Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

No campo da engenharia de tecidos cartilaginosos e medicina regenerativa, ainda há a necessidade de melhorar os resultados biológicos e funcionais em termos de melhoria do tratamento contínuo e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A pesquisa pré-clínica atual aponta para o uso potencial de condroprogenitores derivados da cartilagem como uma opção viável para a cicatrização da cartilagem. A pesquisa atual inclui estratégias para aumentar ainda mais o potencial condrogênico, mantendo a potência hipertrófica mais baixa por meio do uso de fatores de crescimento adicionais e técnicas de recombinação de genes.

Os condroprogenitores enfrentam desafios experimentais, incluindo falta de consenso sobre nomenclatura, diversas técnicas de isolamento, dificuldades de caracterização, variabilidade nas condições de cultura e compreensão limitada dos mecanismos subjacentes. Demonstrar clinicamente que os condroprogenitores produzem resultados positivos em comparação com as células comumente usadas pode reduzir significativamente a carga global associada a patologias relacionadas à cartilagem. Evolução de terapêuticas aprimoradas usando alternativas livres de células, como vesículas extracelulares derivadas de progenitores, e usando estratégias recombinantes para a regeneração de cartilagem hialina genuína.

Para começar, obtenha articulações tibiofemorais ou do joelho de doadores humanos em 1X PBS em condições estéreis e, em seguida, transfira as articulações colhidas para a almofada estéril no capô. Para estabilizar as articulações, segure o osso subcondral com a cartilagem voltada para cima. Usando uma lâmina de bisturi número 22, colha aparas de cartilagem retangulares das áreas que não suportam peso.

Corte a cartilagem em seções medindo oito milímetros por 10 milímetros da camada superficial até a camada mais profunda. Depois de lavar as fatias com PBS, coloque-as em uma placa de Petri contendo um a dois mililitros de meio de Eagle modificado por Dulbecco simples, ou DMEM. Em seguida, usando uma lâmina de bisturi número 22, pique as fatias de cartilagem em um tamanho menor que um milímetro cúbico.

Para começar, obtenha cartilagem picada de articulações de joelho humano extraídas. Coloque a cartilagem picada em um frasco T25 vertical contendo 10 mililitros de DMEM/F-12 sem soro com 0,15% de colagenase tipo II para digestão enzimática. Deixar o balão em repouso numa incubadora de dióxido de carbono durante 12 a 14 horas.

Após a digestão durante a noite, transfira o meio contendo os condrócitos liberados para um tubo de centrífuga estéril fresco. Use um filtro de células para separar as células dos detritos. Adicione um volume igual de DMEM/F-12 com soro bovino fetal a 10%, ou FBS.

Centrifugue as células filtradas a 1.200 G por cinco minutos a 37 graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, reconstituir o pellet em um mililitro de meio. Conte as células viáveis usando um ensaio de exclusão de azul de tripano.

Em seguida, carregue os condrócitos em um frasco T25 a uma concentração de 10.000 células por centímetro quadrado. Expanda as células para o número de passagem necessário usando DMEM/F-12 contendo 10% de FBS. Atualize o meio a cada três dias antes de colher as células na subconfluência usando 0,125% de tripsina contendo EDTA.

Os condrócitos aderiram imediatamente após o carregamento e passaram de uma forma arredondada de paralelepípedos para uma aparência fibroblástica à medida que se expandem. Para começar, obtenha aparas de cartilagem de articulações tibiofemorais ou do joelho humanas extraídas. Submeter as aparas de cartilagem à digestão enzimática sequencial durante a noite, primeiro usando 0,2% de pronase por três horas, seguido de 0,04% de colagenase tipo II por 12 horas em banho-maria agitado mantido a 37 graus Celsius.

Em seguida, cubra o número necessário de poços de uma placa de seis poços com 1,5 mililitros da solução de fibronectina PBS. Feche bem o prato e leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a placa de seis poços revestida com fibronectina da geladeira.

Depois de remover o excesso de fibronectina, adicione dois a três mililitros de meio DMEM/F-12 simples nos poços revestidos. Semeie os condrócitos libertados nos poços revestidos a uma densidade de 4 000 células por alvéolo e deixe a placa intacta durante 20 minutos. Após a incubação, aspirar o excesso de meio e as células não aderentes.

Adicione dois a três mililitros de DMEM/F-12 com 10% de soro bovino fetal aos poços. Mantenha as células aderentes em condições de cultura padrão por 10 a 12 dias para obter clones de células progenitoras condrogênicas, ou CPC, e, em seguida, isole os clones de CPC usando 0,125% de tripsina EDTA por 180 segundos e, em seguida, repita na proporção de um clone por cinco centímetros quadrados. Expanda os CPCs policlonais enriquecidos para a confluência necessária.

Os condrócitos submetidos a um ensaio de adesão à fibronectina apresentam crescimento clonal, atingindo uma população que dobrou de cinco no dia 10. Para começar, obtenha os explantes de cartilagem raspada da articulação articular colhida em meio DMEM/F-12 suplementado. Coloque a placa com explantes dentro de uma incubadora de dióxido de carbono ajustada a 37 graus Celsius por 48 horas.

Após dois dias, transfira os explantes para um tubo centrífugo contendo 10 mililitros de solução de colagenase a 0,1% para digestão enzimática. Incube o tubo a 37 graus Celsius por duas horas. Após a digestão, enxágue os explantes com 1X PBS e devolva-os aos mesmos poços na placa contendo o meio DMEM / F-12 suplementado fresco.

Manter a placa na incubadora em condições de cultura padrão e monitorizar a migração de condroprogenitores nos dias subsequentes. Assim que os explantes atingirem a subconfluência, colha as células condroprogenitoras mesenquimais, ou MCPs, usando solução de EDTA de tripsina a 0,125%. Expanda os MCPs usando o meio DMEM/F-12 suplementado.

Os condroprogenitores começam a migrar da borda do explante no dia 10 da cultura, exibindo um padrão de crescimento em forma de fuso com expansão adicional.