Name: Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de deslocamento térmico para analisar a ligação de nucleotídeos e metais à selenoproteína O. Este método de alta vazão auxilia na identificação de condições de estabilização para cristalografia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ensaios de deslocamento térmico de alto rendimento para interações proteína-ligante

<ol><li>Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genes%3A+Time+to+follow+the+roads+less+traveled%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Human genes: Time to follow the roads less traveled.</a> PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).</li>
<li>Kustatscher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+invitation+to+the+understudied+proteins+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An open invitation to the understudied proteins initiative.</a> Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).</li>
<li>Jones, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+genomics+consortium%3A+A+knowledge+platform+for+drug+discovery%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Rand+Health+Q%22%5BJournal%5D)">The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary.</a> Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).</li>
<li>Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efi-est%2C+efi-gnt%2C+and+efi-cgfp%3A+Enzyme+function+initiative+%28efi%29+web+resource+for+genomic+enzymology+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools.</a> J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).</li>
<li>Pace, C. N., Mcgrath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stabilization+of+lysozyme+to+thermal+and+guanidine+hydrochloride+denaturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.</a> J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Huynh, K., Partch, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+stability+and+ligand+interactions+by+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.</a> Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformationally+responsive+dyes+enable+protein-adaptive+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+performing+and+optimizing+differential+scanning+fluorimetry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).</li>
<li>Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+applications+of+differential+scanning+fluorimetry+in+early-stage+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery.</a> Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).</li>
<li>Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+fluorescent+dyes+as+tools+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.</a> Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).</li>
<li>Lucet, I. S., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ligand+binding+to+pseudokinases+using+a+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay.</a> Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+methodology+to+subclassify+pseudokinases+based+on+their+nucleotide-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties.</a> Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).</li>
<li>Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+analysis+of+thermofluor+data+can+readily+provide+quantitative+binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities.</a> Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).</li>
<li>Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-ligand+interactions+using+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry.</a> J Vis Exp. (91), e51809(2014).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).</li>
<li>Taujale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatic+challenges+and+advances+in+illuminating+the+druggable+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome.</a> Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).</li>
<li>Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+for+broke%3A+Targeting+the+human+cancer+pseudokinome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome.</a> Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).</li>
<li>Kung, J. E., Jura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+pharmacological+targeting+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).</li>
<li>Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+kinase-like+domain+in+a+selenoprotein%2C+widespread+in+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life.</a> PLoS One. 7 (2), e32138(2012).</li>
<li>Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+selenoprotein+o%3A+A+redox-active+mitochondrial+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein.</a> PLoS One. 9 (4), e95518(2014).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+ampylation+by+an+evolutionarily+conserved+pseudokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase.</a> Cell. 175 (3), 809-821 (2018).</li>
<li>Frese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alarmone+diadenosine+tetraphosphate+as+a+cosubstrate+for+protein+ampylation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).</li>
<li>Mostert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronucleotide+probes+reveal+a+diverging+specificity+for+ampylation+vs+umpylation+of+human+and+bacterial+nucleotide+transferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases.</a> Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ydiu+domain+modulates+bacterial+stress+signaling+through+Mn2%2B-dependent+umpylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation.</a> Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).</li>
<li>Mukherjee, M., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selenoprotein+o+substrates+using+a+biotinylated+atp+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog.</a> Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).</li>
<li>Kroeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edta+aggregates+induce+sypro+orange-based+fluorescence+in+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay.</a> PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).</li>
<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
<li>Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dsfworld%3A+A+flexible+and+precise+tool+to+analyze+differential+scanning+fluorimetry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data.</a> Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).</li>
<li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+thermofluor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).</li>
<li>Ribeiro, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+pseudoenzyme+classification%2C+evolution%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling.</a> Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).</li>
<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato dissódico sal hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td><td>usado para resultados representativos, mas não é necessário para realizar TSA</td></tr><tr><td>Avanti J-15R com conjunto de suporte de microplacas</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 Sistema de PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, parede fina, rodapé, transparente/branco</td><td>Cloreto de magnésio Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>usado para resultados representativos, mas não necessário para executar</td></tr> o <tr><td>cloreto de manganês (II) tetrahidratado</td> TSA <td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>usado para resultados representativos, mas não necessário para executar</td></tr> o <tr><td>filme de vedação de placa de PCR TSA Microseal 'B', adesivo, óptico</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de gel de proteína laranja SYPRO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Uridina 5&prime;-trifosfato sal trissódico hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6625-100MG</td><td>usado para resultados representativos, mas não é necessário para realizar TSA</td></tr></tbody></table>

utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína o

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

O SelO eucariótico consiste em uma sequência de direcionamento mitocondrial N-terminal, um domínio semelhante à quinase e uma selenocisteína altamente conservada no terminal C da proteína23. Esta enzima residente mitocondrial codifica um domínio pseudoquinase que é conservado de bactérias para humanos23. A análise estrutural do homólogo SelO de Pseudomonas syringae revelou alterações de aminoácidos no sítio ativo que facilitam a ligação do ATP em orientação invertida em comparação com as quinases canônicas25. Assim, o SelO catalisa a AMPilação, em vez da fosforilação, de várias proteínas envolvidas na sinalização antioxidante para proteger as células do dano oxidativo e da morte celular25. Além da AMPilação, algumas AMPilases procarióticas e eucarióticas demonstraram catalisar a UMPilação27,28.
Usamos E. coli recombinante purificada SelO em TSA para examinar a ligação de nucleotídeos ATP e UTP a SelO na presença de cátions divalentes. Semelhante às quinases canônicas, SelO abriga o motivo DFG no qual o aspartato se liga ao íon metálico para coordenar o nucleotídeo no sítio ativo. Primeiro, otimizamos a concentração de proteína e corante para medições robustas de fluorescência em TSA, determinando que 5 μM a 10 μM de E. coli SelO era ideal com 5x SYPRO Orange (Figura 2). Além disso, mostramos que a proteína no, assim como os controles sem corante, tinham baixo sinal de fluorescência que não respondia ao aumento da temperatura. Detectamos aumentos de aproximadamente +4 °C e +12 °C na estabilidade térmica de E. coli SelO na presença de ATP-Mg2+ e ATP-Mn2+, respectivamente (Figura 3). No entanto, não observamos uma mudança na estabilidade térmica após a incubação com UTP, indicando que E. coli SelO pode não exibir ligação detectável ao UTP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg"> Figura 1: Configuração do termociclador. Um exemplo do programa termociclador usado para aumentar a temperatura da amostra em +0,5 °C/min durante a medição da fluorescência SYPRO Orange usando o canal FRET. A recomendação também inclui uma incubação à temperatura ambiente no início e no final do protocolo. Abreviatura: FRET = transferência de energia de ressonância de Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg"> Figura 2: Otimização das concentrações de proteínas e corantes. (A) Resultados representativos da otimização da concentração do corante SYPRO Orange usando 5 μM de Escherichia coli SelO. (B) Resultados representativos da otimização da concentração de E. coli SelO usando o corante 5x SYPRO Orange. A curva de desnaturação térmica representa unidades de fluorescência relativas (eixo y) em relação à temperatura (eixo x). Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de desnaturação térmica e análises ΔTm de SelO na presença de nucleotídeos e cátions divalentes. (A) Dados brutos das curvas de desnaturação térmica das amostras (5 μM de Escherichia coli SelO na presença de 200 μM de ATP ou UTP e 2 mM de cátions divalentes, 5x SYPRO Orange) exportados da máquina de RT-PCR e plotados. SelO ATP-Mg representa amostras com SelO, ATP e MgCl2, SelO ATP-Mn representa amostras com SelO, ATP e MnCl2, SelO UTP-Mg representa amostras com SelO, UTP e MgCl2, SelO UTP-Mn representa amostras com SelO, UTP e MnCl2. Observe que os controles sem corante e sem proteína exibem baixa fluorescência. Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). (B) Curvas de desnaturação térmica plotadas para a intensidade mais alta e ajustadas à equação sigmoidal de Boltzmann. Embora a desnaturação térmica de SelO não tenha sido afetada pelo UTP, observamos uma mudança acentuada na desnaturação térmica na presença de ATP (curvas roxas). Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). (C) Histograma representando os valores de Tm derivados do ajuste sigmoidal de Boltzmann dos dados representados na Figura 3B. Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histograma que descreve a mudança na temperatura de fusão ΔTm (Tm aditivo- Tm tampão). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar S1: Dados de exemplo para TSA de SelO na presença de metais e nucleotídeos. Planilha de dados brutos exportados da máquina RT-PCR e dados processados para excluir valores após a intensidade máxima de RFU, conforme descrito nas etapas 5.1 e 5.2 do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

utilizing-thermal-shift-assay-to-probe-substrate-binding-to

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Biochemistry

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A capacidade de avaliar o engajamento de alvos por inibidores candidatos em células intactas é crucial para a descoberta de drogas. Este protocolo descreve um ensaio de mudança térmica celular de formato 384 que detecta de forma confiável o engajamento de alvos celulares de inibidores visando shp2 tipo selvagem ou suas variantes oncogênicas.

Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

Este protocolo apresenta uma técnica para sondar interações proteína-proteína usando contas doadoras ligadas à glutationa com co-acompanhantes e contas aceitadoras de TPR fundidas gst-fused e contas aceitadoras juntamente com um peptídeo derivado de Hsp90. Usamos essa técnica para rastrear pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.

Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico celular para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos.

Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de substratos exibidos na superfície da levedura para ensaios de modificação enzimática. A plataforma foi demonstrada usando a análise da atividade de desfosforilação da tirosina fosfatase SHP-2 contra um de seus substratos como um ensaio de modificação enzimática representativa.

Modificação enzimática e avaliação por citometria de fluxo de proteínas exibidas na superfície de leveduras

Aprenda a usar o ensaio de deslocamento térmico para analisar a ligação de nucleotídeos e metais à selenoproteína O. Este método de alta vazão auxilia na identificação de condições de estabilização para cristalografia.

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

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