta qualidade. Transfira o esperma para a tira de PVP no lado direito e coloque o esperma no fundo do prato de operação. Pressione suavemente a agulha de injeção na seção média ou inferior da cauda do esperma. Puxe rapidamente a agulha de injeção para trás e coce o esperma para imobilizá-lo. Agora, inale o esperma da cauda até a cabeça na agulha de injeção. Injete lentamente espermatozóides no citoplasma do oócito e incube o oócito injetado. Adicione 1,5 mililitros de solução de centrifugação de gradiente de densidade de 45% a um tubo de ensaio de fundo cônico estéril de 15 mililitros. E adicione lentamente 1,5 mililitros de solução de centrifugação de gradiente de densidade de 90% ao fundo da solução de gradiente de 45%. Agora, adicione o sêmen liquefeito à solução de centrifugação gradiente e gire o tubo a 300 G por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante, colete aproximadamente 0,5 mililitros do sedimento de esperma restante e misture-o com três mililitros de meio de fertilização. Centrifugue a mistura a 200 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Pipete cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 0,2 mililitros de sedimento, depois agite e misture para ressuspender o sedimento. Por fim, conte a concentração e a motilidade dos espermatozoides antes de armazenar a amostra em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 6% para uso posterior. Coloque um tubo contendo 25 microlitros de solução de agarose de baixo ponto de fusão em um banho-maria de 90 a 100 graus Celsius por um a dois minutos. Em seguida, transfira o tubo para um banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos até que a temperatura se estabilize. Adicione três a 10 microlitros de sêmen a tubos de agarose de baixo ponto de fusão e misture bem. Coloque 30 microlitros da mistura em uma lâmina de vidro pré-tratada na posição horizontal. Após a cobertura, coloque a lâmina de vidro pré-tratada na geladeira a dois a oito graus Celsius por quatro minutos, garantindo que permaneça na posição horizontal. Remova a corrediça da geladeira e deslize suavemente para fora da tampa de vidro. Mergulhe rapidamente a lâmina de vidro pré-tratada em solução desnaturante por sete minutos. Remova o slide e coloque-o na posição vertical. Em seguida, use papel de filtro para absorver o excesso de gotículas de água sem tocar na área da amostra. Lave a lâmina em água destilada por cinco segundos. Mergulhe a lâmina de vidro em série nas soluções apropriadas para o período específico. Em seguida, mantendo a lâmina de vidro pré-tratada na horizontal, adicione cerca de um mililitro da solução de corante misturado na lâmina. Após a coloração por cinco minutos, enxágue suavemente a lâmina de vitral com água destilada 10 a 15 vezes. Espermatozoides de alta qualidade com boa motilidade progressiva nadaram suavemente ao longo da borda da pista em forma de U, tornando mais fácil para a agulha de injeção intracitoplasmática de espermatozóides agarrá-los individualmente. Embora bons espermatozóides tenham sido obtidos usando ambos os métodos, o Índice de Fragmentação de DNA de espermatozóides de alta qualidade separados usando o método de centrifugação de gradiente de densidade foi significativamente maior em comparação com o método de natação horizontal em forma de U.