Name: Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Aprenda a visualizar transientes de cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial em C. elegans usando o repórter CaFE. Este método genético simplifica o estudo da sinalização celular no desenvolvimento.

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<meta charset="utf8"></head><body>Rastreando o cálcio nas fases iniciais do desenvolvimento de C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
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<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
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<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
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<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; O pó dissolve mais facilmente do que os flocos</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lâmpada de álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Use com 95% de etanol</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO 400 Series Small Steam Sterilizer</td><td>Steris Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Libélula 200 disco giratório confocal</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Usado com microscópio Leica</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Citogênicas Superfrost da Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 lâminas por pacote</td></tr><tr><td>Alicate de Ponta Chata, Mandíbula Lisa</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Certifique-se de que os alicates estão de mandíbula lisa</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;- d-1-tiogalactopiranosídeo&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; fita de laboratório sem dioxano</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>fita de 0,5 polegada é usada para colar lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>pacote de 1 oz</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 laser scanning confocal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Petri estéril (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 placas de Petri por caixa</td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 placas de Petri por caixa</td></tr><tr><td>Cepa EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Criado por Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Cepa EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PIE-1U; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Criado por Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Criado por Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Criado por E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Cepa OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Criado por Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Pick Handle</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Usando os protocolos descritos neste manuscrito, os padrões dinâmicos de sinalização de cálcio na fertilização e embriogênese foram observados em C. elegans.
Uma sequência típica de fertilização em vermes contendo o repórter CaFE é mostrada na Figura 2. Para facilitar a análise, foi utilizada a cepa EAG28 que combina o repórter CaFE com um transgene13 de domínio de homologia de pleckstrin (PH-mCherry). O marcador PH-mCherry localiza-se na membrana plasmática e permite uma visualização mais fácil dos limites celulares, particularmente no braço da gônada. A cepa EAG28 foi criada pelo cruzamento da cepa EAG16 contendo o repórter CaFE com a cepa repórter OD70 PH-mCherry13. Em C. elegans, a ovulação e a fertilização ocorrem simultaneamente. O tempo 0 de fertilização é considerado o primeiro quadro em que um sinal de fluorescência é detectado no oócito ovulante (Figura 2). Uma explosão brilhante de fluorescência ocorre no local da fusão dos espermatozoides assim que a borda dianteira do oócito entra na espermateca, o órgão de armazenamento de espermatozoides7. O sinal aparece antes que a ovulação esteja completa. A onda de cálcio é bifásica, com uma rápida explosão inicial seguida por uma onda de fluorescência do ponto de entrada em direção ao pólo oposto. Todo o oócito torna-se fluorescente em &lt;30 s.
Observe que o repórter CaFE está em uma única cópia e, portanto, o sinal não é tão brilhante quanto outros transgenes. O lapso de tempo Z-stack não é recomendado durante a ovulação, a menos que um confocal de disco giratório esteja disponível e otimizado. As imagens da pilha Z podem ser obtidas antes ou depois de um filme para capturar mudanças 3D na morfologia das gônadas. Embora as imagens aqui tenham sido tiradas com um microscópio confocal, os transientes também foram observados usando microscopia de fluorescência de campo amplo, que é mais comum e acessível do que a confocal. Usando um confocal de varredura a laser, a taxa de quadros é de aproximadamente 1 fps. Usando um disco giratório confocal, a taxa de quadros é de 10 fps ou mais rápida. O sinal de fundo do repórter CaFE é suficiente para iluminar os oócitos em maturação no braço da gônada. Após a fertilização, um aumento de 1,5-2x na intensidade do sinal de GFP é normalmente observado.
Existem vários métodos alternativos para quantificação. Por exemplo, o software de análise de imagem Imaris, criado pela Oxford Instruments (a mesma empresa-mãe do microscópio confocal de disco giratório Andor Dragonfly), tem a capacidade de quantificar o sinal em cada quadro apenas do oócito em trânsito, em vez de um ROI maior. No entanto, o software Imaris não é gratuito. Além disso, uma estratégia detalhada de análise de imagem para medir as ondas de cálcio no oócito foi descrita em detalhes excelentes por Takayama, Fujita e Onami e usa o ImageJ, que está disponível gratuitamente14. Alternativamente, os quimógrafos para ilustrar a onda de sinal fluorescente em um único oócito requerem uma manipulação de imagem mais extensa do que a descrita aqui, mas são descritos em Takayama e Onami3.
Uma vantagem distinta de C. elegans é sua capacidade de derrubar a expressão de quase qualquer gene, alimentando os vermes com bactérias que expressam dsRNA para desencadear RNAi endógeno15,16. Para uma expressão ideal de dsRNA, tanto as placas de RNAi quanto a cultura de RNAi saturada contêm IPTG. O dsRNA é produzido expressando o gene de interesse com promotores flanqueadores. Aqui, usamos a biblioteca Ahringer que tem como alvo a maior parte do genoma do verme por meio do uso de 16.256 cepas bacterianas17. Como alternativa, um ORFeome de ~ 11.000 clones de RNAi foi criado pelo laboratório Vidal usando o sistema Gateway e está disponível para compra por meio do Horizon Discovery18.
Para demonstrar a utilidade do repórter CaFE em combinação com RNAi, examinamos a ovulação prematura. Uma deleção parcial no ipp-5 induz um evento de ovulação dupla em que tanto o oócito -1 quanto o oócito -2 entram na espermateca durante a mesma ovulação19. O IPP-5 é uma fosfatase que atua no IP3 e diminui efetivamente os níveis do segundo mensageiro IP3. Descobrimos que o knockdown de RNAi do ipp-5 provoca um fenótipo de ovulação dupla semelhante ao mutante.
A análise do repórter de CaFE durante a ovulação dupla induzida pelo knockdown do RNAi ipp-5 revelou novos aspectos do OET. Primeiro, um sinal de cálcio foi observado imediatamente após a entrada na espermateca no oócito -1 principal, mas não no oócito -2 final (Figura 3). Embora 2 oócitos sejam ovulados, o oócito -1 ainda é o único oócito que mostra sinais de maturação adequada, em particular, a quebra do envelope nuclear (NEBD). Esses dados sugerem que, embora o oócito -2 esteja na presença de espermatozoides, ele não é competente para ser fertilizado, pois ainda não amadureceu adequadamente. Em segundo lugar, o oócito -2 exibe uma onda de cálcio atrasada, normalmente quando o oócito sai da espermateca para o útero. Embora a maturação do oócito seja normalmente um pré-requisito para a ovulação, esses dados sugerem que a maturação do oócito e a competência para a fertilização ainda podem ocorrer após a ovulação. A visualização da onda de cálcio atrasada durante o knockdown do ipp-5 destaca as vantagens do repórter CaFE para interrogar a competência e o tempo de fertilização.
Além disso, descobrimos que o repórter CaFE é detectável em ovos postos e revela transientes de cálcio unicelular durante o início da embriogênese em C. elegans. Embriões de EAG28 adultos sincronizados do Dia 1 (CaFE; PH-mCherry) foram fotografados usando os protocolos das seções 1-5 com o disco giratório Andor Dragonfly confocal usando a câmera Zyla (Figura 4). Os transientes de cálcio estão confinados a células únicas e levam menos tempo do que a onda de cálcio de fertilização para serem concluídos (~ 9 s, n = 11). No entanto, a onda de cálcio durante a embriogênese não parece ser bifásica. Transientes de cálcio não foram observados antes do estágio de 8 células. Notavelmente, o cálcio não se localiza no sulco de clivagem em C. elegans, como é visto em muitos outros organismos, incluindo humanos e Xenopus 20,21,22. Transientes de cálcio unicelular foram observados bem após a gastrulação (~ 200 min após a fertilização) e em ovos postos. Um único embrião exibe vários transientes de cálcio ao longo do tempo, mas em células diferentes e normalmente uma célula de cada vez. Observe que a exposição contínua à estimulação a laser danificará os embriões. Recomenda-se uma potência mais baixa de LED/laser ou exposição descontínua. No entanto, como as ondas de cálcio são relativamente curtas em ~ 9 s, não recomendamos mais lento do que 2 s entre os eventos de estimulação com LED/laser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Figura 1: Braço da gônada de C. elegans . Imagem de um braço de gônada da cepa do verme EAG25, mostrando o repórter CaFE GFP (verde) e o marcador histona 2B-mCherry (vermelho), que destaca os núcleos na linha germinativa. O oócito proximal é denotado pelo -1 diretamente antes da espermateca, onde os espermatozoides são armazenados (seta). O embrião localizado mais próximo da espermateca, mas dentro do útero, é o embrião mais recente. A imagem foi tirada usando o confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualização da onda de cálcio durante a fertilização. Imagens de séries temporais de fluorescência refletindo cálcio intracelular durante a fertilização na cepa de vermes EAG28. A cepa EAG28 contém o repórter CaFE (verde) e uma fusão de domínio de homologia pleckstrina-mCherry (amarelo), que destaca as membranas plasmáticas. O tempo 0 indica o primeiro quadro retratando um claro aumento no sinal fluorescente no oócito. O tempo 24,4 s reflete o primeiro quadro mostrando a fluorescência total do oócito. As imagens de séries temporais foram tiradas usando o disco giratório Andor Dragonfly confocal com uma câmera Zyla. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Figura 3: Ondas de cálcio durante um evento de ovulação dupla induzido por RNAi ipp-5 . Imagens de lapso de tempo de ondas sequenciais de cálcio do oócito -1 e do oócito -2 em uma cepa EAG16 (CaFE em verde GFP) exposta ao RNAi ipp-5 . O quadro de -40,0 s inclui rótulos para o oócito -1 (-1), -2 oócito (-2), espermateca (*) e +1 embrião (+1). O tempo 0 s exibe o aumento inicial da fluorescência da onda de cálcio do oócito -1. O tempo 4,5 s mostra a onda de cálcio se espalhando em direção ao pólo oposto no oócito -1. O tempo 70,5 s exibe fluorescência de células inteiras no oócito -1 acompanhado pelo oócito -2 no sinal GFP basal; Ambos os oócitos estão na espermateca. O oócito -1 fertilizado e o oócito -2 não fertilizado entram no útero no tempo 158,3 s. Aos 219,3 s, o oócito -2 exibe uma onda de cálcio fluorescente tardia. As imagens foram tiradas usando o confocal de disco giratório Andor Dragonfly com uma câmera Zyla. Barra de escala = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Figura 4: Transientes de cálcio unicelular no início da embriogênese. (A) Embriões no útero e (B) ex utero (ovo posto) exibiram um sinal fluorescente em uma única célula durante a embriogênese. As imagens foram tiradas usando o confocal de disco giratório Andor Dragonfly com uma câmera Zyla. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

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Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61481/quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-and-their-downstream-effects-in-primary-mouse-midbrain-neurons'&gt;Bancroft, E. A., et al. Quantificando o estilo Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none; font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration-skip-ink: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-encapsulamento; '&gt; 2 + &lt; span...

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Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

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Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

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