Design e Desenvolvimento Guiados por Estrutura de Novos Inibidores da Ciclofilina A e Derivados do Ganoderiol-F: Uma Abordagem In-Silico
23 de junho de 2026
Aqui, apresentamos um protocolo para o desenho guiado por estrutura da interação de ligação proteína-ligante entre Sangliferina A e Ciclofilina A/Ganoderiol-F, essencial para a descoberta de novos medicamentos. A estabilidade do complexo ligante-receptor foi avaliada por meio de simulação de dinâmica molecular.
Esta pesquisa foca no desenvolvimento de novos inibidores da ciclofilina A e antiproliferativos gan-it-role para atingir o eixo DCDK da ciclofilina e inibir a proliferação do câncer celular. Os principais desafios incluem alcançar a interação geométrica ótima ligante-receptor e manter complexos ligante-proteína estáveis sob condições experimentais e fisiológicas dinâmicas. Para começar, abra o arquivo 1NMK".
Localize o aminoácido arginina na posição número 55 e registre as coordenadas X, Y e Z na interface do AutoDock. Abra o menu "Arquivo", selecione Ler Moléculas. Escolha o arquivo 1NMK e clique em Abrir.
Adicione átomos de hidrogênio selecionando Editar, escolhendo Hidrogênio e clicando em Adicionar. Depois escolha "Apenas Polar" e confirme com OK. Depois vá novamente ao menu Editar, escolha Átomos e selecione Atribuir Tipo de Átomo AD4. Em seguida, escolha "Charges" e selecione Kollman Charges.
Salve o receptor preparado como 1NMK. pdbqt"selecionando Arquivo, escolhendo Salvar, definindo o tipo de arquivo e confirmando a localização do salvamento. Em seguida, abra o menu Ligand, selecione Input.
Clique em Abrir, escolha o arquivo PDB e clique em "Abrir" novamente. Quando a janela de informações aparecer, revise os detalhes dos ligantes. Para detectar a raiz do ligante, selecione Ligante, depois escolha "Árvore de Torção" e clique em Detectar Raiz.
Salve o ligando selecionando Ligando, escolhendo Saída e clicando em Salvar como PDBQT. Prepare a grade receptora selecionando Grade, escolhendo Macromolécula, selecionando 1NMK e clicando em Molécula. Confirme o aviso e salve como 1NMK.pdbqt.
Para definir os tipos de mapa, selecione Grade, seguido de Definir Tipos de Mapa, Ligando. Escolha Ligando" e, finalmente, selecione Ligando" novamente. Depois, defina o centro da caixa da grade selecionando Grade, escolhendo Grade Box e clicando em Centro.
Depois, selecione um átomo e insira as coordenadas da caixa da grade. Salve o parâmetro da grade como um arquivo GPF. Configure o docking selecionando Docking, seguido de "Macromolecule" e defina o nome rígido do arquivo.
Navegue até a pasta necessária e clique em 1NMK.pdbqt. para abri-la, selecione Docking, escolha Output, clique em Lamarckian GA e salve o arquivo de parâmetros de docking como 1NMK.dpf. No terminal do Cygwin, digite CD C:e pressione enter; Então digite CD projeto" e pressione enter novamente.
Em seguida, digite moléculas de cd e pressione enter. Depois digite CD 3" e aperte enter. Digite o comando AutoGrid" para gerar mapas de grade e pressione enter para executar o AutoGrid.
Após a execução, digite cauda f 1NMK. glg"e pressione enter para ver o progresso do log, digite o comando para simulação de acoplamento molecular. Para gerar o arquivo de log de docking, e pressione enter para iniciar o AutoDock.
Depois, digite cauda f 1NMK. DLG" e pressione enter para monitorar o processo de acoplamento. Depois de criar todos os arquivos DLG, vá até a pasta 1 e abra o arquivo DLG no WordPad, pressione Ctrl+F.
Digite a palavra-chave de busca e pressione enter três vezes para chegar à tabela RMSD. Copie a energia de ligação e as informações correspondentes de execução de cada molécula da tabela RMSD, compile as 20 principais moléculas em uma planilha com colunas criadas para número de série, energia mínima de ligação e execute. No terminal Cygwin", navegue até a pasta de moléculas específicas dentro do diretório do projeto.
Digite o comando para extrair coordenadas de ligantes acoplados do DLG e ajuste os dados. Pressione enter novamente para finalizar, confirmando a criação do arquivo PDBQT"run 1NMK. Verifique se o arquivo PDB da execução 1NMK foi criado na mesma pasta.
Em seguida, abra o software PyMOL 2.5"" e o AutoDock na área de trabalho, e abra o arquivo receptor para selecionar a estrutura do receptor para visualização. Abra o arquivo de configuração correspondente do ligando para a molécula escolhida e exiba o ligando carregado no espaço de trabalho 3D. Selecione "Ocultar Tudo" no menu, importe o arquivo para o Maestro para visualizar a estrutura, e então clique em Interação de Ligandos para obter o diagrama de interação de ligandos.
Abra o software UCSF Chimera a partir da área de trabalho. Selecione Arquivo, seguido de Abrir. Navegue para dirigir C, projeto e moléculas.
Selecione o arquivo 1NMK. pdb" e clique em Abrir. No menu, selecione "Residue" e escolha UNL Zoom" para focar na região de residue UNL.
Selecione a Zona. Depois, pressione OK" para confirmar. Em seguida, selecione Ação.
Escolha Rótulo, depois selecione "Resíduo" e escolha Nome Mais Especificador para rotular os resíduos. Abra as Ferramentas, selecione Análise de Estrutura e então clique em FindHBond. Na janela padrão de FindHBond, marque as caixas para Ligações H de Cor que Não Atendam a Critérios Precisos e encontre apenas ligações H com Selecionado.
Limpe a seleção de zonas para iniciar uma nova pesquisa. Depois, selecione os parâmetros da zona e dê zoom para a tela molecular, observando as linhas azul e laranja que representam as ligações de hidrogênio. Por fim, examine a estrutura visualizada e conte o número total de ligações de hidrogênio visíveis.
A confirmação do acoplamento do complexo ligante-receptor foi visualizada usando PyMOL 2.5, mostrando 109 hidroxi-seis hidroxietil ligado ao bolso ativo do receptor 1NMK. O ligante ácido 4-hidroximandélico formou ligações de hidrogênio com o receptor 1NMK", especialmente com a arginina 55 a uma distância de 1,53 angstroms. A análise estrutural bidimensional ilustrou os aminoácidos com os quais os ligantes interagiram por meio de ligações de hidrogênio.
Simulações de dinâmica molecular confirmam a estabilidade do complexo ligante-receptor por meio da análise do raio de giro ao longo de 1000 picossegundos. O gráfico RMSD mostrou estabilização consistente do complexo após um nanossegundo de simulação, indicando ligação estável proteína-ligante. A densidade média do sistema foi de aproximadamente 10¹⁹ quilos por metro cúbico, confirmando o equilíbrio sob condições NVT, e a pressão do sistema permanece estável durante o equilíbrio NPT por 100 picossegundos.
A temperatura estabilizou-se em torno de 300 kelvin durante a fase NVT, confirmando o equilíbrio térmico bem-sucedido. A caixa de trajetória do complexo ligante-proteína foi visualizada após a simulação, mostrando a distribuição das moléculas de água ao redor do complexo acoplado. Poucos estudos investigam o antiproliferativo gan-it-role como alvo terapêutico oncogênico.
Esse protocolo preenche essa lacuna projetando e validando inibidores usando acoplamento molecular e análise dinâmica. Nosso protocolo interroga múltiplas ferramentas computacionais em um fluxo de trabalho unificado, garantindo uma análise abrangente de ligando-proteína ou receptor. Nossas pesquisas futuras focarão na validação desses inibidores in vitro e in vivo, explorando a aplicação na fronteira dos inibidores da Ciclofilina A em múltiplos tipos de células cancerígenas.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se no desenvolvimento e validação de novos inibidores da Ciclofilina A que visam o eixo Ciclofilina D-CDK para suprimir a proliferação de células cancerígenas. Utilizando uma abordagem guiada pela estrutura, os pesquisadores desenvolveram 117 moléculas ligantes e avaliaram suas interações com o receptor enzimático Sanglifehrina A (1NMK) por meio de encaixe molecular e simulações de dinâmica molecular. O fluxo de trabalho integrou múltiplas ferramentas computacionais para otimizar a ligação entre ligante e receptor, avaliar a estabilidade e identificar resíduos interagentes-chave para o desenvolvimento potencial de fármacos anticâncer.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia do câncer
- Desenho computacional de fármacos
- Encaixe e simulação moleculares
Antecedentes
- A ciclofilina A (Cyp A) está implicada na progressão do câncer por meio da regulação da proliferação e da sobrevivência celular.
- O eixo ciclofilina D-CDK representa um alvo terapêutico promissor em oncologia.
- Os derivados de ganoderiol F demonstraram potencial como alvos oncogênicos em múltiplos tipos de câncer.
- A predição precisa de interações ligante-receptor exige modelagem computacional robusta.
Objetivo do Estudo
- Projetar inibidores novedores da Ciclofilina A utilizando métodos orientados por estrutura.
- Avaliar a afinidade de ligação entre ligante e receptor e a compatibilidade geométrica por meio de docking.
- Confirmar a estabilidade do complexo por meio de simulações de dinâmica molecular.
- Identificar os resíduos de aminoácidos-chave envolvidos na formação de ligações de hidrogênio com os ligantes líderes.
Métodos Utilizados
- Chemsketch para construir 117 moléculas novas de ligantes inibidores de ciclofilina.
- AutoDock 4.2.6 para o encaixe ligante-proteína, a fim de determinar as geometrias de ligação ideais.
- PyMOL 2.5 para visualizar as conformações de encaixe e as interações entre ligante e receptor.
- Chimera e Maestro para detectar e analisar ligações de hidrogênio.
- Gromacs com campo de força CHARMM 36 para simulação de dinâmica molecular do complexo ligante-receptor.
Resultados Principais
- A arginina 55 no receptor 1NMK formou uma ligação de hidrogênio com o ligante a uma distância de 1,53 Å.
- Os resíduos interagentes principais incluíram Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe e Cys.
- O ligante formou 45 ligações de hidrogênio com o receptor, indicando alto potencial de ligação.
- A caixa de docking foi centralizada em X=38,86, Y=10,987, Z=40,734 no receptor 1NMK.
- A simulação de dinâmica molecular no Gromacs mostrou estabilização do complexo após 1 ns, com RMSD e raio de giração consistentes.
- O sistema manteve o equilíbrio sob condições NVT/NPT, com densidade média de ~1019 kg/m³ e pressão e temperatura estáveis (~300 K).
Conclusões
- O complexo ligante-receptor projetado demonstra estabilidade suficiente para um desenvolvimento adicional como terapêutica contra o câncer.
- A arginina 55 desempenha um papel crítico na ligação do ligante dentro do sítio ativo da ciclofilina A.
- O fluxo de trabalho computacional integrado identifica com sucesso inibidores promissores da Cyp A.
- O trabalho futuro concentrar-se-á na validação in vitro e in vivo em múltiplos tipos de células cancerígenas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O design computacional guiado por estrutura permite a identificação rápida de inibidores da Ciclofilina A com ligação otimizada ao eixo Ciclofilina D-CDK, um alvo oncológico validado. Essa abordagem reduz a eliminação em estágios iniciais ao priorizar ligantes com forte interação com o alvo prevista e estabilidade do complexo. O fluxo de trabalho auxilia na identificação de compostos líderes ao integrar docking, análise de interações e dinâmica molecular para reduzir os riscos das hipóteses mecanicistas antes da síntese.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da modelagem de interações de ligantes com a ciclofilina A em resolução atômica.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional do alvo por meio da previsão da afinidade de ligação e do envolvimento de resíduos-chave, como a Arginina 55.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na modulação do alvo ao identificar ligantes que formam múltiplas ligações de hidrogênio, incluindo 45 observadas no complexo líder.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera complexos ligante-receptor validados adequados para o desenvolvimento de ensaios bioquímicos ou biofísicos.
- Reprodutibilidade: Padroniza parâmetros de docking (centro da grade em X=38,86, Y=10,987, Z=40,734) e pontuação para triagem virtual consistente.
- Escalabilidade: Permite a avaliação de grandes bibliotecas de ligantes (117 moléculas construídas) utilizando fluxos de trabalho automatizados de docking.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Enfoca a ciclofilina A, implicada na proliferação e sobrevivência do câncer em múltiplos tipos tumorais.
- Continuidade Translacional: Oferece uma conexão mecanicista entre o design in-silico e a futura validação in vitro e in vivo.
- Redução de Riscos: Avalia a estabilidade do complexo por meio do RMSD e do raio de giração, apoiando decisões de avançar ou não antes da síntese do composto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, permitindo uma triagem computacional antes dos testes em laboratório.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses terapêuticas modelando como ligantes inibem a função da Ciclofilina A no eixo D-CDK.
- Triagem: Fornece resultados prontos para ensaios por meio de poses padronizadas de encaixe molecular e classificações de energia de ligação para priorização de compostos.
- Análises: Oferece métricas quantitativas (energia de ligação, contagem de ligações de hidrogênio, RMSD) para comparar o desempenho de ligantes e orientar sua otimização.
- Pesquisa Translacional: Conecta os compostos identificados computacionalmente ao progresso pré-clínico ao validar a estabilidade do complexo em uma simulação de 1000 ps.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para direcionar outras interações proteína-proteína utilizando a mesma integração de ferramentas (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicistas por meio da previsão de interações ligante-receptor e identificação de resíduos críticos de ligação.
- Valor Operacional: A padronização de fluxos de trabalho entre ferramentas reduz a variabilidade e permite a colaboração entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao filtrar compostos com base na estabilidade prevista e no engajamento com o alvo.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de quimiotipos com altas pontuações de encaixe molecular e estabilidade confirmada por dinâmica molecular.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência em modelagem molecular, software de docking (AutoDock) e plataformas de simulação (Gromacs).
- Acesso à infraestrutura computacional para geração de grades, docking e simulação de dinâmica molecular de sistemas proteína-ligante.
- Padronização de protocolos para preparação de ligantes, atribuição de cargas (Kollman) e salvamento de parâmetros de grade.
- Considerações de adaptação para diferentes sistemas receptores além do 1NMK, incluindo o reposicionamento centralizado da caixa de grade e análise específica por resíduo.
- As limitações incluem a dependência da precisão do campo de força (CHARMM 36) e das escalas de tempo de simulação para capturar eventos raros de ligação.
