Name: Um modelo de camundongo de cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas e impulsionadas por mecanotransdução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprenda a criar um modelo murino de cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas aplicando tensão mecânica em incisões cicatrizantes. Este método utiliza dispositivos especializados para induzir mecanotransdução e analisar respostas celulares ao estímulo mecânico.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mL PYREX Copo de grifo</td><td>Milipore Signma</td><td>CLS1000100</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Exacta mini aparador</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoClip System</td><td>Fine Surgical Instruments</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de álcool isopropílico da marca BD</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR (0,5 mg/mL)</td><td>Buprenex, Indivior Inc.</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>C57/BL6 fêmeas (6&ndash; 8 semanas de idade)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>gaze estéril Covidien</td><td>Fisher Scientific</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas não aderentes Covidien TelfaTM</td><td>Fisher Scientific, Covidien</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>Régua cirúrgica odontológica</td><td>DoWell Dental Products</td><td>S1070</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório (Loção Removedora de Pêlos Nair)</td><td>Church& Dwight, CVS</td><td>339823</td><td></td></tr><tr><td>Solução de etanol a 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Cooperation</td><td>Microsoft.com</td><td>programa de software&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ, Wayne Rasband</td><td>imagej.net</td><td>programa de software&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia por inalação</td><td>VetEquip</td><td>922130</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris 4&frac12; in. inoxidável</td><td>McKesson</td><td>43-2-104</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Dechra Produtos Veterinários</td><td>17033-094-25</td><td></td></tr><tr><td>Kaka industrial MUB-1</td><td>Kaka Industrial&nbsp;</td><td>173207</td><td>Só é necessário se não houver espaço para fabricante ou oficina de fabricação disponível&nbsp;</td></tr><tr><td>Expansor Palatino Rápido Leone - 13 mm</td><td>Great Lakes Dental Technologies</td><td>125-004</td><td>A chave necessária para expandir e controlar o dispositivo virá com este produto na caixa</td></tr><tr><td>Campo repelente de líquidos 75 x 90 cm com furo adesivo 6 x 9 cm</td><td>Omnia S.p.A.</td><td>12.T4362</td><td></td></tr><tr><td>Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx</td><td>Medequip Depot D707N, Fisher Scientific</td><td>NCO835822</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas 5 pol. com mandíbulas serrilhadas</td><td>McKesson</td><td>43-2-842</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad Holdings, LLC</td><td>graphpad.com</td><td>programa de software&nbsp;</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica Puralube</td><td>Dechra, NDC</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>R studio Desktop</td><td>RStudio PBC</td><td>rstudio.com</td><td>programa de software&nbsp;</td></tr><tr><td>Marcador cirúrgico de pele</td><td>McKesson</td><td>19-1451_BX</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 3 M</td><td>VWR</td><td>56222-191</td><td>curativo adesivo de espuma&nbsp;</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento Thermo-peep</td><td>K& H, Pinça de Tecido Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4&frac34; in. inoxidável 1 x 2 dentes</td><td>Mckesson</td><td>43-2-775</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (3 M)</td><td>Saint Paul, MN</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de camundongo de cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas e impulsionadas por mecanotransdução

A Mouse Model of Mechanotransduction-driven, Human-like Hypertrophic Scarring

Para demonstrar claramente o uso efetivo do protocolo HTS e identificar resultados "positivos" bem-sucedidos, o modelo foi estabelecido conforme mostrado na Figura 3A. No estudo representativo, havia dois grupos: Sem controle de estiramento (n = 6) e grupo HTS de estiramento mecânico (n = 6), onde níveis semelhantes aos humanos de tensão mecânica foram induzidos através da incisão para gerar um HTS, visto na Figura 3B, C. Dentro do plano experimental dado na Figura 3A-C, foi tirada uma fotografia macroscópica da cicatriz nos PODs 5, 9, 15 e 19. As cicatrizes foram traçadas com ImageJ e analisadas quanto à largura média das cicatrizes nos diferentes momentos (Figura 3D). As larguras médias das cicatrizes foram representadas graficamente em relação ao tempo e entre os grupos na Figura 3E. Após a aplicação de esforço mecânico no DPO 5, onde as cicatrizes não foram significativamente diferentes entre o Stretch e o Controle, o Grupo Stretch exibiu cicatrizes significativamente mais largas do que o Controle, atingindo um pico de largura de 0,99 mm no DPO 9 (p = 0,045). Essa largura de cicatriz significativamente maior em comparação com o controle continuou no DPO 15 (p = 0,043) e 19 (p = 0,045). Recomenda-se que a fotografia macroscópica seja tirada apenas nos dias em que o dispositivo HTS precisa ser removido (ou seja, o dispositivo HTS atingiu a expansão máxima e precisa ser recolocado ou durante o explante), pois o dispositivo bloqueia a fotografia adequada da cicatriz. Neste protocolo, imagens e análises de largura de cicatriz em vários pontos de tempo fornecem uma visão mais clara da progressão da ferida do modelo para o leitor.
A análise do tecido HTS pode ser feita de várias maneiras, como coloração IHC para marcadores fibróticos, coloração H &amp; E e tricrômico para examinar as áreas histológicas da cicatriz, coloração picrosirius red para avaliar a arquitetura de colágeno das cicatrizes e outros métodos para análise de feridas - todos os quais têm sido usados pelo laboratório historicamente6, 8,21,24,25,27,28 (Figura 4). A Figura 4 mostra as características histológicas do tecido HTS, como tecido cicatricial elevado (Figura 4A), perda de estruturas anexiais e folículos pilosos (Figura 4B), alinhamento das fibras colágenas na direção da carga mecânica (Figura 4C) e verticilos de colágeno (Figura 4F). A Figura 4 também demonstra a coloração imuno-histoquímica da densidade de mastócitos e vasculatura do HTS murino e a compara com o tecido HTS humano (Figura 4D, E, G, H). Além disso, a análise da cicatriz HTS pode ser feita com análise de célula única se o tecido for colhido, preparado e levado para um núcleo de bioinformática imediatamente após a excisão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67156/67156fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparação do dispositivo HTS e do dorso do camundongo. (A) Processo de modificação de um expansor palatino de 13 mm para criar o dispositivo HTS, (1) mostrando a estrutura inicial do expansor, (2) flexão dos braços 90° para cima para os braços e para baixo para os braços inferiores quando o dispositivo fica plano, (3) resultado da flexão inicial, onde os braços agora estão perfeitamente paralelos ao corpo do dispositivo, (4) flexão dos braços para formar o dispositivo final com medições; Os braços devem ser dobrados 90° na página, conforme visto no dispositivo final (5). (B) O dispositivo HTS totalmente montado de vários ângulos, tanto não estendidos quanto estendidos. (C) Etapas sequenciais para preparar o dorso do camundongo: (1) estado inicial com pelo, (2) após o barbear e (3) pós-aplicação de pasta depilatória. (D) Procedimento para criar a incisão dorsal: (1) marcar o local da incisão com uma diretriz de 2 cm, (2) fazer a incisão, (3) suturar a ferida, (4) aplicar a gaze Telfa e (5) fixar com curativo adesivo. (E) Fotografia macroscópica da (1) incisão e (2) após a sutura da incisão fechada. Abreviatura: HTS = cicatriz hipertrófica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67156/67156fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67156/67156fig02.jpg"> 
Figura 2: Posicionamento e alongamento do dispositivo HTS. (A) Ilustração do posicionamento correto do dispositivo HTS no dorso do camundongo, garantindo o alinhamento adequado com o local da incisão. A imagem à esquerda mostra o posicionamento do dispositivo visto de uma posição posterior. A imagem à direita mostra o posicionamento do dispositivo visto lateralmente. (B) Ilustração da fixação do dispositivo HTS: (1) colocação inicial, (2) localização das suturas, (3) localização dos grampos da pele. (C) Demonstração de alongamento do dispositivo HTS com a chave do dispositivo HTS rotulada: (1) configuração inicial, (2) aplicação de tensão, (3) o estado expandido final projetado para aplicar tensão mecânica consistente na incisão de cicatrização para promover a formação de cicatrizes hipertróficas, 2 mm de expansão aplicada. (D) Fotografia bruta da aplicação de tensão ao dispositivo HTS, com a chave do dispositivo HTS rotulada. (E) Fotografia bruta do rato totalmente enfaixado. Abreviatura: HTS = cicatriz hipertrófica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67156/67156fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67156/67156fig03.jpg"> 
Figura 3: Aplicação de esforço mecânico para desenvolver cicatrizes. (A) Linha do tempo do procedimento experimental desde a criação da incisão (DPO 0) até a aplicação do esforço mecânico (DPO 4) e durante o período de alongamento (DPO 5 a DPO 19), culminando no explante tecidual (DPO 19). (B) Ilustração dos dois grupos: grupos Sem Controle de Estiramento e Alongamento Mecânico HTS. (C) Esquema transversal que descreve a diferença na resposta tecidual entre os grupos No Stretch Control e Stretch HTS. (D) Imagens macroscópicas representativas de cicatrizes dos grupos No Stretch Control e Stretch HTS nos dias pós-operatórios (DPO 5, 9, 15 e 19), com as cicatrizes hipertróficas traçadas em uma linha pontilhada amarela. (E) Análise quantitativa da largura média da cicatriz ao longo do tempo, demonstrando diferenças significativas no desenvolvimento da cicatriz entre os grupos Sem Alongamento e Alongamento, com barras de erro representando o desvio padrão. As diferenças significativas são marcadas com asteriscos (*). A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de duas vias. Valores de *p &lt; 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Abreviaturas: HTS = cicatriz hipertrófica; DPO = dia de pós-operatório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67156/67156fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67156/67156fig04.jpg"> 
Figura 4: Histologia da cicatriz. Esta histologia de cicatriz murina foi colhida após 2 semanas de estresse mecânico em nosso trabalho publicado anteriormente9,26. (A) A imagem maior mostra a imagem histológica H &amp; E da seção transversal da cicatriz, enquanto o canto inferior direito é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando como a região da cicatriz é elevada. (B) A imagem maior mostra a imagem histológica H &amp; E da seção transversal da cicatriz, enquanto o canto inferior direito é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando como a região da cicatriz demonstra uma perda de estruturas anexiais e folículos pilosos. (C) A imagem maior mostra a imagem vermelha picrosirius da seção transversal da cicatriz, enquanto a parte inferior direita é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando fibras colágenas alinhadas na direção da carga mecânica. (D) A imagem maior mostra imagens de imuno-histoquímica de CD117 em tecido HTS murino, enquanto o canto inferior direito é de imagens de imuno-histoquímica de CD117 em tecido humano, demonstrando densidade de mastócitos comparável ao tecido HTS humano. (E) A imagem maior mostra imagens de imuno-histoquímica CD31 da vasculatura em tecido HTS murino, enquanto o canto inferior direito é imagem de imuno-histoquímica CD117 em tecido humano, demonstrando densidade de mastócitos comparável ao tecido HTS humano. (F) Verticilos de colágeno, vistos em cicatrizes hipertróficas humanas maduras na imagem no canto inferior direito, também são vistos em cicatrizes murinas carregadas após 24 semanas na região circulada em imagens murinas de H &amp; E. (G) Imagens macroscópicas representativas de cicatrizes de um grupo Controle (Incisão + Sem Alongamento), um grupo Controle de Estiramento (Sem Incisão + Estiramento) e um grupo Alongamento HTS. (H) Mostra imuno-histoquímica comparando o grupo Controle (Incisão + Sem Alongamento) e o grupo Stretch HTS. Usando uma co-coloração para marcadores fibróticos pEPF, aSMA e YAP com DAPI, há um aumento nos marcadores fibróticos no grupo HTS. A-F foram adaptados de Aarabi, S. et al.9. G,H foram adaptados de Mascharak, S. et al. Reproduzido com permissão da FASEB26. Abreviaturas: HTS = cicatriz hipertrófica; H&amp;E = hematoxilina e eosina; pEPF = Fibroblasto Engrailed-positivo; aSMA = actina do músculo liso alfa; YAP = proteína associada a Yes; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67156/67156fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um modelo de camundongo de cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas e impulsionadas por mecanotransdução

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