Name: Estabelecimento de um novo sistema de perfusão pulmonar ex vivo para pulmões de ratos após morte circulatória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de perfusão pulmonar ex vivo em ratos para pesquisa em transplante. Este método simples e reprodutível mantém a função pulmonar por 4 horas, avaliando lesão de isquemia-reperfusão em doadores DCD.

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Este trabalho foi apoiado pelo National National High-Level Hospital Clinical Research Funding e pelo projeto Elite Medical Professionals do China-Japan Friendship Hospital (números de concessão [2022-NHLHCRF-LX-03-0303] e [ZRJY2021-GG07]).

Os animais experimentais foram ratos machos SD pesando 250-400 g. Os ratos foram alojados em condições experimentais padrão a 18-22 °C com um ciclo claro-escuro controlado de 12 h e tiveram livre acesso a comida e água. O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Pesquisa Clínica do Hospital da Amizade China-Japão aprovou os experimentos com animais e os conduziu de acordo com as diretrizes. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia geral. A Figura 1 apresenta um diagrama esquemático e uma imagem real do sistema EVLP para referência. A marca e o modelo específicos de todos os instrumentos e equipamentos utilizados são detalhados na Tabela de Materiais
1. Construção de aparelhos
NOTA: O plástico impresso em 3D parece ser uma escolha promissora para o aparelho. No entanto, com base em nossa experiência limitada, é difícil regular a força ao amarrar nós com materiais plásticos; Pouca força pode fazer com que o tubo escorregue e muita força pode bloquear o tubo de plástico. Os tubos rígidos de metal evitam esses problemas e são relativamente duráveis, por isso são usados aqui.
<ol>
	<li>Conecte o módulo ao tubo de plástico e use um suporte de estrutura de ferro e uma plataforma de elevação ajustável para posicionar todas as peças na altura apropriada. Adicione 150 mL de perfusão no tanque de armazenamento de líquido, abra a bomba peristáltica e ajuste a taxa de fluxo para 20 mL / min para fazer a perfusão encher o tubo.</li>
	<li>1.2Triture uma ranhura circular para intubação endotraqueal. Prepare uma mistura de gases contendo 8% de O2, 6% de CO2 e 86% de N2 como gás hipóxico. Passe o gás hipóxico para a perfusão através do pulmão de membrana artificial. Ventile com oxigênio puro por 5 minutos antes da medição da gasometria.</li>
	<li>Faça as cânulas da artéria pulmonar e do átrio com tubos ocos de aço inoxidável 304 curvados para se ajustarem à anatomia dos ratos (Figura 2A). Triture uma ranhura circular para intubação da artéria. Faça um orifício na extremidade distal da parede da cânula atrial e polir a ranhura anular na parede externa (Figura 2C). Coloque um dispositivo de exaustão antes do tubo no tubo de perfusão da artéria pulmonar.</li>
	<li>Conecte uma válvula de três vias ao sistema de circulação externa do banho-maria e regule a temperatura do reservatório, compartimento do órgão e perfusato da artéria pulmonar. Minimize o comprimento do tubo de conexão sem banho-maria e controle o erro de temperatura em todos os pontos do dispositivo dentro da faixa de ± 0.2 °C. A temperatura desejada para o desenho do estudo é de 37 °C.</li>
	<li>Encha a linha de monitoramento de pressão com solução salina e ajuste o dispositivo de monitoramento de pressão para a mesma altura do pulmão do doador. Abra a válvula para conectar a linha de monitoramento de pressão com a artéria pulmonar e a linha de perfusão venosa, inicie o coletor de dados e defina zero. Monitore a pressão de perfusão arterial e a pressão de retorno venoso em tempo real.</li>
</ol>
2. Anestesia com ratos
<ol>
	<li>Use equipamento de proteção individual: máscaras cirúrgicas, luvas e macacões descartáveis antes de manusear ratos e tecidos de ratos.</li>
	<li>Pese os ratos e registre seus pesos. Encha uma seringa com 1000 U/kg de heparina e injete-a na veia da cauda com uma agulha.</li>
	<li>Coloque os ratos em uma câmara de indução fechada e anestesiá-los com gás isoflurano a 3%. Prenda os dedos dos ratos; Se não houver resposta, indica que os ratos atingiram a profundidade desejada da anestesia. Caso contrário, continue aumentando o tempo de anestesia. Aplique pomada oftálmica estéril para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
	<li>Prepare várias suturas (3-0 ou 4-0). Transfira os ratos para a mesa de operação, posicione-os em decúbito dorsal, prenda-os com suturas e desinfete-os com spray de álcool.</li>
</ol>
3. Captação de pulmão de doador
<ol>
	<li>Coloque a cabeça do rato na máscara de anestesia e mantenha a anestesia fornecendo ar contendo 1,5% de isoflurano. Prenda os dedos dos ratos; Se não houver resposta, indica que os ratos atingiram a profundidade desejada da anestesia.</li>
	<li>Faça uma incisão longitudinal de 2-3 cm com uma tesoura cirúrgica de roedores ao longo da linha média do pescoço na frente da traqueia, corte a pele, disseque o tecido muscular na frente da traqueia e exponha totalmente a traqueia.</li>
	<li>Libere o espaço atrás da traqueia, passe uma sutura 3-0 por ela e dê um nó solto para uso posterior. Faça uma incisão em forma de V de 0,5 cm com uma tesoura cirúrgica de roedor acima do nó na traqueia, insira um tubo traqueal (14G) na traqueia, aperte o nó de sutura e prenda o tubo traqueal (Figura 3A).</li>
	<li>Conecte o tubo traqueal ao ventilador, ligue-o e inicie a ventilação dos pulmões.</li>
	<li>Monitore e registre os sinais vitais com frequência para garantir anestesia e alterações nos sinais vitais até que a morte seja confirmada.</li>
	<li>Inicie as manobras de recrutamento pulmonar, reinicie a ventilação mecânica no modo controlado por pressão e ventile por 5 min. Use os seguintes parâmetros: PEEP 3 cmH2O, relação inspiratória: expiratória (I:E) 1:2, frequência respiratória 40 ciclos/min e FiO2 0,5.</li>
	<li>Clampeie a traqueia e permita que os pulmões passem por 1 h de tempo isquêmico quente (WIT). Após o período WIT, extraia os pulmões conforme descrito abaixo e divida-os aleatoriamente em três grupos: (1) coleta pulmonar direta, (2) preservação estática a frio (CS) de 4 h e (3) avaliação de EVLP de 4 h.</li>
	<li>Para a colheita direta do pulmão, amostrar os pulmões do doador obtidos sem qualquer tratamento para vários testes. Durante 4 h de conservação estática a frio, conservar os pulmões do dador em conservação estática a frio no frigorífico a 4 °C durante 4 h e, em seguida, amostrar para detecção. Avaliação da PPEV em 4 h. Para avaliação de PPEV de 4 h, siga a etapa 5.</li>
	<li>Ajuste a mesa de operação para uma posição inclinada de 45° na altura da cabeça e pés baixos.</li>
	<li>Remova o cabelo com um barbeador de cabelo do meio do peito e do abdômen do rato, desinfete-o com iodo 3x e cubra-o com uma toalha cirúrgica.</li>
	<li>Faça uma incisão longitudinal de 6-7 cm ao longo da linha média do abdômen com tesoura cirúrgica de roedores, corte a pele, abra a parede abdominal para a cavidade abdominal e exponha os órgãos abdominais. Use um cotonete para empurrar suavemente os intestinos para o lado direito da cavidade abdominal para expor a veia cava inferior atrás deles.</li>
	<li>Usando uma seringa, injete uma solução de 1000 U/kg de heparina na veia cava inferior. Aguarde 5 minutos para garantir a heparinização adequada do sangue. A heparina previne a formação de microtrombos na artéria pulmonar.</li>
	<li>Corte a veia cava inferior do rato com uma tesoura, exsanguinando-a. Inicie a ventilação mecânica dos pulmões com as configurações iniciais do ventilador em um volume corrente de 3 mL/kg, pressão expiratória final positiva (PEEP) de 2 cmH2O, frequência respiratória de 60 ciclos/min e uma relação I:E de 1:2.</li>
	<li>Use uma pinça para levantar o processo xifóide; faça uma incisão longitudinal ao longo do esterno de baixo para cima. Use um espalhador de costelas para expor a cavidade torácica. Remova o tecido do timo para expor o coração e os principais vasos sanguíneos abaixo dele. 
	NOTA: Os pulmões dos ratos são frágeis; Evite tocá-los ou órgãos abdominais com instrumentos metálicos. Para melhor visibilidade, empurre suavemente os pulmões para o lado com um cotonete.</li>
	<li>Liberte a aorta do rato e o espaço atrás da artéria pulmonar, passe uma sutura 3-0 por ela e dê um nó solto para uso posterior.</li>
	<li>Faça uma incisão em forma de V de 2-3 mm na superfície anterior da via de saída do ventrículo direito, insira uma cânula da artéria pulmonar na artéria pulmonar através da incisão e aperte a sutura pré-amarrada para prender a cânula (Figura 3B).</li>
	<li>Corte a ponta do coração do rato, insira uma pinça hemostática no ventrículo esquerdo, rompa as válvulas entre o ventrículo esquerdo e o átrio esquerdo e certifique-se de que a via de saída do átrio esquerdo esteja desobstruída.</li>
	<li>Conecte a cânula da artéria pulmonar ao circuito de perfusão e lave o sangue residual a uma taxa de 0,6-1 mL / min usando 15 mL de solução com baixo teor de potássio. Lave até que os pulmões fiquem brancos ou até que o fluido de perfusão que sai do ventrículo esquerdo fique branco.</li>
	<li>Coloque uma sutura atrás do coração e circunde o ventrículo; insira a cânula do ventrículo esquerdo através da incisão no ventrículo esquerdo; e aperte a sutura pré-amarrada para prender a cânula (Figura 3C).</li>
	<li>Corte a traqueia acima do tubo traqueal, levante a traqueia e use uma tesoura para separar o tecido conjuntivo atrás da traqueia para baixo até o nível do diafragma.</li>
	<li>Corte a veia cava inferior e a artéria pulmonar principal acima do diafragma; remova o coração e os pulmões (Figura 3D).</li>
	<li>Para manter os pulmões inflados, aperte imediatamente o terço inferior da traqueia no final da inalação, colete o coração e os pulmões e coloque-os em uma solução com baixo teor de potássio para preservação.</li>
	<li>Coloque o coração e os pulmões na posição designada do circuito de PPEV e conecte a cânula do ventrículo esquerdo ao circuito de perfusão (Figura 4A).</li>
</ol>
4. Inicialização do sistema de perfusão pulmonar ex vivo
<ol>
	<li>Monte o circuito EVLP: conecte a tubulação, o oxigenador, o reservatório, a bomba peristáltica e a câmara do órgão.</li>
	<li>Encha o circuito de EVLP com 120 mL de solução de reparo de perfusão pulmonar com 1000 unidades de heparina sódica, 50 mg de cefoperazona e 50 mg de metilprednisolona antes da perfusão. Livre-se de quaisquer bolhas de ar na tubulação para usar o dispositivo de exaustão no final da perfusão da artéria pulmonar.</li>
	<li>Defina o banho-maria para a temperatura ambiente e comece a circular água morna para aquecer todo o circuito EVLP.</li>
	<li>Abra o programa de aquisição de dados do computador e conecte o sensor de pressão da artéria pulmonar, o sensor de peso pulmonar, o sensor de velocidade da bomba e o sensor de temperatura ao circuito EVLP e ao registrador.</li>
	<li>Encha o tubo de monitoramento da pressão arterial com solução salina normal, ajuste a altura da mesa para corresponder à altura do pulmão fornecido, conecte o tubo de monitoramento de pressão à artéria pulmonar e ao tubo de perfusão venosa, abra a válvula, inicie o coletor de dados e zere o sistema.</li>
	<li>Abra a válvula de gás hipóxico, passe o gás hipóxico através da membrana pulmonar por 10 min até que a solução de perfusão atinja um estado hipóxico estável, feche a válvula de gás e pause a bomba peristáltica, aguardando a chegada do pulmão doador para perfusão pulmonar ex vivo.</li>
	<li>Prepare a mesa de operação e os instrumentos cirúrgicos próximos à plataforma EVLP para pequenos animais e pré-esterilize-os com esterilização a vapor de alta pressão.</li>
</ol>
5. Perfusão pulmonar ex vivo
<ol>
	<li>Encha a armadilha de bolhas com uma quantidade suficiente de solução de perfusão para evitar que bolhas entrem nos pulmões (causando embolia gasosa).</li>
	<li>Coloque a unidade cardiopulmonar na câmara do órgão, conecte-a ao dispositivo de PPEV, ligue o ventilador e a bomba peristáltica e inicie a perfusão da PPEV (Figura 4B).</li>
	<li>Iniciar a perfusão a 20% da taxa de fluxo alvo; aumentar gradualmente a taxa de fluxo até a taxa de fluxo alvo dentro de 1 h; calcular a taxa de fluxo alvo como 20% do débito cardíaco (75 mL / min / 250 g de peso do doador).</li>
	<li>Ajuste o trocador de calor para 40 °C para manter uma temperatura pulmonar de 37.5 °C. Em 20 minutos, a temperatura da solução de perfusão aumenta de 25 ° C para 37 ° C.</li>
	<li>Remova a pinça endotraqueal 20 min após o início da perfusão. Iniciar a ventilação mecânica com frequência respiratória (FR) de 60 bpm, pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cmH2O e volume corrente (VC) inicial de 4 mL/kg, atingindo volume corrente máximo de 6 mL/kg em 10 min.</li>
	<li>Iniciar o fluxo de gás hipóxico (8% CO2, 6% O2 e 86% N2) para manter a solução de perfusão PCO2 entrando na artéria pulmonar entre 35 e 45 mmHg simultaneamente durante a ventilação.</li>
	<li>Monitore a taxa de fluxo da solução de perfusão, a pressão arteriovenosa, a pressão de pico das vias aéreas e os parâmetros da função pulmonar constantemente durante a perfusão.</li>
</ol>

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Este estudo apresenta um design modular e econômico para uma plataforma EVLP de pequenos animais e validação da eficácia dessa plataforma em um modelo de DCD em ratos. Os resultados indicam que a PPEV pode melhorar significativamente a qualidade dos pulmões de doadores falecidos, expandindo assim o grupo de potenciais doadores para transplante de pulmão. A escassez de pulmões de doadores para transplante continua sendo um desafio crítico. Para resolver essa questão, alguns países começaram a implementar programas de DCD28. Essa abordagem oferece uma estratégia valiosa para aumentar o número de enxertos de órgãos viáveis. Notavelmente, vários estudos mostraram que as taxas de sobrevida a longo prazo após o transplante de fígado usando órgãos DCD são comparáveis àquelas usando órgãos de DBD29,30. No entanto, a utilização de pulmões de doadores com DCD permanece limitada devido ao extenso dano causado pela isquemia prolongada31. A avaliação eficiente e a utilização dos recursos pulmonares limitados obtidos de doadores de DCD têm imenso potencial para aliviar a escassez de pulmões transplantáveis. A PPEV é uma técnica promissora que pode melhorar a qualidade dos pulmões e prolongar seu tempo de preservação antes do transplante. Para validar a eficácia da EVLP em comparação com o armazenamento refrigerado a 4 °C, empregamos um modelo de morte circulatória em ratos. Nossa hipótese é que nossa técnica de perfusão pode mitigar os danos causados pela lesão de isquemia-reperfusão e melhorar a função pulmonar após a morte circulatória. Nossos resultados experimentais são consistentes com os achados recentes relatados por Wang et al.32 e Hasenauer et al.33.
Manter uma temperatura consistente em todo o circuito de perfusão é crucial para a função ideal da PPEV. No entanto, muitos sistemas EVLP existentes carecem de mecanismos de controle de temperatura confiáveis e adaptáveis. Os sistemas de troca de calor único geralmente requerem ajustes que alteram a temperatura em locais específicos. Essa flutuação na temperatura pode afetar a composição do fluido de perfusão, interromper as medições do índice de oxigenação e, em última análise, comprometer a precisão dos resultados experimentais. Para superar essa dificuldade, um sistema de PPEV foi criado e equipado com três trocadores de calor em banho-maria separados que foram colocados no reservatório, nas zonas de perfusão da artéria pulmonar e na câmara do órgão. Além disso, o sistema utiliza tubulação mínima para minimizar a perda de calor e garantir um controle preciso da temperatura dentro de uma faixa de 4-40 °C. Essa configuração permite um controle de temperatura altamente preciso, com temperaturas medidas em cada segmento de circuito desviando não mais do que ± 0,2 °C do ponto de ajuste. O projeto atende efetivamente aos rigorosos requisitos de controle de temperatura para experimentos EVLP. 
Modelos animais pequenos, devido aos seus órgãos menores, são particularmente suscetíveis ao edema pulmonar e atelectasias34. Essas complicações dificultam significativamente a realização de longos experimentos de perfusão. Para enfrentar esse desafio e garantir a proteção pulmonar ideal durante a perfusão, adotamos a abordagem de Toronto, o padrão ouro atual na prática clínica. Este método envolve um aumento gradual na taxa de fluxo de perfusato e ventilação ao longo de um período de tempo definido35. A perfusão foi iniciada a 10% do fluxo alvo (20% do débito cardíaco = 75 mL/min/250 g de peso do doador) e aumentou gradualmente ao longo de 1 h. Da mesma forma, a ventilação foi iniciada em baixa frequência (4 mL/kg), e o volume corrente foi gradualmente aumentado para um máximo de 6 mL/kg ao longo de 10 min. A pesquisa também destaca os benefícios da adição de albumina de soro bovino (BSA) ao perfusato. A suplementação de BSA eleva a pressão osmótica coloidal, reduzindo o edema tecidual36. Na PPEV de pequenos animais, existem duas configurações primárias de perfusão baseadas na canulação atrial: circuito fechado e circuito aberto. Os sistemas de circuito fechado mantêm uma pressão baixa e constante dentro dos átrios, imitando condições fisiológicas e facilitando medições precisas de gases sanguíneos. Um estudo de Linacr et al. demonstrou que a manutenção de uma pressão atrial específica durante a perfusão pode melhorar a função pulmonar e reduzir o edema34. No entanto, picos de pressão podem ocorrer se o músculo atrial obstruir o circuito. Além disso, a amarração do átrio e a presença de bolhas de ar podem comprometer os resultados experimentais devido ao potencial dano às fibras miocárdicas e leituras de pressão inconsistentes7. Para superar essas limitações e obter uma perfusão eficaz em circuito fechado, foi feita uma cânula atrial especialmente projetada. Esta cânula possui uma cinta saliente em sua ponta para evitar a obstrução pelo músculo atrial. Além disso, as ranhuras anulares ao longo do corpo da cânula facilitam a colocação segura da ligadura. Além disso, o sistema incorpora armadilhas de bolhas e técnicas de pré-perfusão para eliminar a embolia gasosa e manter a pressão de perfusão consistente. 
As plataformas de EVLP para pequenos animais são favorecidas na pesquisa científica por seus inúmeros benefícios: condições controladas dos animais, custo-benefício, acomodação de grandes tamanhos de amostra e baixo consumo de fluido de perfusão. Além disso, o uso de uma única linhagem de pequenos animais (por exemplo, ratos neste estudo, mas também porquinhos-da-índia e coelhos 24,35,36) permite um controle meticuloso da dieta e dos ambientes experimentais. A versatilidade do sistema permite a adaptação para todas essas espécies, ajustando os parâmetros respiratórios e a taxa de fluxo de perfusão. Os vídeos que acompanham detalham o modelo animal e os procedimentos de EVLP, fornecendo aos pesquisadores uma compreensão abrangente. Seguindo esses protocolos, os pesquisadores podem aumentar o sucesso experimental, minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o uso geral dos animais.
Embora a pesquisa tenha estabelecido um sistema de EVLP acessível, modular e fácil de usar para pequenos animais que supera as opções comerciais em estabilidade, qualidade de perfusão e ajustabilidade, é necessária uma investigação mais aprofundada para otimizar os protocolos de EVLP, incluindo parâmetros de perfusão e ventilação, e identificar os medicamentos protetores pulmonares mais eficazes. Essa tecnologia fácil de usar e eficiente permitiu testes bem-sucedidos em muitos pulmões de doadores, aproveitando a infraestrutura. Os esforços de pesquisa atuais estão focados na restauração e conservação dos pulmões de doadores.

O transplante de pulmão (TxT) continua sendo o único tratamento definitivo para pacientes com doença pulmonar em estágio terminal. O sucesso do transplante pulmonar depende da disponibilidade de pulmões de doadores de alta qualidade com função adequada. No entanto, uma lista de espera crescente para transplantes de pulmão surgiu globalmente devido a uma escassez crítica de pulmões de doadores1. Muitos pacientes na lista de espera experimentam um declínio na saúde ou até mesmo a morte enquanto esperam por um pulmão de doador adequado dentro de um prazo razoável2. Portanto, é crucial expandir o conjunto de enxertos potenciais para atender às necessidades dos pacientes na lista de espera para transplante. A doação após morte cardiocirculatória (DCD)1,3 e perfusão pulmonar ex vivo (PPEV)4,5 são duas estratégias promissoras para aumentar o número de pulmões disponíveis para transplante. Atualmente, a doação após morte encefálica (DBD)6 é a principal fonte de transplantes pulmonares. No entanto, devido à atual escassez de enxertos, o DCD está ganhando força. Essa mudança é impulsionada pelas limitações dos enxertos DBD, onde alterações no fluxo sanguíneo, ventilação mecânica, infecção e aspiração podem comprometer a qualidade do enxerto. A qualidade do enxerto afeta diretamente os resultados do paciente e a sobrevida a longo prazo após o transplante. O processo de perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) aumentou efetivamente o número de transplantes pulmonares disponíveis, reavaliando enxertos pulmonares de doadores após morte cardíaca (DCD), resultando em resultados semelhantes em curto e longo prazo7,8. O objetivo deste estudo foi desenvolver um sistema de perfusão pulmonar extracorpórea em ratos com pulmões ciclicamente mortos e avaliar com precisão os doadores de DCD. Para diminuir a probabilidade de disfunção primária do enxerto (PGD), o dano aos doadores de DCD9 pode ser minimizado usando diagnósticos moleculares10 e empregando tratamentos direcionados especializados.
EVLP é uma técnica que replica o ambiente natural dos pulmões fora do corpo, mantendo uma temperatura fisiológica normal. Permite o monitoramento e avaliação contínuos dos pulmões11,12, prolonga o tempo de preservação dos transplantes13 e utiliza perfusão externa, ventilação e medicamentos para melhorar a qualidade dos pulmões marginais, tornando-os adequados para transplante14. O primeiro uso bem-sucedido de pulmões de doadores marginais para transplante pulmonar usando PPEV foi relatado por Steen et al. em 200715. Desde então, o uso da tecnologia EVLP foi gradualmente integrado à prática clínica16,17. A equipe de Toronto posteriormente adaptou a abordagem EVLP usando ventilação de baixo volume corrente e baixas taxas de fluxo em conjunto com a estratégia ideal de proteção pulmonar de uma bomba centrífuga; Isso resultou em perfusão constante por um período de 12 h18.
EVLP oferece vários benefícios, incluindo redução do risco de falha primária do enxerto, minimização do edema pulmonar, mitigação da inflamação relacionada à morte encefálica, preparação do sistema imunológico do receptor para transplante e prevenção de infecções pulmonares, aspiração, embolia pulmonar e lesão de isquemia-reperfusão14,19,20. Embora a PPEV ofereça vantagens significativas, há necessidade de métodos aprimorados para melhorar a qualidade do enxerto.
Atualmente, não há consenso sobre as configurações específicas para perfusão e ventilação na plataforma de PPEV de ratos. Ohsumi et al.21 desenvolveram um novo modelo para estudar como os pulmões de doadores que foram submetidos a longos períodos de tempo de isquemia fria (CIT) poderiam manter sua função pulmonar durante o processo de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) e após serem transplantados. Internacionalmente, tem havido vários esforços para criar modelos de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) em ratos22,23,24,25,26,27 para obter uma perfusão mais confiável e precisa. Portanto, é essencial desenvolver um sistema de EVLP de pequenos animais econômico, altamente reprodutível e rigidamente controlado para facilitar pesquisas futuras nesta área. Os sistemas de PPEV existentes para pequenos animais são frequentemente caros e têm flexibilidade limitada em termos de modificação das condições operacionais para diferentes necessidades de pesquisa. Este artigo propõe um projeto de sistema EVLP econômico e adaptável. Além disso, fornece uma explicação detalhada das etapas técnicas e cirúrgicas necessárias para sua implementação. Empregamos um modelo utilizando ratos falecidos em parada circulatória para demonstrar que a EVLP melhora a qualidade dos pulmões DCD, aumentando assim o pool de doadores de pulmão viáveis para transplante. Nosso objetivo é compartilhar nossa experiência bem-sucedida para ajudar outros pesquisadores a estabelecer uma plataforma EVLP prontamente disponível para pequenos animais após a morte cardiocirculatória.

<table><tbody><tr><td>indústria asséptica médica Co. da bomba de Zhifang da tubulação de 3.0mm</td><td>, LTD, Hebei, China</td><td>3.0mm</td><td>Na circulação do sangue, um pouco do que os vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>Sigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, China</td><td>BSAV-RO</td><td>Aumente a pressão osmótica coloidal da perfusão</td></tr><tr><td>BP-100/102 Transdutor de pressão arterial intravascular</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, EUA</td><td>BP-100/102</td><td>Registros de pressão vascular pulmonar em ratos</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, China</td><td>PHR1291</td><td>Infecção antibacteriana</td></tr><tr><td>Desoxigenador</td><td>Dongguan Kewei Medical Instrument, Guangdong, China</td><td>Sem especificação de modelo</td><td>Substituir a função pulmonar de rato Troca gasosa no sangue</td></tr><tr><td>F500 Máquina de anestesia geral para pequenos animais</td><td>Beijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Pequim, China</td><td>F500</td><td>Administrar anestesia gasosa para o fornecimento de anestesia</td></tr><tr><td>Mistura gasosa (6% O2, 8% CO2, 86% N2)</td><td>Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Pequim, China</td><td>Sem especificação de modelo</td><td>Manter o equilíbrio ácido-base do sangue, simula a fisiologia vascular pulmonar</td></tr><tr><td>Trocador de calor</td><td>Changhong Precision Instrument Center, Shenzhen, China</td><td>DHC-05-B</td><td>Controle de temperatura na heparina do circuito de perfusão</td></tr><tr><td></td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pequim, China</td><td>H0200000</td><td>Anti-microtrombose</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, China</td><td>R510-22</td><td>Ratos anestesiados</td></tr><tr><td>Câmara de isolamento</td><td>Feito à mão de Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Xangai, China</td><td>Sem especificação de modelo</td><td>Armazenamento de pulmões de rato</td></tr><tr><td>i-STAT 1 Analisador Clínico Portátil</td><td>Abbott point of care, Inc, NJ, EUA</td><td>300G</td><td>A análise de gases sanguíneos na perfusão</td></tr><tr><td>iWorx RA-834 Recorder</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, EUA</td><td>RA-834</td><td>Saída de sinal de pressão dos vasos sanguíneos pulmonares</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica multicanal LabMate</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>LabMate2</td><td>Fornece energia para o processo de circulação de perfusão</td></tr><tr><td>PERFADEX Plus</td><td>XVIVO Perfusion, Gotemburgo, Suécia</td><td>NA</td><td>O pulmão do doador de ratos foi submetido a pré-lavagem; solução com baixo teor de potássio&nbsp;</td></tr><tr><td>cânula pulmonar</td><td>Feita de aço inoxidável</td><td>304 aço inoxidável/SUS304</td><td>2.0/2.5 mm</td></tr><tr><td>Cânula de veia pulmonar</td><td>Feita de aço inoxidável</td><td>304 aço inoxidável/SUS304</td><td>4.0mm</td></tr><tr><td>QAH-INF-1 kit de ensaio</td><td>Innopsys, Parcd'Activit&eacute; s Activestre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R415 Ventilador para pequenos animais</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, China</td><td>R415</td><td>A ventilação do reservatório de pulmão de rato</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Xangai, China</td><td>Capacidade 1 L</td><td>Armazenamento de perfusão</td></tr><tr><td>SOLU-MEDROL</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pequim, China</td> Sensor de temperatura <td>M0639</td><td>NA</td></tr><tr><td>(TM-100)</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, EUA</td><td>TM-100</td><td>Temperatura recorde de perfusão pulmonar</td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um novo sistema de perfusão pulmonar ex vivo para pulmões de ratos após morte circulatória

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

A crescente escassez de pulmões de doadores para transplante tem estimulado um interesse significativo na utilização de órgãos obtidos de doadores após morte cardíaca (DCD). No entanto, permanece um desafio crítico na maximização do número de pulmões viáveis que atendem a critérios rigorosos para uso clínico. A perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) surge como uma tecnologia promissora para avaliar e potencialmente melhorar a função dos pulmões doados. Este artigo descreve o desenvolvimento de uma plataforma experimental de pequenos animais econômica e reprodutível, projetada especificamente para pesquisa de EVLP. Esta plataforma oferece um alto grau de personalização, permitindo que os pesquisadores adaptem parâmetros experimentais para abordar questões de pesquisa específicas no campo da EVLP. A equipe estabeleceu um modelo de rato para simular o DCD e implementou uma abordagem de preservação em dois estágios. Os pulmões foram submetidos a armazenamento refrigerado estático usando uma solução de perfusato a 4 °C por 4 h, seguido de EVLP normotérmica por mais 4 h. Os pesquisadores avaliaram vários parâmetros da função pulmonar, incluindo resistência vascular pulmonar, complacência dinâmica pulmonar, medições de gases sanguíneos do perfusato e morte celular apoptótica nos tecidos pulmonares. O estudo demonstra que a PPEV pode melhorar significativamente o desempenho funcional dos pulmões DCD em comparação com o armazenamento refrigerado simples a 4 °C, sugerindo que a PPEV tem o potencial de mitigar a lesão de isquemia-reperfusão e melhorar a função do enxerto após a morte circulatória, aumentando assim o pool de pulmões transplantáveis.

Avaliar o número de células apoptóticas detectadas pela coloração TUNEL, os níveis de marcadores inflamatórios (detectados no perfusato utilizando o kit de ensaio QAH-INF-1) e a aparência física geral (corada com hematoxilina e eosina (H&amp;E)) dos pulmões de doadores com coração batendo em todos os grupos é necessário para determinar quão bem a EVLP preservou os pulmões de doadores DCD. Todos os pulmões de doadores DCD passaram por 4 h de perfusão. A maioria dos pulmões exibiu complacência estável, com uma diminuição gradual observada ao longo do período de 4 h (Figura 5B). Não foram encontradas diferenças significativas nos níveis de resistência vascular e oxigenação do enxerto pulmonar entre os pulmões de doadores DCD (Figura 5A,C). Os níveis de glicose no perfusato diminuíram ao longo do tempo, sem diferenças significativas observadas entre ratos individuais (Figura 5D). Os níveis de eletrólitos no perfusato permaneceram semelhantes entre os grupos (Figura 5E-F).
A coloração TUNEL foi realizada utilizando a técnica de marcação de extremidades quebradas de dUTP por transferase de desoxinucleotidil terminal, com o kit de detecção de apoptose, seguindo as instruções do fabricante para detecção nuclear de apoptose. A coloração TUNEL foi empregada para quantificar a apoptose (morte celular programada) de células epiteliais alveolares em pulmões doadores DCD sob diferentes condições de preservação. A análise cega do número de células apoptóticas revelou um número significativamente maior de células positivas no grupo doador em comparação com os demais grupos. Além disso, o grupo de preservação a frio exibiu um número maior de células positivas em comparação com os pulmões doadores DCD perfundidos com EVLP (Figura 6). Cinco variáveis independentes foram utilizadas para pontuar as seções histopatológicas coradas com H&amp;E: 1) influxo de células inflamatórias no espaço alveolar, 2) espessamento septal alveolar, 3) hemorragia intra e extra-alveolar, 4) edema intra-alveolar e 5) formação de membrana hialina. As variáveis foram pontuadas de 0 a 4: 0 = negativo, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = alto e 4 = grave. A soma das variáveis pontuadas gerou os escores totais de lesão pulmonar. O escore de lesão pulmonar é significativamente menor no grupo EVLP do que no grupo de preservação estática a frio e no grupo controle (Figura 7A). Espessamento da parede alveolar e hemorragia alveolar podem ser observados no grupo de preservação estática a frio por 4 h (Figura 7B). A estrutura alveolar normal é mantida no grupo EVLP (Figura 7C).
<img alt="Configuração de bypass cardiopulmonar, oxigenação por membrana, diagrama esquemático, método experimental." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Diagrama e fotografia do circuito de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) para pequenos animais. As letras no diagrama correspondem às letras na fotografia, descrevendo a função de cada componente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Componentes do sistema de cromatografia; diagrama de conectores metálicos, conexões e peças de tubulação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Cânulas personalizadas. (A) Cânula da artéria pulmonar. (B) Cânula da traqueia. (C) Cânula do átrio esquerdo. (D) Um conjunto de cânulas para perfusão pulmonar ex vivo de rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do procedimento cirúrgico em roedor mostrando as etapas da dissecação cardiovascular e exposição de órgãos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Isolamento pulmonar em rato. (A) A cânula traqueal é posicionada e fixada com um fio de seda. (B) A artéria pulmonar é canulada e amarrada com o fio de seda previamente colocado. (C) A cânula no átrio esquerdo é fixada com um fio de seda. (D) O tecido conjuntivo é dissecado com técnica romba para remover o bloco coração-pulmão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Configuração do experimento de perfusão de órgão; A: conexões de tubos, B: órgão na câmara de preservação para pesquisa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4: Configuração para perfusão pulmonar em ratos. (A) O bloco coração-pulmão é colocado no circuito de perfusão pulmonar ex vivo. (B) Um pulmão adequadamente ventilado e perfundido conectado ao circuito EVLP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de parâmetros fisiológicos ao longo do tempo: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, Glicose, Sódio, Potássio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Função pulmonar durante o protocolo de EVLP em ratos. (A-F) Função pulmonar e análise de gases sanguíneos de pulmões doadores submetidos à EVLP após exposição a 1 h de tempo de isquemia quente (WIT). (A) Índice de oxigenação pulmonar. (B) Complacência dinâmica pulmonar (Cdyn). (C) Resistência vascular pulmonar (PVR). (D) Nível de glicose na perfusão 4 h após EVLP. (E) Nível de sódio na perfusão 4 h após EVLP. (F) Nível de potássio na perfusão 4 h após EVLP. As barras de erro indicam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do ensaio TUNEL com coloração DAPI, comparando as condições DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Imagens representativas do ensaio TUNEL em diferentes casos. Células TUNEL-positivas: fluorescência verde indica células apoptóticas; DAPI: fluorescência azul representa o núcleo; Fusão (Merge): todas as células, incluindo aquelas que estão passando por morte celular programada (apoptose); DCD refere-se ao grupo com colheita direta de pulmão. DCD+COLD refere-se ao grupo com preservação estática a frio por 4 h. DCD+EVLP refere-se ao grupo com perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) por 4 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras do escore de lesão pulmonar e análise histológica do tecido pulmonar, representação dos resultados experimentais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Escore de lesão pulmonar e achados histológicos. (A) O Escore de Lesão Pulmonar no grupo controle, SCS e grupo EVLP (*, p &lt;0,05). (B) Cortes representativos corados com hematoxilina e eosina (H&amp;E) de doadores preservados por armazenamento estático a frio (SCS). A seta preta indica ruptura do epitélio capilar pulmonar, e as setas azuis indicam espessamento das paredes alveolares. (C) Cortes representativos corados com H&amp;E de doadores submetidos à EVLP. A seta vermelha indica infiltração de células inflamatórias. (D) Cortes representativos corados com H&amp;E de doadores com colheita direta (controle). As setas pretas indicam ruptura e sangramento do epitélio capilar pulmonar. As barras de erro indicam desvio padrão; a análise de significância foi realizada por análise de variância unidirecional (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

O objetivo é desenvolver um novo modelo de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) em ratos que possa sustentar uma função pulmonar consistente por 4 h durante a EVLP e fornecer à indústria especificações de implementação que oferecerão um método robusto para aplicar EVLP a modelos de roedores.

Estabelecimento de um novo sistema de perfusão pulmonar ex vivo para pulmões de ratos após morte circulatória

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

establishment-novel-ex-vivo-lung-perfusion-system-for-rat-lungs-after

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JoVE Journal

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Este vídeo mostra uma técnica ex vivo para perfusão pulmonar isolada. É uma ferramenta para pesquisa pulmonar que auxiliará no estudo de vários mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos nos procedimentos de transplante pulmonar.

Perfusão Pulmonar Ex vivo: Uma Técnica para Pesquisa Pulmonar em Modelo de Coelho

Ex-Vivo perfusão pulmonar (PPEV) tem permitido o transplante de pulmão em seres humanos para se tornar mais facilmente disponível, permitindo que a capacidade de avaliar órgãos e expandir o grupo de dadores. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um programa PPEV rato e aperfeiçoamentos que permitem um modelo reprodutível para expansão futura.

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.

Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho

Os pulmões ex vivo são úteis para uma variedade de experimentos para coletar dados fisiológicos, excluindo as variáveis de confusão dos experimentos in vivo . As configurações comerciais geralmente são caras e limitadas nos tipos de dados que podem coletar. Descrevemos um método para construir uma configuração totalmente modular, adaptável para vários projetos de estudo.

Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Aqui, descrevemos as etapas necessárias para estabelecer um modelo de EVLP em ratos e mostramos o perfil inflamatório associado aos pulmões perfundidos. O objetivo é propagar conhecimentos e experiências sobre o modelo de PPEV de ratos, possibilitando a compreensão integral das respostas biológicas associadas a essa técnica revolucionária.

Estabelecimento de um modelo de rato de perfusão pulmonar ex vivo para insights translacionais em transplante de pulmão

Este protocolo apresenta um modelo de perfusão pulmonar ex-vivo de ratos incorporando uma exposição transitória a um estresse térmico calibrado, promovendo mecanismos protetores endógenos para o recondicionamento terapêutico de enxertos pulmonares danificados. A abordagem é escalável e reprodutível e apóia o desenvolvimento de terapias não medicamentosas para melhorar o sucesso do transplante de pulmão.

Pré-condicionamento térmico durante a perfusão pulmonar ex-vivo para a reabilitação de enxertos pulmonares danificados antes do transplante

Os mecanismos que levam ao desenvolvimento de hiperplasia intimal (HI) e falha do enxerto venoso ainda são pouco compreendidos. Este estudo descreve um sistema ex vivo para perfundir veias humanas sob fluxo e pressão controlados. Além disso, avaliou-se a eficiência do reforço da malha externa para limitar o desenvolvimento de IH.

Procedimento para safenas humanas Veias Ex Vivo Perfusão e reforço externo

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

Este protocolo apresenta uma abordagem simples e flexível para a avaliação de novos agentes condicionantes ou estratégias para aumentar a viabilidade da doação cardíaca após a morte circulatória.

Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

Aqui, apresentamos otimizações para um modelo de transplante de pulmão de rato que servem para melhorar os resultados. Fornecemos um guia de tamanho para manguitos com base no peso corporal, uma estratégia de medida para determinar o4º espaço intercostal, métodos de fechamento de feridas e coleta de líquido e tecido de LBA (lavado broncoalveolar).

Modelo de Lesão de Isquemia/Reperfusão de Pulmão de Rato em Transplante de Pulmão de Rato: Otimizações para Melhorar os Resultados

Aprenda a estabelecer um modelo de perfusão pulmonar ex vivo em ratos para pesquisa em transplante. Este método simples e reprodutível mantém a função pulmonar por 4 horas, avaliando lesão de isquemia-reperfusão em doadores DCD.

Estabelecimento de um novo sistema de perfusão pulmonar ex vivo para pulmões de ratos após morte circulatória

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