Name: Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a desenvolver um sistema regulado por rapamicina para controlar a atividade de tirosina fosfatases em células vivas. Este método permite a regulação temporal e específica da fosfatase SHIP-2, auxiliando no estudo de vias de sinalização celular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Regulação temporal da atividade da fosfatase com o sistema regulado pela rapamicina

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

As proteínas tirosina fosfatases são uma família crítica de proteínas envolvidas em uma infinidade de eventos de sinalização celular. Eles demonstraram desempenhar um papel fundamental na regulação da proliferação, migração e apoptose celular 1,2,3. Consequentemente, a desregulação das proteínas tirosina fosfatases leva a uma variedade de doenças e distúrbios debilitantes 4,5,6,7. O estudo da função fisiológica das tirosina fosfatases e seu papel no desenvolvimento dessas patologias tem sido historicamente dificultado pela falta de ferramentas necessárias para investigar os meandros da sinalização da fosfatase8.
Tradicionalmente, as fosfatases são estudadas usando métodos que não possuem a especificidade desejada e/ou não fornecem controle temporal de sua atividade. Essas limitações críticas das ferramentas disponíveis tornam difícil dissecar papéis específicos das fosfatases nas vias de sinalização. A superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos e dominantes ou a regulação negativa da expressão da fosfatase fornecem especificidade, mas carecem de controle temporal e muitas vezes podem desencadear mecanismos compensatórios que mascararão a verdadeira função da enzima.
Os inibidores farmacológicos permitem a regulação temporal das fosfatases. No entanto, muitos inibidores da fosfatase são notoriamente inespecíficos devido à composição bem conservada do sítio ativo nas tirosina fosfatases9. Além disso, devido a restrições de projeto, os inibidores direcionados ao sítio catalítico exibem baixa permeabilidade à membrana celular10. Outra limitação dos inibidores é que eles permitem apenas o exame dos efeitos da inativação da fosfatase11. Assim, há necessidade de ferramentas que permitam a ativação específica e temporalmente regulável de fosfatases. Essas ferramentas permitirão aos pesquisadores identificar os efeitos diretos da ativação da fosfatase, separando-os de múltiplas cascatas de sinalização paralela frequentemente ativadas por estímulos biológicos. É importante ressaltar que o controle temporal rígido da atividade permite a identificação de eventos transitórios induzidos por uma fosfatase e separa os efeitos da atividade aguda e prolongada da fosfatase. A combinação de regulação temporal com análise mutacional permitirá uma dissecação detalhada de papéis específicos de domínios individuais da fosfatase e interrogação de sua sinalização a jusante12.
Para resolver a falta de recursos desejados nas ferramentas existentes, o grupo Karginov desenvolveu o sistema Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. O sistema RapR utiliza um domínio de comutação projetado, iFKBP, que permite a regulação alostérica da proteína de interesse (POI). A inserção do domínio iFKBP em uma posição alostericamente acoplada ao sítio catalítico do POI o torna suscetível à regulação pela rapamicina. Na ausência de rapamicina, o iFKBP interrompe o sítio catalítico devido à dinâmica estrutural intrinsecamente alta do iFKBP e, portanto, inativa o POI. A adição de rapamicina induz a interação de iFKBP com a proteína co-expressa FRB (Figura 1). Isso causa estabilização do domínio do switch, o que consequentemente restaura a estrutura e a função do domínio catalítico do POI. Como tal, a ferramenta permite a ativação específica e temporalmente regulável do POI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. O RapR permite a ativação alostérica da proteína de interesse com a adição de rapamicina. Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 inserível; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Src homologia-2 proteína tirosina fosfatase contendo domínio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A ferramenta RapR pode ser aplicada a diferentes famílias de proteínas. Pode ser usado para regular proteínas quinases, bem como fosfatases12,14. Este protocolo se concentrará na aplicação da ferramenta RapR para controlar a fosfatase Shp2. Shp2 é uma proteína tirosina fosfatase onipresente que está envolvida em processos de sinalização como proliferação, migração, imunomodulação e diferenciação 1,16,17,18. A desregulação do Shp2 tem sido associada a vários cânceres sólidos, leucemia mieloide e distúrbios do desenvolvimento 5,7. No entanto, o Shp2 foi vítima das mesmas deficiências de ferramenta descritas acima. Para combater essas limitações, o RapR-Shp2, um construto Shp2 específica e temporalmente regulável, foi desenvolvido e caracterizado12.
Antes do desenvolvimento de RapR-Shp2, sabia-se que Shp2 estava envolvido na migração celular 19,20,21. No entanto, seu papel específico na sinalização envolvida nesse processo era desconhecido. Também não se sabia em que escala de tempo o Shp2 regula a migração das células e quais mudanças morfodinâmicas específicas ele induz em diferentes momentos de sua ativação. Além disso, não ficou claro se a ativação aguda e prolongada de Shp2 causará efeitos diferentes. Usando RapR-Shp2, verificou-se que a ativação aguda de Shp2 induz disseminação celular transitória, aumento de saliências, polarização celular e migração. Vias específicas a jusante de Shp2 que regulam mudanças morfodinâmicas distintas também foram identificadas12. Este protocolo fornece detalhes para o projeto e caracterização de RapR-Shp2, que pode ser usado para orientar o desenvolvimento e aplicação de outras fosfatases RapR.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Glass Coverwashs 25 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1.5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Buffer</td><td></td><td></td><td>Para 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL de glicerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g azul de bromofenol, pH final 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Cell</td><td>Chamber invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Heat Inactivated Triple 0.1 &micro; m filtrado estéril</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Publicado em 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red plasma membrane dye</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competente células</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzima</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Reagentes de Cleland</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>Kit de extração de gel GeneJET</td></tr><tr><td>Gel Verde Ácido Nucleico Mancha</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento de gel roxo 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software de processamento</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td> <td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> Imidazol <td>25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> <td>de lise20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R atualização 2022b foi usada para executar as funções CellGeo</td></tr><tr><td>Microscopia Metamorfo Software de Automação e Análise de Imagem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene Géis</td> Pré-moldados Choice <td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 12 poços</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Biologia Molecular Água</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Espelho Polichroic Multiband</td><td>Chroma Technology</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x objetivo</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca e Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8-Strip Tubos e Tampas, Tira Rígida Tampas de Cúpula Anexadas Individualmente</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF / Sanduíches de papel de filtro</td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sódio</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>para eletroforese</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de lavagem <td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR</td><td>Sinalização celular</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 Anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-bandeira</td><td>Anticorpo Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticorpo</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP Anticorpo</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Anticorpo</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxilina Anticorpo</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-EGFR Y992 Anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204 </td><td>Anticorpo Celular Sinalização</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-paxilina Y31 Anticorpo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-PLC&gama; Y783 Anticorpo</td><td>Celular Sinalização</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC&gamma; </td><td>Sinalização de Células de Anticorpo</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

A Figura 4 demonstra os resultados que podem ser esperados do ensaio de atividade da fosfatase à base de paxilina. Neste experimento, a atividade da fosfatase Shp2 negativa constitutivamente ativa e dominante foi comparada com a do RapR-Shp2 ativo e inativo usando fosfo-paxilina como leitura. As construções Shp2 foram imunoprecipitadas e submetidas ao ensaio de atividade conforme descrito no protocolo. As leituras de fosfo-paxilina para Shp2 constitutivamente ativo e RapR-Shp2 ativo foram semelhantes, indicando que o RapR-Shp2 ativo não foi afetado negativamente pela introdução do domínio RapR e manteve a atividade total uma vez ativado. Shp2 negativo dominante e RapR-Shp2 inativo também foram semelhantes, indicando que o construto RapR-Shp2 não tem atividade quando inativo. Isso indica o design bem-sucedido de uma RapR-fosfatase. O fosfo-substrato usado para este ensaio pode diferir com base na fosfatase de interesse.
A Figura 5, semelhante à Figura 4, compara RapR-Shp2 constitutivamente ativo, dominante negativo e ativo e inativo. Este experimento foi conduzido sem imunoprecipitação dos construtos. Em vez disso, foi projetado para caracterizar os efeitos de sinalização a jusante da construção RapR-Shp2 dentro das células. Aqui, as construções Shp2 foram expressas em células HEK293T. O efetor a jusante ERK1 / 2 mostrou aumentar na fosforilação em resposta à ativação de RapR-Shp2, assim como na amostra constitutivamente ativa. O RapR-Shp2 inativo não induziu essa mudança. Isso indica que a sinalização a jusante de Shp2 é preservada com a incorporação do domínio RapR. Da mesma forma, os fosfo-substratos conhecidos EGFR e PLCγ foram desfosforilados em resposta à ativação de RapR-Shp2 em células A431.
Finalmente, a Figura 6 apresenta os resultados da ativação de RapR-Shp2 na morfodinâmica de células HeLa. Uma vez que o RapR-Shp2 foi ativado, as células mostraram um aumento na atividade protrusiva, bem como na área celular. Isso indica que a ativação de RapR-Shp2 é suficiente para induzir mudanças morfodinâmicas nas células HeLa e pode permitir que os pesquisadores investiguem vias de sinalização específicas a jusante responsáveis por esse efeito.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Figura 4: Resultados do ensaio de atividade à base de paxilina: Constitutivamente ativo, dominante negativo e RapR-Shp2 foram imunoprecipitados e sujeitos ao ensaio de atividade usando o protocolo descrito. Os níveis de pY31 paxilina em CA e RapR-Shp2 foram semelhantes, indicando que a construção RapR-Shp2 teve atividade semelhante em comparação com CA Shp2 uma vez ativado. A amostra RapR-Shp2 não ativada não teve atividade, semelhante à amostra DN, indicando que não estava "vazando". Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatase contendo domínio de homologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente ativo; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Figura 5: Resultados do ensaio de lisado de células inteiras: Constitutivamente ativo, dominante negativo e RapR-Shp2 foram expressos em HEK293T células e o protocolo de lisado de células inteiras foi concluído. Quando inativo, o RapR-Shp2 não ativou ERK1/2 por fosforilação, semelhante à amostra DN Shp2. Isso indica que o RapR-Shp2 não tem atividade quando inativo. Uma vez ativado, o nível de fosforilação de ERK1/2 foi semelhante ao da amostra CA Shp2, indicando ativação bem-sucedida e sinalização a jusante de Shp2. Da mesma forma, as células A431 que expressam RapR-Shp2 mostraram diminuições na fosforilação de EGFR e PLCγ, ambos substratos conhecidos de Shp2. Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatase contendo domínio de homologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente ativo; ERK = quinase regulada por sinal extracelular; GAPDH = gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; EGFR = receptor do fator de crescimento epidérmico; PLCγ = fosfolipase C gama; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Figura 6: Análise de dados de área celular e atividade protrusiva com base em imagens ao vivo: As células HeLa foram transfectadas com RapR-Shp2 e submetidas ao protocolo de imagem ao vivo descrito. Os dados foram analisados conforme descrito no protocolo de análise de dados. Uma vez ativadas (indicadas pela linha cinza vertical), as células HeLa mostraram aumentos na atividade protrusiva celular e na área celular. Nas amostras negativas que expressavam apenas FRB, essa atividade não estava presente. Isso indica que a ativação do RapR-Shp2 induz mudanças morfodinâmicas rápidas dentro das células HeLa e estimula a disseminação e a protrusão celular. Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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