Name: Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a infectar Pinus pinaster com o nematóide Bursaphelenchus xylophilus em sistemas in vitro e in vivo. Este protocolo permite isolar voláteis orgânicos induzidos e estudar respostas do hospedeiro à infecção.

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<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando a infecção por nematóides de pinheiro em Pinus pinaster

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Peneira de teste de 38 malhas</td><td>Retsch</td><td>60.131.000038</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurina (6-BAP)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>B0904</td><td></td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1302</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Clevenger</td><td>WINZER Laborglastechnik</td><td>25-000-02</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ácido indol-3-butírico (IBA)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>I0902</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Likens-Nickerson</td><td>VitriLab LDA.</td><td>c/IN29/32</td><td></td></tr><tr><td>Microbox recipientes redondos</td><td>Sac O2</td><td>O118/80+OD118</td><td></td></tr><tr><td>n-Pentano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00882</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M filme de vedação</td><td>MARCA</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Phyto ágar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Batata Dextrose Ágar</td><td>BD DIFCO</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi nº 24</td><td>Romed Holland</td><td>BLADE24</td><td></td></tr><tr><td>Schenk & Hildebrandt Meio de sal basal</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0225</td><td></td></tr><tr><td>Schenk & Mistura vitamínica de Hildebrandt</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0411</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de fibra SPME Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Supelco</td><td>57300-U</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de fibra SPME</td><td>Supelco</td><td>57330-U</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Tenax TA- tubos de aço inoxidável- condicionados + tampados</td><td>Markes International</td><td>C1-AAXX-5003</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção de pinus in vivo e in vitro com o nematóide bursaphelenchus xylophilus e isolamento de voláteis induzidos

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

O NMP se reproduz rapidamente em condições ideais, e os tempos de geração podem ser tão baixos quanto 4 dias, com cada fêmea deitada cerca de 80 ovos durante sua vida28. Usando a metodologia descrita acima, grandes quantidades de PWNs podem ser obtidas dependendo do crescimento do fungo. Dentro de um período de crescimento de 8 dias, os nemátodo do pinheiro podem ter um aumento de 100 vezes no número da população (Figura 1). Para aumentar a consistência nas quantidades de nemátodo do pinheiro, use do lado do pinheiro esterilizado, pois a contaminação com bactérias ou fungos desconhecidos afetará negativamente a população do nemátodo do pinheiro.
A infecção bem-sucedida de mudas de pinheiro com o PWN resultará em sintomas de PWD cerca de 20 dias após a infecção (Figura 2). No entanto, sabe-se que P. pinaster possui uma alta variabilidade genética na suscetibilidade à PCD, e variações no tempo de início dos sintomas são muito comuns3.
A parte aérea in vitro do pinus não apresenta essa variabilidade genética, e as condições ambientais e nutricionais são controladas e definidas de acordo com as necessidades do usuário. As culturas de brotos de pinheiro marítimo in vitro crescem bem em meio de alongamento SH, apresentando uma taxa de crescimento de cerca de 0,9 mm por semana6. Idealmente, os NMPs estéreis podem ser adicionados a brotos com pelo menos 5 cm (da base à agulha mais alta). Como os brotos de pinheiro in vitro são menores e a área de infecção do NMP é reduzida, o crescimento populacional do nematoide é menos expressivo, portanto, os tempos de duplicação podem ser entre 6 e 7 dias6. No entanto, agulhas cloróticas podem ser observadas dentro de um mês de co-cultura (Figura 3). Em comparação com os pinheiros cultivados em estufa, as culturas de brotos de pinheiro in vitro permitem a sincronização dos sintomas da PCD, controle da temperatura e fotoperíodo, controle do estado nutricional e prevenção de contaminação.
Mudas de P. pinaster com dois anos de idade apresentam rendimento de óleo essencial em torno de 0,2% ± 0,1% (v/peso fresco) e perfil volátil rico em α-pineno, β-pineno ou δ-3-careno, com variabilidade química regular. Atualmente, dois quimiotipos principais foram identificados, um em que o α-pineno e o β-pineno são dominantes e outro em que o α-pineno e o β-pineno compartilham dominância com o δ-3-careno5. Brotações in vitro de pinheiro-bravo podem ser cultivadas de acordo com o quimiotipo desejado, cujos voláteis são totalmente perfilados por CG-EM. Embora os perfis voláteis de voláteis obtidos por destilação-extração possam ser diferentes dos dos óleos essenciais, em P. pinaster, eles são semelhantes (Figura 5A). As técnicas de extração volátil são adequadas para avaliar as alterações induzidas nos perfis de metabólitos voláteis do pinus. As técnicas de captura volátil fornecem informações sobre os voláteis emitidos pelos pinheiros. Os perfis químicos das técnicas de SPME podem ser diferentes, mas as diferenças geralmente dependem da quantidade de material vegetal e dos voláteis aprisionados (Figura 5B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig01.jpg"> Figura 1: Crescimento in vitro do nematoide da madeira de pinheiro. (A) Cepa de Botrytis cinerea não esporulante cultivada em sementes de cevada hidratadas esterilizadas e (B) cultura in vitro de nematóides de madeira de pinheiro após alimentação com micélio fúngico. Barra de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig02.jpg"> Figura 2: Ensaios em casa de vegetação com mudas de pinheiro. (A) Mudas de Pinus pinaster de 2 anos sem e (B) com sintomas de doença da murcha do pinheiro. Barra de escala = 10 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig03.jpg"> Figura 3: Experimentos in vitro com microbrotos de pinheiro. Pinus pinaster em culturas de brotos in vitro (A) antes e (B) após a infecção pelo nematoide da madeira de pinheiro. A clorose como resultado da infecção por nematóides pode ser observada em agulhas de microshoot (setas). Barra de escala = 1,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig04.jpg"> Figura 4: Configuração para os diferentes sistemas de isolamento de voláteis. Isolamento de (A) óleos essenciais por hidrodestilação (aparelho de Clevenger), (B) voláteis por destilação-extração (aparelho de Likens-Nickerson) e voláteis de headspace por microextração em fase sólida (SPME) com (C) fibras ou (D) tubos embalados. Barra de escala = 10 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67149/67149fig05.jpg"> Figura 5: Cromatogramas representativos de voláteis de brotos de Pinus pinaster . (A) óleo essencial, (B) voláteis coletados por fibra de microextração em fase sólida e (C) voláteis emitidos usando tubos compactados. Identificado usando uma biblioteca de referência construída em laboratório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67149/67149fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily ...

infection-vivo-vitro-pines-with-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um protocolo para investigar o comportamento de acasalamento do nematoide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é apresentado. As características comportamentais de B. xylophilus são descritas no processo de acasalamento.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

O presente protocolo descreve um método para induzir a dispersão de juvenis de terceiro estágio (juvenis pré-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus em criptobiose por meio da regulação osmótica de íons cloreto de potássio (KCl). Este método pode fornecer suporte técnico para pesquisas sobre os mecanismos de resistência ao estresse de B. xylophilus.

Induzindo a entrada de juvenis de dispersão de terceiro estágio de Bursaphelenchus xylophilus na criptobiose por meio da regulação osmótica

O protocolo descreve a infecção de raízes de Solanum tuberosum com nematóides parasitas de plantas em condições de casa de vegetação in vivo e raízes transgênicas in vitro de batata para análise histoquímica da estrutura radicular por meio de microscopia óptica.

Infecção in vivo e in vitro de raízes de batata com nematóides parasitas de plantas para avaliação de alterações estruturais induzidas

Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

Um método push-pull para a recolha de voláteis de plantas é descrito. O método permite uma comparação dos voláteis induzidos pela alimentação herbívora, metil-jasmonato exógena, e danos mecânicos. Esta técnica também é usada para investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo.

Herbívoro induzida Voláteis Blueberry e planta-Intra Sinalização

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

Aprenda a infectar Pinus pinaster com o nematóide Bursaphelenchus xylophilus em sistemas in vitro e in vivo. Este protocolo permite isolar voláteis orgânicos induzidos e estudar respostas do hospedeiro à infecção.

Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos

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