Name: Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intratecal lombar para terapia gênica em camundongos e ratos. Este método padronizado permite a distribuição eficiente de vetores no sistema nervoso central para pesquisa preclínica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. Camundongos machos e fêmeas C57BL6/J do tipo selvagem, com idade P1-P28, foram usados para protocolos envolvendo camundongos. Ratos selvagens da raça Sprague-Dawley, machos e fêmeas, com idade P1-P56, foram utilizados para protocolos envolvendo ratos. Além da cirurgia de sobrevivência descrita na seção 3, todos os outros procedimentos são considerados como causadores apenas de desconforto momentâneo e não requerem o uso de anestésicos ou analgésicos. Os indivíduos devem monitorar os animais de laboratório quanto a mais do que desconforto momentâneo e buscar orientação de sua equipe IACUC e veterinária sobre a necessidade de anestésicos e analgésicos. Detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Injeção lombar de TI de camundongos &gt;P21
<ol>
	<li>Preparação<ol>
		<li>Preparar as soluções injetáveis, incluindo o vector de terapia génica na(s) concentração(ões) desejada(s) e uma solução de controlo (normalmente o tampão de formulação utilizado na produção do vector). As soluções injetáveis devem ser estéreis e permanecer estéreis durante todo o procedimento. NOTA: Todas as soluções devem ser mantidas em gelo durante o procedimento.</li>
		<li>Reúna e higienize todos os materiais, incluindo seringa e agulha, pipeta e solução injetável. Siga as diretrizes institucionais quanto ao uso de cabines de biossegurança e exposição a injetantes. Os procedimentos aqui descritos foram realizados em uma cabine de biossegurança classe 2.</li>
		<li>Usando uma pipeta de microlitro, meça o volume desejado de solução de injeção e transfira-o para um filme de parafina estéril. Um volume de injeção de 5 μL é comumente usado e é tratado como o volume alvo para camundongos adultos &gt;P21 (Tabela 1). NOTA: O volume pode ser aumentado se necessário; no entanto, os animais devem ser monitorizados de perto quanto a reações adversas a volumes de injeção maiores. Consulte a seção Discussão para obter detalhes sobre o volume de injeção e reações adversas. A solução também pode ser transferida diretamente da ponta da pipeta para uma seringa, ou seringas calibradas de microlitros à prova de gás podem ser usadas para medir diretamente o volume da solução de injeção.</li>
		<li>Aspire a solução para uma seringa de microlitros com uma agulha de 30 G 0,5", com cuidado para não formar bolhas de ar. NOTA: O calibre e o comprimento da agulha podem afetar a penetração na pele. Ao considerar o tamanho da seringa a ser usada, o volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa. Para volumes superiores a 50% da capacidade da seringa, certifique-se de que o êmbolo possa ser facilmente pressionado com o dedo indicador. Se o êmbolo não puder ser pressionado facilmente, use uma seringa de maior capacidade.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Restrição<ol>
		<li>Usando a mão dominante, segure o rato consciente (não anestesiado) pela cauda em uma toalha de papel. A toalha de papel ajudará a conter, acalmar e evitar que o rato morda. O mouse deve estar na posição neutra de bruços com o aspecto lateral do corpo voltado para você. NOTA: Não é necessário treinar ou habituar camundongos a esta contenção antes do procedimento. Os camundongos podem ter dificuldades devido à contenção, mas não devem provocar uma resposta específica à dor. Se forem observadas respostas mais do que momentâneas à dor, pode ser necessária a administração de analgésicos; procure orientação veterinária.</li>
		<li>Com a mão não dominante, dobre uma parte da toalha de papel sobre a cabeça e a parte superior do corpo do mouse e segure firmemente a cintura pélvica entre o polegar não dominante e o dedo indicador. Certifique-se de que a palma da mão esteja em forma de concha, apoiada ao redor da cabeça do mouse. A crista ilíaca do camundongo deve ser palpável e posicionada no centro da falange distal de cada dedo (Figura 1A, B). NOTA: A contenção da mão ou da toalha de papel não deve prejudicar a respiração.</li>
		<li>Gire suavemente a base da cauda para garantir o alinhamento adequado da coluna. A pelve do camundongo deve ser quadrada, de modo que os processos vertebrais da coluna lombar sejam perpendiculares à superfície de trabalho.</li>
		<li>Limpe a região lombar dorsal do camundongo com uma almofada de preparação com álcool a 70%.</li>
		<li>Separe o cabelo ~ 2-6 mm cranial à crista ilíaca para ajudar a visualizar o local da injeção.</li>
		<li>Sinta o espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6, ~ 2-6 mm cranial à crista ilíaca. NOTA: A distância exata é variável dependendo do tamanho e da idade do mouse.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injecção<ol>
		<li>Usando a mão dominante, segure o centro da seringa de microlitro e posicione-a perpendicularmente à coluna vertebral do camundongo no espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6. Certifique-se de que o êmbolo da seringa pode ser pressionado com o dedo indicador sem movimento excessivo da mão. Com o chanfro da agulha voltado para a cabeça do camundongo, perfure a pele sobre o espaço intervertebral.</li>
		<li>Quando as bordas do osso ao redor do espaço intervertebral forem sentidas na ponta da agulha, reduza o ângulo da seringa para 30-45 graus (Figura 1A).</li>
		<li>A agulha deve deslizar para o espaço intervertebral, causando um movimento repentino da cauda, e deve ser firmemente presa entre as vértebras.</li>
		<li>Tomando cuidado para não deslocar a seringa, pressione o êmbolo firmemente para fornecer a solução em 10 s.</li>
		<li>Segure a seringa no lugar por 15-30 s depois de pressionar totalmente o êmbolo para permitir a dissipação da solução e evitar o refluxo.</li>
		<li>Retire suave e lentamente a seringa do mouse no mesmo ângulo de entrada de 30 a 45 graus. À medida que a agulha é retirada, gire a seringa para evitar o refluxo. NOTA: Tenha cuidado para não avançar a agulha ao girar a seringa, pois isso pode causar danos físicos à medula espinhal.</li>
		<li>Solte o mouse da restrição e devolva-o à gaiola inicial.</li>
		<li>Monitore o mouse após a injeção quanto a deambulação anormal, comprometimento motor, anormalidades respiratórias e coordenação. Consulte a Discussão para obter detalhes adicionais sobre reações adversas.</li>
		<li>Limpe o equipamento seguindo as recomendações do fabricante. Para injeções múltiplas, são recomendadas seringas diferentes para cada vetor de terapia gênica e solução de controle. NOTA: As agulhas removíveis podem ser limpas, esterilizadas e reutilizadas várias vezes; no entanto, agulhas cegas não devem ser usadas, pois podem prejudicar o animal e aumentar a probabilidade de injeções perdidas. Uma agulha cega não perfura a pele facilmente e deve ser descartada adequadamente. Se as seringas forem limitadas, é aconselhável completar todas as injeções de veículo antes de prosseguir para o vetor de terapia gênica e injetar a dose mais baixa de terapia gênica antes de administrar doses mais altas.</li>
		<li>Siga as diretrizes institucionais para esterilização de equipamentos entre animais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema da colocação do dedo e da seringa para injeção intratecal lombar em camundongos e ratos. (A) Vista lateral de um camundongo &gt;P21 mostrando a colocação da agulha e a transição do ângulo da seringa durante uma injeção lombar de IT. O oval vermelho tracejado indica o posicionamento do dedo sobre a crista ilíaca do camundongo. Uma visão ampliada da coluna vertebral mostra o espaço intratecal (azul) com posicionamento aproximado da agulha (seta verde) e a medula espinhal (rosa). Vista dorsal de (B) um camundongo &gt;P21, (C) um camundongo <p10 e>D) um rato &gt;P21, com pontos de referência para colocação de agulha (círculo verde), cintura pélvica (oval amarelo tracejado) e colocação de dedos (oval vermelho tracejado). O local da incisão e os afastadores também estão representados em (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a></p10>
2. Injeção lombar de TI de camundongos e ratos <p10></p10>
<ol>
	<li>Preparação<ol>
		<li>Siga o passo 1.1. A única exceção é o volume de injeção na etapa 1.1.3. NOTA: Os volumes de injeção recomendados para camundongos neonatais (P0-P1) não devem exceder 3 μL, para camundongos juvenis (P5-P7) não devem exceder 5 μL e para camundongos juvenis (P10) não devem exceder 10 μL. Os volumes de injeção recomendados para ratos neonatais (P0-P1) não devem exceder 5 μL, para ratos juvenis (P5-P7) não devem exceder 10 μL e para ratos juvenis (P10) não devem exceder 30 μL (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Restrição<ol>
		<li>Usando a mão dominante, segure o camundongo/rato pela cauda em uma toalha de papel. O camundongo / rato deve estar na posição neutra de bruços com o aspecto lateral do corpo voltado para você. NOTA: Camundongos / ratos podem ter dificuldades devido à contenção, mas não devem provocar uma resposta específica à dor. Se forem observadas respostas mais do que momentâneas à dor, pode ser necessária a administração de analgésicos; procure orientação veterinária.</li>
		<li>Segure suavemente, mas com firmeza, a cintura pélvica entre o polegar não dominante e o dedo indicador. A crista ilíaca deve ser palpável e posicionada no centro da falange distal de cada dedo (Figura 1C). NOTA: Nessa idade, não há preocupação em ser mordido, portanto, não é necessário enrolar a toalha de papel sobre o camundongo / rato. Pode ser necessário usar uma toalha de papel em ratos P5-10 para manter os filhotes de ratos maiores parados.</li>
		<li>Gire suavemente a base da cauda para garantir o alinhamento adequado da coluna. A pelve do camundongo / rato deve ser quadrada para que os processos vertebrais da coluna lombar fiquem perpendiculares à superfície de trabalho.</li>
		<li>Limpe a região lombar dorsal do camundongo / rato com uma almofada de preparação com álcool a 70%.</li>
		<li>Separe o cabelo, se aplicável, ~ 1-3 mm cranial à crista ilíaca para ajudar a visualizar o local da injeção. A visualização da área-alvo é mais fácil em camundongos/ratos mais jovens. Em neonatos sem pelos, um recuo pode ser visto no espaço intervertebral.</li>
		<li>Sinta ou visualize o espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6, ~ 1-3 mm cranial à crista ilíaca. NOTA: A distância exata é variável dependendo do tamanho e da idade do camundongo/rato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injecção<ol>
		<li>Usando a mão dominante, segure o centro da seringa de microlitro e posicione-a em um ângulo de 30 a 45 graus em relação à coluna vertebral do camundongo/rato. Com o bisel da agulha voltado para a cabeça do camundongo/rato, perfure a pele aproximadamente 1-3 mm para o espaço intervertebral. Devido à orientação angular da seringa, o ponto de inserção na pele é ligeiramente caudal ao espaço intervertebral. NOTA: Esta distância pode mudar com a idade e o tamanho do camundongo/rato.</li>
		<li>O restante das etapas é idêntico às etapas 1.3.3-1.3.10 de camundongos &gt;P21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Injeção lombar de TI de ratos &gt;P21
NOTA: Existem vários procedimentos de injeção de IT descritos na literatura, variando de técnicas não anestesiadas a abordagens cirúrgicas mais extensas14,15. Um procedimento para injeção direta usando uma técnica minimamente invasiva é descrito usando anestesia leve e uma pequena incisão na pele. O uso de anestesia, como o gás isoflurano, pode ajudar na contenção, relaxar a musculatura e impedir o movimento durante a injeção. Fazer uma pequena incisão na pele sobre o local da injeção melhora a precisão da injeção, permitindo a visualização do espaço intervertebral e eliminando a necessidade de perfurar a pele grossa. Devido à incisão, é necessário o uso de anestésicos e analgésicos. Com a prática, é possível realizar injeções lombares de TI em ratos maiores que P21 sem anestesia ou incisão, a critério do usuário e dependendo das exigências institucionais15. Siga as diretrizes e considerações institucionais sobre anestesia, analgésicos apropriados e cirurgia de sobrevivência para animais de laboratório.
<ol>
	<li>Preparação<ol>
		<li>Siga o passo 1.1. As únicas exceções são o volume de injeção na etapa 1.1.3 e o tamanho da agulha na etapa 1.1.4. Os volumes de injeção para ratos podem variar muito de acordo com a idade e o tamanho do corpo. Consulte a seção Discussão para obter mais informações sobre o volume de injeção em diferentes idades (Tabela 1). NOTA: Uma agulha de 27 G x 1" é recomendada para ratos adultos, pois agulhas de calibre menor podem dobrar e agulhas mais curtas podem não penetrar adequadamente no espaço intratecal. Uma agulha mais longa (1,25-1,5") pode ser usada, se desejado.</li>
		<li>Anestesiar o rato usando o anestésico preferido e aprovado (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente). NOTA: Para os procedimentos aqui descritos, os ratos foram anestesiados com isoflurano e uma mistura 1:1 de lidocaína: a bupivacaína foi usada como anestésico local. A temperatura corporal deve ser mantida usando uma fonte de calor externa aprovada durante todo o procedimento e recuperação.</li>
		<li>Siga a preparação asséptica padrão do local cirúrgico para cada animal. Resumidamente, raspe a região lombar dorsal e prepare a pele com uma esfoliação cirúrgica, betadina e álcool isopropílico 70%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedimento cirúrgico<ol>
		<li>Coloque o rato na posição neutra de bruços com o aspecto lateral do corpo voltado para você.</li>
		<li>Palpe a cintura pélvica, identificando a crista ilíaca e a junção lombossacral. Em ratos &gt;P21, os processos vertebrais podem ser facilmente identificados.</li>
		<li>Usando um bisturi, faça uma incisão de 1 cm sobre o espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6. A incisão deve envolver apenas a pele e a fáscia subjacente, deixando o músculo intacto. NOTA: É útil usar afastadores para manter a pele aberta durante o restante do procedimento.</li>
		<li>Segure suavemente, mas com firmeza, a cintura pélvica entre o polegar não dominante e o dedo indicador. A crista ilíaca deve ser palpável e posicionada no centro da falange distal de cada dedo (Figura 1D). Use uma pinça de mosquito para sondar ao longo da linha média das costas para localizar o espaço intervertebral.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injecção<ol>
		<li>Usando a mão dominante, segure o centro da seringa de microlitro e posicione-a perpendicularmente à coluna vertebral do rato no espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6. Certifique-se de que o êmbolo da seringa pode ser pressionado com o dedo indicador sem movimento excessivo da mão. Com o bisel da agulha voltado para a cabeça do rato, perfure o músculo com a agulha sobre o espaço intervertebral.</li>
		<li>Avance a agulha para o espaço intervertebral. NOTA: A agulha pode ter uma ligeira resistência ao passar entre os processos vertebrais, e o ângulo da seringa pode precisar ser ligeiramente ajustado para passar por esse espaço. No entanto, deve permanecer aproximadamente 90 graus, perpendicular à coluna. Um estalo será sentido quando a agulha entrar no espaço intratecal. Dependendo dos parâmetros anestésicos, um movimento da cauda ou da perna pode ou não ser perceptível. A agulha deve ser firmemente presa entre as vértebras.</li>
		<li>Com cuidado para não mover a seringa para fora da posição, pressione o êmbolo para fornecer a solução em 30 s. NOTA: Ao contrário das injeções em camundongos, pode não ser possível reduzir o ângulo da seringa em ratos &gt;P21 usando este método. Volumes maiores devem ser injetados a uma taxa mais lenta para evitar o acúmulo excessivo de pressão.</li>
		<li>Segure a seringa no lugar por 30-60 s depois de pressionar totalmente o êmbolo para permitir a dissipação da solução e evitar o refluxo.</li>
		<li>Retire suavemente a seringa do rato. À medida que a agulha é retirada, gire a seringa para evitar o refluxo. NOTA: Tenha cuidado para não avançar a agulha ao girar a seringa, pois isso pode causar danos físicos à medula espinhal.</li>
		<li>Feche a incisão na pele usando um método aprovado, como sutura ou clipes de ferida. Para os ratos utilizados neste protocolo, a pele foi fechada em padrão intradérmico contínuo ou simples interrompido com sutura 5-0 PDS II.</li>
		<li>Recupere o rato da anestesia.</li>
		<li>Siga as etapas 1.3.9-1.3.10 e todas as diretrizes de cuidados pós-operatórios.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects.</a> Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-based+in+vivo+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).</li>
<li>Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+and+considerations+for+AAV+gene+therapies+targeting+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurodev+Disord%22%5BJournal%5D)">Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system.</a> J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-based+gene+therapy+for+CNS+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+adeno-associated+virus+gene+therapy+following+cerebrospinal+fluid-directed+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration.</a> Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).</li>
<li>Corning, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+anesthesia+and+local+medication+of+the+cord%5BTitle%5D)+AND+%22NY+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Spinal anesthesia and local medication of the cord.</a> NY Med. J. , 483-485 (1885).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+A+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: A new technique.</a> Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Choi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound-guided+intrathecal+injections+in+a+young+mouse+model%3A+Targeting+the+central+nervous+system+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery.</a> J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).</li>
<li>Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intrathecal+injection+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice.</a> J Vis Exp. 144, e58565(2019).</li>
<li>Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+SiRNA+transfection+and+gene+knockdown+in+spinal+cord+via+rapid+noninvasive+lumbar+intrathecal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice.</a> J Vis Exp. 85, e51229(2014).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).</li>
<li>Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+perform+direct+transcutaneous+intrathecal+injection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).</li>
<li>Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+vector+delivery+in+juvenile+rats+via+lumbar+cistern+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection.</a> J Vis Exp. 205, e66463(2024).</li>
<li>Lu, X., Jiang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+injection+of+newborn+mouse+for+genome+editing+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery.</a> J Vis Exp. 205, e65761(2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+AAV9%2FAP4M1+gene+therapy+for+hereditary+spastic+paraplegia+50+shows+safety+and+efficacy+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies.</a> J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).</li>
<li>Deschenes, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+correction+of+GM2+ganglioside+accumulation+in+AB-variant+GM2+gangliosidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).</li>
<li>Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcription+factors+Ascl1+and+Lhx6+attenuate+diabetic+neuropathic+pain+by+modulating+spinal+neuroinflammation+and+microglial+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.</a> Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).</li>
<li>Kagiava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+therapy+in+two+Golgi-retained+CMT1X+mutants+before+and+after+the+onset+of+demyelinating+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).</li>
<li>Wong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-dominant+human+FMRP+isoform+rescues+seizures%2C+fear%2C+and+sleep+abnormalities+in+Fmr1-KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice.</a> JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+neurocognitive+deficiency+in+mucopolysaccharidosis+type+ii+mice+by+central+nervous+system-directed%2C+AAV9-mediated+iduronate+sulfatase+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).</li>
<li>Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+selectively+blocks+a+spinal+action+of+N-methyl-D-aspartate+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice.</a> Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).</li>
<li>Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrathecal+AAV9+Gene+therapy+for+giant+axonal+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).</li>
<li>Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+high-dose+intracisterna+magna+and+lumbar+puncture+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+mice+to+treat+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies.</a> Brain Res. 1739, 146832(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%2FMFSD8+gene+therapy+is+effective+in+preclinical+models+of+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+type+7+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease.</a> J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).</li>
<li>Karumuthil-Melethil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+administration+of+AAV%2FGALC+vectors+in+10-11-day-old+twitcher+mice+improves+survival+and+is+enhanced+by+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant.</a> J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).</li>
<li>Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vector+serotype+9-based+gene+replacement+therapy+for+SURF1-related+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).</li>
<li>Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microRNA-based+regulatory+element+permits+safe+high-dose+miniMECP2+gene+therapy+in+Rett+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice.</a> Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).</li>
<li>Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+and+Intrathecal+Drug+Delivery+in+Rats+and+Mice+for+Experimental+Research%3A+Fundamental+Concepts%2C+Techniques%2C+Precaution%2C+and+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application.</a> Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).</li>
<li>Allen, C. H., Ward, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence-based+approach+to+management+of+increased+intracranial+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure.</a> Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).</li>
<li>Belov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+intrathecal+administrations%3A+Impact+on+CSF+pressure+and+safety+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications.</a> Front Neurosci. 15, 604197(2021).</li>
<li>Moazen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+pressure+changes+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Intracranial pressure changes during mouse development.</a> J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).</li>
<li>Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+distribution+of+drugs+after+lumbar+injection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection.</a> N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF%2C+blood-brain+barrier%2C+and+brain+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).</li>
<li>Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+cerebrospinal+fluid+circulatory+system+of+the+developing+rat%3A+quantitative+volumetric+analysis+and+effect+on+blood-CSF+permeability+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).</li>
</ol>

A injeção lombar de IT é um procedimento rápido e minimamente invasivo que fornece de forma confiável um vetor de terapia gênica no LCR para o tratamento de doenças do SNC 5,6. O procedimento é translacionalmente relevante, e o protocolo descrito aqui detalha como realizar essa via de administração em camundongos e ratos em todas as idades, de neonatos a adultos. É importante definir este protocolo para camundongos e ratos de todas as idades, juntamente com o fornecimento de vídeos de apoio, para ajudar os investigadores na adoção deste método para administração de terapia gênica. A experiência do nosso laboratório é que este protocolo pode ser implementado de forma consistente em vários usuários e estudos ao longo do tempo 18,25,26,27,28,29,30.
Existem diferenças importantes ao realizar a injeção lombar de IT em camundongos/ratos mais jovens em comparação com camundongos/ratos mais velhos, principalmente o ângulo em que a agulha é inserida na coluna e o volume recomendado que é injetado. Os volumes de injeção lombar de IT relatados variam consideravelmente entre os estudos e entre as espécies31. A consideração do volume de injeção é importante para evitar elevações duradouras da pressão intracraniana (PIC), que podem comprometer o fluxo liquórico e o sangue cerebral, causar desconforto e levar a complicações neurológicas crônicas, incluindo hidrocefalia, isquemia, lesão celular e morte 32,33. A PIC é determinada pelo volume do LCR, do sangue cerebral e do tecido do SNC, que não podem ser diretamente correlacionados com o peso corporal. Em funcionamento normal, a PIC é autorregulada por muitos fatores, incluindo volume de LCR, volume de sangue cerebral, respiração, posição corporal, taxa de produção de LCR e taxa de drenagem de LCR para o sangue33,34. Os volumes de injeção de IT devem, portanto, ser determinados com base nas propriedades do LCR (Tabela 1) em vez do peso corporal 25,27,28,30. Os volumes recomendados para injetar em cada idade em cada espécie são indicados em negrito.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Volume de injeção de TI</td>
			<td colspan="4">Valores do LCR em adultos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P0-1 (μL)</td>
			<td>P5-7 (μL)</td>
			<td>P10 (μL)</td>
			<td>&gt;P21 (μL)</td>
			<td>Volume total (μL)</td>
			<td>Taxa de produção (μL / min)</td>
			<td>Volume de negócios (h)</td>
			<td>Pressão intracraniana (mm Hg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouses</td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>5-10</td>
			<td>5-20</td>
			<td>30-4025,30</td>
			<td>0,32-0,3525,30</td>
			<td>1.7-225,30</td>
			<td>5,0 +/- 0,528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratos</td>
			<td>5</td>
			<td>5-10</td>
			<td>10-30</td>
			<td>10-200 (20-75)</td>
			<td>15025</td>
			<td>1,7-2,825</td>
			<td>2-2,6625</td>
			<td>8,6 +/- 1,7,27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Resumo dos volumes de injeção lombar de IT para camundongos e ratos em diferentes idades. Valores em negrito são recomendados e foram entregues com segurança. Os volumes máximos possíveis não foram formalmente avaliados. Informações adicionais sobre os parâmetros conhecidos do LCR - volume total, taxa de produção, renovação e pressão intracraniana - em camundongos e ratos estão incluídas para referência.
Há uma falta de conhecimento em todo o campo sobre o limite superior para volumes de injeção única de TI em bolus. Em humanos adultos, ratos e camundongos onde o volume do LCR é conhecido, um aumento de 30% no volume total do LCR não parece causar lesões crônicas ou doenças 31,33,35,36. A falta de volumes conhecidos de LCR em camundongos juvenis ou neonatais torna impossível uma extrapolação semelhante. Alguns grupos estão começando a olhar para o volume e a produção de LCR em animais mais jovens37. Até que investigações adicionais nessas áreas sejam comprovadas, o volume de injeção continuará sujeito aos valores relatados pelo investigador.
Camundongos e ratos, especialmente quando tratados em idades mais jovens ou com altos volumes de injeção, podem provocar flexão dos músculos, extensão dos membros, respiração rápida ou paralisia temporária dos membros posteriores que devem se resolver em poucos minutos. Em casos extremos, as elevações agudas da PIC podem causar anormalidades cardiovasculares e respiratórias, que podem ser mortais32,33. Se alguma anormalidade pós-procedimento persistir após 24 horas, os camundongos/ratos devem ser removidos do estudo e sacrificados humanamente. A paralisia persistente dos membros posteriores pode ocorrer se a agulha for inserida muito longe, impactando a medula espinhal. Isso pode ser devido a um erro comum ao realizar a injeção lombar de IT: movimento da seringa após o movimento da cauda enquanto pressiona o êmbolo. O movimento da seringa e da agulha deve ser evitado. Se a posição correta não puder ser adquirida com a punção inicial, uma segunda tentativa no mesmo local pode ser feita. Se a segunda tentativa também não for bem-sucedida, tente alterar a posição da agulha para atingir o próximo espaço intervertebral. Observe que várias picadas de agulha podem levar ao vazamento de uma injeção subsequentemente bem-sucedida.
Tornar-se proficiente na injeção lombar de TI pode levar tempo. Para praticar as injeções como um procedimento terminal, siga o protocolo acima usando uma solução de corante aprovada, como azul de Evans ou corante verde McCormick filtrado a 0,2 mícrons (Figura 3) ou com os agentes farmacológicos abordados na seção Resultados Representativos. O uso de corante é recomendado para solucionar problemas e dominar a injeção, pois é fácil saber se uma injeção foi bem-sucedida ou fracassada em 1 minuto. A prática com corante é apenas para procedimentos de não sobrevivência, pois os animais podem desenvolver uma reação ao corante quando administrado diretamente ao SNC. Essa reação pode ocorrer dentro de um minuto após uma injeção bem-sucedida e é caracterizada por coceira rápida e movimentos de contorção. Os animais devem ser imediatamente sacrificados assim que essa reação for observada para minimizar o desconforto. Após uma injeção de corante de prática bem-sucedida, o corante permanecerá localizado na coluna vertebral (sem corante no tecido periférico próximo) e subirá pela coluna vertebral até o cerebelo, cérebro e bulbos olfatórios. Em P1, a pele é transparente o suficiente para que o corante possa ser visto descendo pela coluna vertebral na cauda. Se o corante não atingir o cérebro em alguns minutos, a injeção falha.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig03.jpg"> 
Figura 3: Corante verde McCormick no cérebro após injeções lombares de TI bem-sucedidas. Todos os cérebros são de camundongos P21 injetados com corante de 5 μL e são mostrados na visão ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para obter informações adicionais sobre parâmetros associados relevantes para o desenho de ensaios pré-clínicos, como título e doses virais, consulte as revisões publicadas anteriormente 3,6,31.

<table><tbody><tr><td>Filtro de 0,2 mícrons</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>67005</td><td>Usado para filtrar solução de corante</td></tr><tr><td>0,5 a 10 &micro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690026</td><td>Usado para medir solução de injeção</td></tr><tr><td>1,5 mL Microtubo</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Usado para armazenar soluções de injeção</td></tr><tr><td>10 &micro; L Seringa</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>O volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa</td></tr><tr><td>10 a 100 &micro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690029</td><td>Usada para medir a solução de injeção</td></tr><tr><td>10&micro; l Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11203810</td><td>Usado para medir a solução de injeção</td></tr><tr><td>100 &micro; L Seringa</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td>Apenas para ratos >21. O volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa</td></tr><tr><td>100 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11231840</td><td>Usado para medir solução de injeção</td></tr><tr><td>25 &micro; L Seringa</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>Ideal para 5-10 &micro; L. O volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa</td></tr><tr><td>Agulha(s) de 27 Gauge</td> <td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>Apenas para ratos >21. 27 gauge, Agulha RN de Cubo Pequeno, 1 pol, estilo de ponta 4 a 12&deg;, 6/PK</td></tr><tr><td>Agulha(s) de 30 Gauge</td> <td>Hamilton</td><td>7803-17</td><td>calibre 30, Agulha RN de Cubo Pequeno, 0.5 pol, estilo de ponta 4 a 12&deg;, 6/PK</td></tr><tr><td>50 &micro; L Seringa</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Apenas para ratos >21. O volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000140</td><td>Usado para higienizar o espaço de trabalho e o equipamento</td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool isopropílico 70%</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td>Usado para preparar o analgésico</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> no local da injeção <td>Apenas para ratos >21.</td></tr><tr><td>Anestésico (Isoflurano)</td> <td>Piramal Critical Care</td><td>66794001725</td><td>Apenas para ratos >21.</td></tr><tr><td>Produtos Betadine</td><td>Purdue</td><td>6906606</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para preparação da pele</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de <td>controle Solução de injeção</td></tr><tr><td>Solução de corante (verde)</td> <td>McCormick</td><td></td><td>Para prática, apenas não sobrevivência</td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>19-149-863B</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Balde de gelo com gelo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-395-150</td><td>Mantém a solução de vetor viral em gelo&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça de Mosquito (curvada ou reta)</td> <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>13009-12</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para palpar o espaço intervertebral.</td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para fechamento da pele com sutura</td></tr><tr><td>Toalha de papel</td><td>Berkshire</td><td>18-998-123</td><td>Usado para conter camundongos adultos durante a injeção</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>StatLab</td><td>PM996</td><td>Usado para aspirar a solução para a seringa</td></tr><tr><td>Retractors</td><td>Stoelting</td><td>52124P</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para guardar a incisão da pele aberta</td></tr><tr>Ferramentas <td>de Fine Science</td> da<td>Lâmina de Bisturi</td><td>10015-00</td><td>Para rato >21 apenas. Usado para incisão</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi Handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Para rato >21 apenas. Usado para incisão</td></tr><tr><td>Seringa Estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>Usado para filtrar solução de corante</td></tr><tr><td>Esfoliante Cirúrgico (Preparação da Pele)</td> <td>Medline Industries Inc.</td><td>MDS098720</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para preparação da pele</td></tr><tr><td>Sutura ou Clipes de Ferida</td><td>Stoelting</td><td>50483</td><td>Apenas para ratos >21. Usado para fechamento da pele.</td></tr><tr><td>Solução de Limpeza de Seringa / Agulha</td><td>Hamilton</td><td>18311</td><td>Pode usar solução de limpeza alternativa</td></tr><tr><td>Pinça de Polegar</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11019-12</td><td>Apenas para ratos >21. Usado durante toda a abordagem cirúrgica e fechamento</td></tr><tr><td>Solução vetorial</td><td></td><td></td><td>Solução injetável</td></tr></tbody></table>

injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Lumbar Intrathecal Injection of Gene Therapy Vectors for Central Nervous System Targeting in Mice and Rats

Embora muitos fatores possam influenciar a transdução do vetor da terapia gênica, a coloração histológica do tecido continua sendo o método mais preciso para determinar o sucesso das injeções intratecais lombares (IT). A distribuição ampla e uniforme do vetor de terapia gênica no sistema nervoso central (SNC) após a injeção é indicativa de um procedimento bem-sucedido. A Figura 2C representa uma injeção bem-sucedida de uma terapia gênica auto-complementar mediada por AAV9 conduzindo a expressão fraca de transgene onipresente sob o promotor JeT em uma dose de 1,3 × 1011 vg / camundongo em camundongos neonatais (P1), 4 meses após a injeção. A análise de RNAscope, usando uma sonda direcionada ao transgene fornecido pela terapia gênica, revela ampla distribuição na medula espinhal lombar, medula espinhal cervical e cérebro. Uma seção do fígado e do coração é incluída para destacar que, mesmo com a injeção direta de líquido cefalorraquidiano (LCR), o vetor de terapia gênica ainda pode ser distribuído para os tecidos periféricos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig02.jpg"> 
Figura 2: Seções de tecido coradas de 5 mícrons do SNC de camundongo e tecido periférico 4 meses após a injeção em P1. A coloração vermelha indica a expressão do transgene via RNAscópio, e a contracoloração azul dos núcleos é feita via hematoxilina. (A) Injeção com um tampão de formulação de controle. (B) Injeção intraparenquimatosa malsucedida com um vetor AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Injeção de TI lombar bem-sucedida com um vetor AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). O vetor de terapia gênica usado em (B) e (C) foi administrado em uma dose translacionalmente relevante de 1,3E11 vg / camundongo. Barra de escala: painel superior (5 mm); painel inferior (1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A expressão concentrada na medula espinhal lombar emparelhada com a falta de expressão no cérebro, conforme mostrado na Figura 2B, pode indicar uma injeção intraparenquimatosa da medula espinhal e deve ser considerada uma injeção malsucedida. Isso acontece quando a agulha é inserida muito longe na coluna vertebral, além do espaço intratecal e na medula espinhal. Além disso, a expressão muito baixa ou nenhuma expressão na medula espinhal e no cérebro (não mostrada) também deve ser considerada uma injeção fora do alvo com falha, supondo que um vetor e uma dose estejam sendo usados onde se espera uma ampla distribuição do SNC. Isso pode ser devido a não inserir a agulha longe o suficiente ou por ser lateral à linha média.
Os padrões de expressão observados em injeções bem-sucedidas podem diferir devido aos oito fatores a seguir, como exemplos: (1) idade na injeção, (2) imunidade pré-existente, (3) taxa de infusão, (4) vetor de terapia gênica, (5) dose de terapia gênica, (6) proteínas de superfície celular, (7) tropismo e (8) se aplicável, uma escolha de promotor apropriada para impulsionar a expressão do transgene6. Embora os padrões de expressão possam diferir, a distribuição ampla, uniforme e generalizada será universal, desde que a dose seja suficientemente alta com um vetor eficaz, como o AAV9.
As principais limitações do uso da análise histológica para confirmar o sucesso da injeção lombar de IT são os extensos tempos de espera - esperando até o final de um estudo, após a realização de necropsias e coleta de tecido - e extensos recursos necessários para processar tecido de todos os camundongos em um grande estudo de terapia genética. Infelizmente, nossa experiência tem sido que indicadores imediatos e diretos de uma injeção positiva ou negativa podem não ser confiáveis; no entanto, o reflexo de movimento da cauda quando a agulha entra no espaço intratecal é um bom indicador de posicionamento bem-sucedido em tempo real e provavelmente indica uma injeção bem-sucedida. Não confunda uma contração quando a agulha perfura a pele em um camundongo/rato não anestesiado com uma resposta de movimento da cauda à agulha que entra no espaço intratecal. O uso de agentes farmacológicos como NMDA, substância P e lidocaína, seja em treinamento ou misturado com a solução experimental de injeção, tem sido relatado como uma indicação mais imediata do sucesso da injeção 9,11,24. Se considerar esses agentes, é importante avaliar sua compatibilidade com o vetor da terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This ...

lumbar-intrathecal-injection-gene-therapy-vectors-for-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Chen, Y., et al. Entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega de um composto de teste no líquido cefalorraquidiano (LCR) por meio de um cateter implantado na coluna vertebral lombar de um modelo de rato. O composto circula ao longo do LCR até o cérebro e a medula espinhal, entra nos neurônios e oferece potencial terapêutico.

Entrega intratecal de um composto de teste ao sistema nervoso central de ratos

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Este relatório descreve uma técnica simples e rápida de punção intratecal para a transfecção localizada de siRNA na medula espinhal lombar em rato sob anestesia luz de curta duração.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Este artigo detalha métodos de administração intratecal para terapias direcionadas ao SNC em camundongos adultos, focando na precisão do protocolo e na possibilitade de injeções repetidas. Inclui descobertas de um estudo de validação em que oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão mutante de SOD1 em camundongos modelo SOD1-ALS, apoiando a utilidade da abordagem em pesquisas pré-clínicas sobre doenças neurodegenerativas.

Injeção intratecal lombar de SOD1-ASOs para direcionamento preciso do SNC e eficácia preditiva em camundongos humanos SOD1-G93A ALS

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Aprenda a técnica de injeção intratecal lombar para terapia gênica em camundongos e ratos. Este método padronizado permite a distribuição eficiente de vetores no sistema nervoso central para pesquisa preclínica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Explorar mais vídeos