Name: Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a identificar células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos Tmem119-EGFP usando microscopia confocal. Este método revela o papel das micróglia como reservatórios virais no sistema nervoso central.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Infecção por EcoHIV em camundongos Tmem119-EGFP para estudo de alterações microgliais

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
<li>González-Scarano, F., Martín-García, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The neuropathogenesis of AIDS.</a> Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Células de 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, Agulha RN de Cubo Pequeno, (Estilo de Ponta: 3, Comprimento da Agulha: 19.25 mm)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótica-Antimicótica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td><td>A Cepa de Laboratório Jackson</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina BioCoat Corning 75cm&sup2; Cantil de Cultura de Células com Pescoço Inclinado Retangular com Tampa Ventilada</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM com L-Glutamina, 4,5 g/L de Glicose e Piruvato de Sódio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Microcentrífuga de Tampa Rápida Biopur Safe-Lock Tubes</td> Lâminas <td>de</td> Aço Carbono de Borda Dupla 22600028 <td></td><td>Feather da Life</td></tr><tr><td>Technologies</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>BioReagentes Fisher&nbsp; Meios de Microbiologia: LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo humano recombinante anti-CD11b</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td> Seringa Injetora Intraocular <td>de diluição 1:50</td></tr><tr><td>(6.5 &micro; L), Agulha Removível</td><td>Hamilton</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit Cell</td><td>Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiSlicer&nbsp; Fatiador de tecido vibratório</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Adesivo de tecido Pro CA44</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro Specimen Retrievers</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-Iba1</td><td>de coelho Abcam</td><td>ab178847</td><td>1:500 diluição</td></tr><tr><td>RN Compression Fitting 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rata grávida</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chinelos SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de núcleo To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td> Tesoura Vannas <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision</td><td>Instruments 500086</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de células infectadas por ecohiv em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

Um fragmento de mScarlet (1858 pb) contendo sítios enzimáticos de "Cla1" na extremidade 3' e "Not1" na extremidade 5' foi inserido no vetor lentiviral pNL4-3-EcoHIV (Figura 1). Para validar a expressão de EcoHIV-mScarlet, células cerebrais primárias isoladas do córtex de embriões E18 de ratos foram tratadas com EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU / mL) por 6 dias in vitro. Os dados da Figura 2 mostraram que os sinais fluorescentes vermelhos de mScarlet estavam localizados principalmente em tipos gliais de células com base nas diferentes morfologias celulares. Além disso, a marcação de CD11b/c e Iba1 (marcadores celulares para microglia) mostrou que os sinais mScarlet foram co-localizados com células CD11b/c + e/ou Iba1+. Os dados indicaram que a microglia foi o principal tipo de célula de distribuição EcoHIV-mScarlet in vitro. Não houve infecção neuronal significativa nas células cultivadas (Figura Suplementar 1). 
Em seguida, a infecção de EcoHIV-mScarlet foi testada em células gliais mistas primárias de camundongos adultos. Para fazer isso, células gliais mistas foram primeiro isoladas e purificadas de camundongos adultos (2 meses) e infectadas com EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU / mL) por 2 dias. As imagens na Figura 3 mostraram que o EcoHIV-mScarlet infectou com sucesso a glia de camundongos adultos.
Para abordar ainda mais o padrão de distribuição do EcoHIV-mScarlet no cérebro do camundongo, especificamente para identificar o tipo de célula infectada, o EcoHIV-mScarlet foi injetado retro-orbital na linha de camundongos knock-in Tmem119-EGFP na qual a microglia foi especificamente marcada com sinais EGFP sem quaisquer outros tipos de conflitos de macrófagos5. Os resultados na Figura 4 (também na Figura Suplementar 2) mostram que os sinais de fluorescência vermelha mScarlet foram observados em células EGFP-positivas, sugerindo a microglia como o principal tipo de célula de expressão de EcoHIV em cérebros de camundongos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg"> 
Figura 1: O mapa vetorial do EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg"> 
Figura 2: A infecção por EcoHIV-mScarlet em células cerebrais primárias de ratos. (A, E) Imagens representativas da coloração CD11b / c em células cerebrais primárias. As células cerebrais foram isoladas de embriões de ratos E18 e infectadas com o vírus EcoHIV-mScarlet por 6 dias. (B, F) Imagens representativas de sinais fluorescentes mScarlet de células cerebrais in vitro . (C, G) Imagens representativas da coloração Iba1 em células cerebrais primárias. (D, H) Imagens mescladas de marcação tripla de CD11b / c, mScarlet e Iba1. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg"> 
Figura 3: Infecção por EcoHIV-mScarlet em células gliais mistas primárias de camundongos. (A, B) Imagens confocais representativas da distribuição de mScarlet in vitro. As células primárias mistas da glia foram isoladas de camundongos C57BL6 adultos (2 meses de idade) e cultivadas por 2 semanas antes da infecção viral. O EcoHIV-mScarlet foi adicionado ao meio de cultura por dois dias e capturou as imagens sob a objetiva de 60× do microscópio confocal. Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribuição de EcoHIV-mScarlet na linha de camundongos knock-in Tmem119-EGFP . (A, B) Imagens mescladas de sinais mScarlet / EGFP / ToPro3 em seções cerebrais. A moldura amarela indica a área de destino de (B). Barra de escala: 300 μm. (C) Imagem representativa da distribuição de mScarlet na camada plexiforme externa da região olfativa da linha de camundongos knock-in Tmem119-EGFP . (D) Imagem representativa da distribuição do EGFP. Os sinais fluorescentes foram localizados em células de microglia na linha de camundongos knock-in Tmem119-EGFP . (E) Imagem representativa da coloração do núcleo TO-PRO-3. Barras de escala: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Coloração MAP2 e MOG de células cerebrais primárias de ratos infectadas com o vírus EcoHIV-mScarlet. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Imagens confocais da infecção por EcoHIV-mScarlet na linha de camundongos knock-in Tmem119-EGFP . Barras de escala: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 1: Sequência de DNA do plasmídeo EcoHIV-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Este artigo demonstra um método para visualizar e quantificar a motilidade e o contato da microglia com pontos pós-sinápticos na retina usando microscopia confocal de disco giratório.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

Este protocolo combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única para isolar e caracterizar os estados das células microgliais no cerebelo de cérebros de camundongos pós-natais precoces. Ele usa dissociação enzimática, centrifugação de Percoll e imunocoloração para revelar a heterogeneidade da microglia e melhorar a compreensão de seus papéis no desenvolvimento e doença cerebelar.

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Aprenda a identificar células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos Tmem119-EGFP usando microscopia confocal. Este método revela o papel das micróglia como reservatórios virais no sistema nervoso central.

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Explorar mais vídeos