Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

A produção de embriões viáveis é um processo complexo. Nosso objetivo geral é definir os sinais celulares que coordenam a transição de um oócito para um embrião. O repórter CaFE é uma nova ferramenta desenvolvida para visualizar sinais de cálcio que ocorrem durante a fertilização e durante o início da embriogênese.

Usando o repórter CaFE, descobrimos uma onda de cálcio atrasada em oócitos que são ovulados prematuramente. Também descobrimos a presença de transientes de cálcio unicelular durante o início da embriogênese. Ambas as descobertas ilustram a utilidade de um indicador de cálcio geneticamente codificado durante o desenvolvimento inicial.

Técnicas anteriores para visualizar oócitos de cálcio dependiam da injeção de corante na gônada. Esta técnica é trabalhosa e requer equipamentos especializados de microinjeção. O repórter CaFE permite fácil visualização da onda de cálcio em oócitos e embriões com equipamentos amplamente disponíveis.

O CaFE Reporter facilita a investigação sobre o tempo e a regulação da sinalização de cálcio em oócitos e embriões. Este repórter pode ser facilmente combinado com mutantes, marcadores e knockdowns de RNAi existentes para descobrir o comportamento do cálcio em relação a outros eventos marcantes durante o início da embriogênese, como a maturação miótica. Para começar, segure a alça da picareta de minhoca e afrouxe o colar prateado em direção à cabeça para que as quatro seções se separem.

Coloque um fio de platina de 1,5 polegada no meio das quatro seções. Segure o fio no centro enquanto aperta o colar para unir as quatro seções. Usando um alicate de ponta chata, molde cuidadosamente o fio e prenda repetidamente a extremidade do fio para criar cerca de dois a três milímetros de pé.

Use este pé para pegar os vermes. Prepare uma solução de 3% de agarose em água e aqueça no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente. Coloque uma lâmina de microscópio em branco entre duas outras lâminas de microscópio que tenham uma única camada de fita adesiva no eixo longo.

Usando uma pipeta de um mililitro, coloque a solução aquecida de 3% de agarose no centro da lâmina em branco. Coloque rapidamente uma nova lâmina de microscópio na gota de agarose, perpendicular à lâmina em branco, com a gota apoiada nas lâminas adjacentes e, em seguida, separe suavemente as lâminas, mantendo a almofada intacta. Usando uma pipeta de 20 microlitros, adicione uma pequena gota de levamisol de um milimolar em tampão M9 no centro da almofada de agarose para paralisar os vermes.

Escolha pelo menos cinco minhocas sincronizadas e toque suavemente o pé da alça da picareta de minhoca na gota de levamisol para transferir as minhocas. Cubra cuidadosamente a almofada de agarose com uma lamínula. Verifique a localização dos vermes, pois a lamínula pode causar a dispersão dos vermes.

Rotule a lâmina do microscópio com detalhes apropriados, como o nome da cepa do verme. Localize os vermes usando uma objetiva de baixa potência no microscópio usando iluminação de campo claro. Use um mínimo de uma objetiva de ar de 20x ou uma objetiva de imersão de 40x para visualizar claramente a onda de cálcio nos oócitos.

Para uma visualização ideal dos repórteres fluorescentes, ajuste o ganho ou o tempo de exposição para os canais GFP e RFP. Examine cada oócito menos um nos braços das gônadas do verme para determinar se um evento de fertilização é iminente. Após a quebra do envelope nuclear, o citoesqueleto do oócito menos um mais proximal se reorganizará, assumirá uma aparência arredondada e se separará do oócito menos dois.

Quando a ovulação ocorrer iminentemente, comece a gravar o vídeo em uma configuração de campo amplo imediatamente. O oócito proximal é denotado pelo menos um diretamente antes da espermateca, onde os espermatozoides são armazenados. O embrião mais recente está localizado mais próximo da espermateca, mas dentro do útero.

A onda de cálcio exibiu um padrão bifásico, começando com uma explosão rápida seguida por uma onda de fluorescência movendo-se do ponto de entrada em direção ao pólo oposto. Um sinal de cálcio foi observado imediatamente após a entrada na espermateca no oócito principal menos um, mas não no oócito posterior menos dois. Embriões no útero e ex-útero exibiram um sinal de fluorescência em uma única célula durante a embriogênese.