Name: Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a isolar condrócitos e condroprogenitores de cartilagem articular humana usando digestão enzimática e ensaios de adesão à fibronectina. Este método avança estratégias terapêuticas para regeneração cartilaginosa.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento de condroprogenitor e condrócitos da cartilagem articular humana

<ol><li>Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+effectiveness+of+various+treatments+for+cartilage+defects+compared+to+microfracture%3A+A+network+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cartilage+Joint+Preserv%22%5BJournal%5D)">Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials.</a> J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).</li>
<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of articular cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Brittberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+articular+cartilage+repair-An+up-to-date+review%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Joint%22%5BJournal%5D)">Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review.</a> Annals of Joint. 3 (0), (2018).</li>
<li>Muthu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cartilage+regeneration%3A+emerging+hypotheses+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies.</a> Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).</li>
<li>Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+osteogenic+and+chondrogenic+differentiation+of+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).</li>
<li>Fernandez-Moure, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+cortical+bone%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).</li>
<li>Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+and+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review.</a> J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).</li>
<li>Zha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+in+cartilage+regeneration%3A+From+characterization+to+application%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application.</a> NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).</li>
<li>Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+sulfation+motifs+as+putative+biomarkers+for+isolation+of+articular+cartilage+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells.</a> J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+of+articular+cartilage+contains+a+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).</li>
<li>Williams, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+clonal+characterization+of+a+progenitor+cell+sub-population+in+normal+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage.</a> PloS One. 5 (10), e13246(2010).</li>
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<li>Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+chondroprogenitors+maintain+telomerase+activity+and+Sox9+expression+during+extended+monolayer+culture+and+retain+chondrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential.</a> Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).</li>
<li>Fellows, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+divergent+progenitor+cell+sub-populations+in+human+osteoarthritic+cartilage%3A+the+role+of+telomere+erosion+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence.</a> Sci Rep. 7, 41421(2017).</li>
<li>Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fresh+chondrocytes%2C+cultured+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage.</a> Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).</li>
<li>Korpershoek, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+highly+proliferative+and+multipotent+meniscus+progenitors+through+differential+adhesion+to+Fibronectin%3A+A+novel+approach+in+meniscus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).</li>
<li>Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+regional+human+meniscus+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).</li>
<li>Koelling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+chondrogenic+progenitor+cells+from+repair+tissue+during+the+later+stages+of+human+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).</li>
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<li>Xue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+stem+cells+in+different+subtypes+of+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue.</a> Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+equine+articular+cartilage+progenitor+cells+and+bone+marrow-derived+stromal+cells+as+potential+cell+sources+for+cartilage+repair+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse.</a> Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).</li>
<li>Elsaesser, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+migrative+subpopulation+of+adult+human+nasoseptal+chondrocytes+with+progenitor+cell+features+and+their+potential+for+in+vivo+cartilage+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies.</a> Cell & Biosci. 6, 11(2016).</li>
<li>Batschkus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+secretome+of+human+chondrogenic+progenitor+cells+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry.</a> Ann Anat. 212, 4-10 (2017).</li>
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<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarticular+injection+of+allogenic+chondroprogenitors+for+treatment+of+osteoarthritis+in+rabbit+knee+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model.</a> J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).</li>
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<li>Carluccio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+activated+by+platelet+lysate+in+human+articular+cartilage+as+a+tool+for+future+cartilage+engineering+and+reparative+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies.</a> Cells. 9 (4), E1052(2020).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+delivery+of+extracellular+vesicles+secreted+by+chondrogenic+progenitor+cells+from+MRL%2FMpJ+superhealer+mice+enhances+articular+cartilage+repair+in+a+mouse+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model.</a> Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93(2020).</li>
<li>Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+osteochondral+defects+through+the+differentiation+potential+of+cartilage+stem%2Fprogenitor+cells+cultivated+on+porous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds.</a> Cells. 10 (12), 3536(2021).</li>
<li>Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiological+assessment+of+osteo-arthrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Radiological assessment of osteo-arthrosis.</a> Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).</li>
<li>Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+articular+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+non-diseased+and+osteoarthritic+knee+joints+to+assess+superiority+for+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy.</a> Acta Histochem. 122 (6), 151588(2020).</li>
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<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+cartilage-derived+chondrocytes+and+chondroprogenitors+display+a+greater+commitment+to+chondrogenesis+than+adult+cartilage+resident+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells.</a> PloS One. 18 (4), e0285106(2023).</li>
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<li>Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%2C+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+and+chondrocytes+to+determine+cell+superiority+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration.</a> Acta Histochem. 123 (4), 151713(2021).</li>
<li>Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+for+cartilage+repair+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthopaed%22%5BJournal%5D)">Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models.</a> J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22-lâmina de bisturi;</td><td>PLACA DE VIDRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DE 6 poços</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>J6012</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>130223</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B (2 &mu; g/mL).</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico (62 &mu; g/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>BC CytoFLEX LX citômetro de fluxo&nbsp;</td><td>Software BECKMAN COULTER</td><td>CYTExpert Versão 2.5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA ALDRICH&</td><td>nbsp; C34006</td><td></td></tr><tr><td>CD105-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561443 <tr><td>CD106-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 551147 <tr><td>CD14-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555397 <tr><td>CD29-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 559883 <tr><td>CD34-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>CD45-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td> 347463</tr><tr><td>CD49b-FITC</td><td>MILTENYL BIOTEC&</td><td>nbsp; MACS 130/100337</td><td></td></tr><tr><td>CD49e-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555617 <tr><td>CD73-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 550257 <tr><td>CD90-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>561970</td><td></td></tr><tr><td>Contador</td><td>de células DE NOVIX</td><td>Cell Drop BF</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>HIMEDIA</td><td>TCP024</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora CO2&nbsp;</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>MODEL-371</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo X (COL10A1), fator de transcrição relacionado a Runt (RUNX2), Fator de Transcrição SRY-Box 9 (SOX-9), Agrecan (ACAN) e Colágeno tipo II (COL2A1)&nbsp;</td><td>EUROGENTEC, BÉLGICA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>WORTHINGTON</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>D8900-1L</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas ELISA</td> DISPOSITIVOS <td>MOLECULARES</td><td>Leitor SpectraMax i3x Fast</td><td></td></tr><tr><td>Green</td><td>FISHER SIENTIFIC</td><td>2353459</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>CLOUD CLONE CORP</td><td>APA551Hu01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina (10 &micro; L/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de síntese de primeira fita</td><td>TAKARA BIO</td><td>6110A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39411</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>M8787</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>SIGMA</td><td>1320065</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline)</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&nbsp;</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>Termociclador Quantstudio 12K Flex&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100 UI/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red</td><td>ALFA AESAR</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário (colágeno de camundongo tipo II)</td><td>DSHB</td><td>DSHB II II6B3</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>ROCHE</td><td>10165913103</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA reagente</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador</td><td>ELANPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniKit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39962</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário (Anticorpo IgG Anti-Camundongo de Cabra, conjugado HRP)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria agitador&nbsp;</td>Kits de diferenciação <td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemPro&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>1007201, A1007001 e A1007101</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Azul&nbsp;</td><td>EUROGENTEC</td><td>UF-LSMT-B0701</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>ABCAM</td><td>ab277760</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de Tecidos Petrídish</td><td>TARSONS</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Toluidina</td><td>QUALIGENS</td><td>2040</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Triphan&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

Isolation of Chondrocytes and Chondroprogenitors Using Fibronectin Adhesion and Migratory Assay

A partir de 86,9 mg de fatias de cartilagem, observou-se um rendimento de células de condrócitos de 1,72 x 105 células. Após o carregamento, os condrócitos aderem prontamente, apresentando uma aparência inicial de paralelepípedos arredondados e transformando-se em um estado fibroblástico após a expansão adicional (Figura 1 A,B). A semeadura desses condrócitos em placas de fibronectina normalmente resulta em 2% de adesão, com cada célula passando por crescimento clonal (Figura 2 C, D), atingindo uma duplicação populacional de 5 nos dias 10-12 (32 células / clone). Os clones dentro da área de 10 cm² são combinados e expandidos até a passagem necessária para a produção de FAA-CPs. Os explantes de cartilagem, mantidos em cultura após a incubação da colagenase, exibem soltura da matriz extracelular, e a migração é geralmente observada já no7º dia (Figura 2E). Tanto os FAA-CPs quanto os MCPs exibem uma estrutura fusiforme, uma característica comumente associada aos BM-MSCs, adquirindo uma estrutura semelhante a um favo de mel antes da confluência (Figura 1E, F).
Os três tipos de células isoladas, ou seja, condrócitos, FAA-CPs e MCPs, são monitorados de perto usando imagens de contraste de fase. Os FAA-CPs são transferidos somente após a confirmação de cinco duplicações populacionais.
A caracterização fenotípica das células isoladas e expandidas normalmente inclui análise de citometria de fluxo para marcadores putativos de condrogênese, ou seja, CD146 e CD166, bem como análise de expressão gênica para marcadores de condrogênese (SOX-9, ACAN, COL2A1), o marcador de fibrocartilagem COL1A1 e marcadores de hipertrofia (RUNX2 e COL10A1). Todos os três grupos de células exibem alta expressão (&gt;95%) de CD105, CD73 e CD90; expressão baixa a negativa de CD34 e CD45; e alta expressão (&gt;98%) de CD166, com expressão moderada e dependente de doador de CD146 (40%-75%) (Figura 2A).
Os resultados de qRT-PCR mostram expressão comparável e alta de SOX-9, ACAN e também COL1A1, um marcador de fibrocartilagem, pois as células são cultivadas antes da avaliação (Figura 2B). Para confirmação da condrogênese, a captação positiva de complexos laranja-vermelho nas áreas contendo GAG após Safranina O e complexos azulados a arroxeados após Azul de Alcian e Azul de Toluidina é observada em todos os grupos de células, com maior proporção nos grupos FAA-CP e MCP. A análise imuno-histoquímica dos pellets diferenciados condrogênicos para colágeno tipo II mostra captação fibrilar acastanhada nos três grupos (Figura 3). Além disso, a análise de GAG/DNA também mostrou confirmação da diferenciação condrogênica com os grupos FAA-CP exibindo maior expressão (Figura 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig01.jpg"> 
Figura 1: Isolamento e caracterização de condrócitos e condroprogenitores. O algoritmo do estudo descreve o isolamento de três grupos de células e suas características morfológicas sob um microscópio de contraste de fase imediatamente após o isolamento e após alguns dias de expansão. (A) Os condrócitos recém-isolados se ligam às culturas aderentes durante os primeiros dias da cultura, adquirindo uma aparência fibroblástica com maior expansão (B). (C) Os condrócitos submetidos a um ensaio de adesão à fibronectina apresentam crescimento clonal, atingindo uma população que dobrou de 5 no dia 10 (D). (E) Os condroprogenitores migram da borda do explante no dia 10 da cultura e exibem um padrão de crescimento em forma de fuso com expansão adicional (F). Ampliação da imagem de contraste de fase: 10x; Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig02.jpg"> 
Figura 2: Dados de caracterização molecular. (A) Análise de citometria de fluxo para marcadores MSC positivos e negativos e potenciais marcadores de condrogênese. (B) Dados de expressão de RT-PCR para os três grupos de células para análise da expressão gênica de marcadores condrogênicos e hipertróficos. (C) Análise total de GAG / DNA dos pellets diferenciados condrogênicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig03.jpg"> 
Figura 3: Coloração confirmatória após diferenciação condrogênica. Safranina O e análise imuno-histoquímica para colágeno tipo II entre os três grupos celulares. Barras de escala: para ampliação de 10x, 50 μm; Ampliação de 40x, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

Chondroprogenitor cells (CPCs), recently identified as a distinct subpopulation, exhibit promise due to their mesenchymal properties, heightened ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

As células-tronco mesenquimais da almofada de gordura infrapatelar (IFP-MSCs) podem ser facilmente isoladas da almofada de gordura infrapatelar da articulação do joelho. Eles proliferam bem in vitro, formam colônias de UFC-F e se diferenciam em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas. Aqui, a metodologia para o isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabra é fornecida.

Isolamento, Expansão e Diferenciação de Células-Tronco Mesenquimais do Coxim de Gordura Infrapatelar da Articulação Sufocante de Cabra

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Nós descrevemos um ensaio qualitativo para a adesão e invasão de levedura ágar como uma medida de diferenciação invasivo e pseudohyphal. Este ensaio simples pode ser usado para avaliar o fenótipo invasivo de mutantes diversas, bem como as pistas efeitos ambientais e vias de sinalização na diferenciação de levedura.

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha - uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Aprenda a isolar condrócitos e condroprogenitores de cartilagem articular humana usando digestão enzimática e ensaios de adesão à fibronectina. Este método avança estratégias terapêuticas para regeneração cartilaginosa.

Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

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