Name: Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a fabricar hidrogéis de colágeno com padrão nanofibrilar por extrusão com cisalhamento para engenharia de tecidos. Este método controla a organização das fibrilas sem equipamentos especializados.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fabricação de colágeno nanofibrilar projetado com padrão direcionado

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Colágeno I, Alta Concentração, Cauda de Rato</td><td>Corning</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000-U microscópio</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-U&nbsp;</td><td>Microscópio invertido</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Extra Grossas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-267-005</td><td>Funciona bem para superfície de extrusão de colágeno</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Microscópio eletrônico de varredura</td></tr><tr><td>Conjunto de ferramentas de corte de vidro Ponta de carboneto de alimentação de óleo estilo lápis 2mm-20mm</td> Opção <td>de B07Y1D243H</td><td>Amazon/MOARMOR</td><td>para um cortador de vidro</td></tr><tr><td>Agulhas de ponta romba Hamilton Kel-F Hub (Luer Lock, 22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>Agulhas para extrusão de colágeno</td></tr><tr><td>Corrediça H 3-D</td><td>Schott</td><td>NC0782819</td><td>Lâminas hidrofóbicas</td></tr><tr><td>PBS Comprimidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise de celulose sem costura&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Clipes de Diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Synthware Cortador de Vidro</td><td>Synthware</td><td>31-501-927</td><td>Opção para um cortador de vidro</td></tr></tbody></table>

produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Este protocolo descreve uma técnica de extrusão baseada em cisalhamento simples para a fabricação de hidrogéis de colágeno compostos por nanofibrilas orientadas alinhadas (Figura 2) ou aleatoriamente (Figura 3). A padronização de nanofibrilas depende do controle preciso das forças de cisalhamento, que é alcançada por meio da modulação combinada da velocidade da seringa e da taxa de extrusão de colágeno. Os valores ideais para induzir o alinhamento das fibrilas foram previamente determinados como uma velocidade de seringa de 340 mm/s e uma taxa de extrusão de colágeno de 3,2 mL/min28,29. Esse equilíbrio é crítico não apenas para a formação de nanofibrilas alinhadas, mas também para garantir a funcionalidade dos hidrogéis em macroescala. Se essa proporção estiver desalinhada, existe o risco de fabricar hidrogéis que não são padronizados conforme o esperado, bem como hidrogéis contendo tiras de colágeno muito finas (&lt;0,5 mm de diâmetro), grossas (&gt;1,5 mm de diâmetro) ou onduladas para uso. Por exemplo, um movimento de seringa muito rápido, juntamente com uma taxa de extrusão muito lenta, resulta em tiras finas, enquanto a proporção oposta produz tiras grossas ou onduladas (Figura 4A-D), dependendo do grau de desequilíbrio na proporção. Essas diferenças nas propriedades macroscópicas podem criar variabilidade suficiente de tira para tira para influenciar a deposição celular e a adesão local.
Após a extrusão e montagem do colágeno, a fabricação do hidrogel passa por uma fase inicial de secagem, geralmente de 1 a 3 h, antes de passar por uma etapa de lavagem em 1x PBS (Figura 2 e Figura 3). Alcançar resultados topográficos ideais depende de um equilíbrio delicado entre o tempo e a intensidade da etapa de lavagem. A lavagem insuficiente ou atrasada resulta em topografia de fibra interrompida, denotada pelas impressões de cristais de sal PBS nas fibrilas. Em contraste, a lavagem excessiva ou prematura do colágeno pós-fabricação resulta em uma camada dissolvida de colágeno que cobre as características topográficas (Figura 4E, F).
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) confirma a presença de orientação nanofibrilar alinhada ou aleatória dentro dos hidrogéis de colágeno. Tanto nos hidrogéis alinhados quanto nos aleatórios, as nanofibrilas exibem diâmetros de fibrilas entre 30-50 nm29. Qualitativamente, é evidente que os hidrogéis alinhados contêm nanofibrilas uniaxialmente alinhadas (Figura 5). Esse alinhamento foi previamente quantificado usando a análise de transformada rápida de Fourier 2D, na qual o gráfico de alinhamento exibe dois picos distintos espaçados 180° para hidrogéis alinhados, contrastando com hidrogéis orientados aleatoriamente que exibem apenas picos de baixa frequência28.
Imagens de campo claro de mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos ilustram que a orientação nanotopográfica anisotrópica das fibrilas de colágeno promove o alinhamento celular (Figura 6). Esses hidrogéis de colágeno nanopadronizados demonstraram induzir o alinhamento celular não apenas em mioblastos26, mas também em outros tipos de células, como células endoteliais23,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
Figura 1: Ilustração esquemática do colágeno de ultra-alta densidade e preparação de lâminas de vidro cortado. (AF) Processo de diálise de colágeno: (A) preparação do tubo de diálise em tiras de 3 polegadas e fixação do primeiro clipe, (B) carregamento de colágeno de estoque de alta densidade no tubo e fixação do segundo clipe, (C) encapsulamento do tubo de diálise carregado com flocos de polietilenoglicol (PEG), (D) remoção de flocos de PEG saturados, (E) enxágue de flocos de PEG com água e (F) armazenamento de colágeno de ultra-alta densidade em tubos de microcentrífuga. (G-L) Processo de corte de lâminas de vidro: (G) aquisição de lâminas de vidro para estudo, (H,I) corte de lâmina de vidro com cortador de vidro com ponta de diamante, (J) quebra de lâmina de vidro do lado não marcado, (K) enxágue do vidro cortado com água e (L) secagem da lâmina de vidro. Feito usando BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
Figura 2: Processo de fabricação de hidrogel de colágeno alinhado. Etapa 1: Extrusão de colágeno sob cisalhamento no tampão aquecido 10x PBS e indução de fibrilogênese; Passo 2: Montagem de colágeno extrudado em lâminas de vidro cortadas; Etapa 3: Montagem de colágeno extrudado adicional para aumentar o tamanho do hidrogel; e Etapa 4: Secagem de hidrogéis de colágeno. Feito usando BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
Figura 3: Processo aleatório de fabricação de hidrogel de colágeno. Passo 1: Extrusão de colágeno em lâminas de vidro cortadas (tira única); Passo 2: A extrusão contínua de colágeno aumenta o tamanho (várias tiras); Etapa 3: Submersão de colágeno extrudado em um tampão PBS 10X para iniciar a fibrilogênese; e Etapa 4: Secagem de hidrogéis. Feito usando BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
Figura 4: Possíveis etapas de erro no processo de fabricação do hidrogel de colágeno. (A-F) Exemplos de (A) tiras de colágeno otimamente espessas, (B) tiras de colágeno excessivamente grossas, (C) tiras de colágeno insuficientemente espessas, (D) tiras de colágeno onduladas e (E,F) superfícies de colágeno superlavadas mostradas usando microscopia eletrônica de varredura. Barra de escala = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
Figura 5: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de hidrogéis de colágeno alinhados e aleatórios. As imagens foram obtidas em microscópio eletrônico. As condições do feixe foram definidas para 2 keV, com uma faixa de corrente de 25-100 pA e uma distância de trabalho de 4-5 mm. As imagens foram salvas consistentemente em uma resolução de 6144 x 4096 pixels com um tempo de permanência de 1 μs. Barra de escala = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
Figura 6: Mioblastos primários de camundongos cultivados em hidrogéis de colágeno alinhados e aleatórios. Os mioblastos foram cultivados nos hidrogéis por 3 dias antes da imagem. Imagens de campo claro foram tiradas com aumento de 10x usando um microscópio invertido. A seta denota orientação nanofibrilar alinhada. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

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Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Uma técnica inovadora de biofabricação foi desenvolvida para projetar construções tridimensionais que se assemelham às características arquitetônicas, componentes e propriedades mecânicas do tecido in vivo. Esta técnica apresenta um material de sacrifício recém-desenvolvido, a borracha BSA, que transfere características espaciais detalhadas, reproduzindo as arquiteturas in vivo de uma ampla variedade de tecidos.

Tridimensional Tecnologia Biomimético: Novel Biorubber Cria Definido micro e macro-escala Arquitecturas em colágeno hidrogéis

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (&lt;250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

As inserções de cultura de tecidos com membranas plásticas são o padrão ouro em laboratórios de cultura de células como suportes permeáveis para estabelecer camadas celulares e modelos de tecidos de barreira. Aqui, apresentamos um método simples para substituir a membrana plástica por uma membrana mais biologicamente relevante feita de uma proteína de seda de aranha funcionalizada recombinante.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

Aprenda a fabricar hidrogéis de colágeno com padrão nanofibrilar por extrusão com cisalhamento para engenharia de tecidos. Este método controla a organização das fibrilas sem equipamentos especializados.

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

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