Name: Triagem de fragmentos covalentes usando o ensaio quantitativo de amarração irreversível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a triar fragmentos covalentes usando o ensaio qIT baseado em fluorescência para descoberta de fármacos. Este método identifica ligantes seletivos sem espectrometria de massas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Construção da biblioteca de fragmentos
<ol>
	<li>Projete uma biblioteca de fragmentos eletrofílicos e sintetize-os ou compre-os. As bibliotecas de fragmentos eletrofílicos geralmente consistem em eletrófilos levemente reativos (como acrilamidas, cloroacetamidas e vinil sulfonamidas) anexados a uma gama diversificada de andaimes químicos. Bibliotecas de fragmentos eletrofílicos estão amplamente disponíveis em fornecedores comerciais, e mais detalhes sobre seu projeto e construção são revisados em outro lugar 5,11.</li>
	<li>Dissolva cada composto em DMSO até uma concentração de 50 mM e, em seguida, dispense um composto diferente em cada poço das colunas 3 a 22 de uma placa reservatório de 384 poços, denominada Placa de Biblioteca de Fragmentos.<ol>
		<li>Dispensar DMSO em cada alvéolo das colunas 1, 2, 23 e 24 para os controlos positivo e negativo. O layout da placa pode variar dependendo do número de compostos que estão sendo peneirados (Figura 2). O volume adicionado à placa biblioteca dependerá do número de peneiras a serem realizadas, considerando que é necessário aproximadamente 1,8 μL de cada poço por peneira qIT. Preparar esta placa de biblioteca de fragmentos com antecedência e guardá-la a 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
Figura 2: Layout da placa. Uma visão geral do layout da placa de 384 poços do ensaio qIT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Configuração do ensaio (Figura 3)
<ol>
	<li>Prepare as seguintes soluções: solução de proteína recombinante (proteína-alvo em qualquer tampão), tampão de ensaio qIT (NaCl 150 mM, Hepes 25 mM (pH 8)), tampão de resfriamento de ensaio qIT (NaCl 150 mM, Hepes 25 mM (pH 7,5)) e soluções estoque compostas (fragmento eletrofílico (50 mM) em DMSO). NOTA: Um pH de 8 é usado no tampão de reação para acelerar a reação entre o resíduo de cisteína alvo e os fragmentos, permitindo que a taxa de reação seja medida mesmo para fragmentos extremamente levemente reativos. Um pH ligeiramente mais baixo de 7,5 é usado no tampão de têmpera, pois a ligação tioéter formada entre a maleimida do CPM e o tiol cisteína é propensa à hidrólise em pHs mais básicos (por exemplo, trabalhos anteriores descobriram que os conjugados cisteína-maleimida são muito mais estáveis em pH 7,3 do que pH 812).</li>
	<li>Remova as soluções de estoque de fragmentos de DMSO do armazenamento e deixe-as em temperatura ambiente por no mínimo 2 h para permitir que os estoques compostos descongelem.</li>
	<li>Degas qIT tampão de ensaio borbulhando com gás argônio por aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Troque completamente a solução de proteína-alvo em tampão de ensaio qIT desgaseificado. Crucialmente, agentes redutores como DTT e TCEP devem ser completamente removidos para concentrações &lt; 100 nM, pois eles interferirão na quantificação do tiol. Esta etapa pode ser executada por meio de uma série repetitiva de trocas de buffer, conforme descrito abaixo.<ol>
		<li>Diluir a solução proteica em excesso do tampão qIT desgaseificado numa unidade de filtro de centrifugação, concentrar por centrifugação (4000 x g, 4 °C, 15 min) e repetir. Normalmente, são necessárias 4 rodadas de diluições de 1 em 15 para remover suficientemente a TDT (1 mM) de 1 mL de solução estoque de proteína recombinante, embora essa etapa possa ser ajustada dependendo da concentração do agente redutor na solução de proteína recombinante original. NOTA: Alternativamente, dialisar a solução de proteína alvo contra um grande excesso de tampão de ensaio qIT desgaseificado pode alcançar o mesmo resultado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diluir a solução de proteína-alvo (produzida na etapa 2.1) até uma concentração de proteína de 15 μM em tampão qIT desgaseificado. Aproximadamente 9 mL de solução de proteína-alvo são necessários para preencher uma placa de 384 poços com volume morto suficiente.</li>
	<li>Preparar uma suspensão a 1,5% (v/v) de TCEP-agarose em tampão de ensaio qIT desgaseificado. São necessários aproximadamente 9 mL de suspensão de TCEP-agarose por placa de triagem.</li>
	<li>Dispense 20 μL de solução de TCEP-agarose em cada poço de duas placas de 384 poços.</li>
	<li>Preparar uma reserva de glutationa a 15 μM em tampão de ensaio qIT desgaseificado. Isso deve ser preparado imediatamente antes do plaqueamento, pois a glutationa oxida rapidamente em solução sem agente redutor.</li>
	<li>Dispense 20 μL de tampão de ensaio qIT nas colunas 1 e 2 de ambas as placas de 384 poços.</li>
	<li>Dispense 20 μL de proteína 15 μM ou solução de glutationa (de acordo com a placa pretendida) nas colunas 3-24 da placa de 384 poços. Estes são denominados Placa de Reação de Proteína e Placa de Reação de Glutationa. Deixar reduzir à temperatura dos ovos durante 1 h.</li>
	<li>Dispense 58,2 μL de tampão de ensaio qIT desgaseificado em cada poço de uma placa de 384 poços e, em seguida, transfira 1,8 μL de cada poço correspondente da Placa de Biblioteca de Fragmentos para criar uma Placa de Diluição de Composto, onde cada composto é diluído a uma concentração de 1,5 mM em tampão de ensaio qIT mais 3% de DMSO. NOTA: Esta etapa é facilitada com uma estação de pipetagem 384, que permite que os estoques compostos sejam transferidos para cada poço em uma operação.</li>
	<li>Após 1 h de incubação de proteína e glutationa com TCEP-agarose, transfira 20 μL de solução composta de cada poço da placa de diluição composta para as placas de reação de proteína e glutationa para iniciar o ensaio. Esta etapa também é facilitada com uma estação de pipetagem 384. As etapas do ensaio estão resumidas na Figura 3. NOTA: A concentração do fragmento pode ser variada conforme necessário, e os ensaios qIT podem ser repetidos para os acertos em concentrações mais baixas, se desejado, para confirmar que a afinidade da proteína não é um artefato da alta concentração do fragmento. A concentração relativamente alta do fragmento é usada para elevar o kpro e kGSH para garantir que as taxas precisas sejam determináveis para compostos levemente reativos (que podem exibir t1/2 (GSH) &gt; 24 h sob as condições do ensaio). Além disso, embora uma concentração de fragmentos de 500 μM seja alta, altas concentrações de μM a baixas mM têm sido usadas na triagem de fragmentos, por exemplo13.</li>
	<li>Inicie um cronômetro - o ensaio começou e as têmperas devem ser realizadas em pontos de tempo regulares, de acordo com a seção abaixo.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
Figura 3: resumo do ensaio qIT. Um resumo ilustrando as principais etapas da configuração do poço de reação do ensaio qIT. (criado usando BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. O CPM extingue
NOTA: As têmperas de CPM são realizadas para quantificar a quantidade de tiol não reagido restante nas placas de reação de proteína e glutationa. Estes devem ser realizados em pontos de tempo discretos (por exemplo, os seguintes pontos de tempo são normalmente usados: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 e 1440 min) para permitir que a cinética da reação seja monitorada.
<ol>
	<li>Prepare soluções de estoque CPM (500 μM) em DMSO, distribua-as em alíquotas de 111,2 μL em tubos de microcentrífuga e armazene-as a -20 °C. Esses estoques de CPM podem ser preparados com antecedência e 1 alíquota será necessária por ponto de tempo de extinção.</li>
	<li>Prepare a solução de resfriamento de CPM (1,4 μM) descongelando uma solução de estoque de CPM congelada (500 μM) e adicionando-a a 40 mL de tampão de resfriamento de ensaio qIT.</li>
	<li>Dispense 27 μL de solução de têmpera de CPM em cada poço de duas placas de 384 poços - duas são necessárias para extinguir as placas de reação de proteína e glutationa. Estas são denominadas placas de têmpera CPM, prepare-as no máximo 30 minutos antes do uso.</li>
	<li>Centrifugue a placa de reação de proteína a 200 x g por 3 min para garantir que a TCEP-agarose seja peletizada.</li>
	<li>Em pontos de tempo pré-determinados, transfira 3 μL de amostra de cada poço da placa de reação de proteína para uma placa de têmpera CPM pré-preenchida. Esta etapa também é simplificada usando uma estação de pipetagem 384.</li>
	<li>Misture a placa de têmpera CPM aspirando e dispensando 3 x 25 μL. É importante remover a amostra do topo do poço para evitar a aspiração da TCEP-agarose na parte inferior, o que interferirá na têmpera do CPM.</li>
	<li>Repita as etapas 3.4-3.6 com a placa de reação de glutationa.</li>
	<li>Incube as placas de têmpera CPM (preparadas em 3.4-3.6) à temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Medir a intensidade de fluorescência da placa de atenuação CPM (excitação a 384 nm e emissão a 470 nm).</li>
</ol>
4. Análise de dados e seleção de acertos
<ol>
	<li>Para cada têmpera, calcule Z' como uma medida da qualidade do ensaio. Quaisquer apagamentos de CPM com Z' &lt; 0,5 devem ser desconsiderados. Z' = 1 - ((3σcontrole positivo + 3σcontrole negativo) / (μcontrole positivo - μcontrole negativo)) Onde σ = desvio padrão da intensidade de fluorescência e μ = média da intensidade de fluorescência</li>
	<li>Calcular os valores médios de fluorescência para os alvéolos de controlo negativo e positivo (colunas 1 e 2 e 23 e 24, respectivamente).</li>
	<li>Normalizar bem cada reacção para os valores médios de fluorescência dos controlos positivo e negativo: % modificado = 100 x (fluorescência de poço composto - fluorescência de controlo negativo) / (fluorescência de controlo positivo - fluorescência de controlo negativo)</li>
	<li>Represente separadamente o gráfico % modificado em relação ao tempo para cada composto que reage com a glutationa e com a proteína-alvo.</li>
	<li>Ajuste os dados normalizados de % modificados em relação ao tempo a um modelo de decaimento exponencial de uma fase para a reação com proteína e com glutationa usando a equação: % Modificado = ae - kt + c Onde a = o intervalo de % de valores modificados, k = taxa de reação, t = tempo, c = o valor % modificado em tempo infinito. O ajuste da curva e a determinação dos parâmetros podem ser realizados usando software comercial (como o Graphpad).</li>
	<li>Use a taxa na qual os fragmentos reagem com proteína (kpro) e glutationa (kGSH) para calcular o valor do Fator de Aumento de Taxa (REF) para cada fragmento: REF = kpro / kGSH</li>
	<li>Use os valores REF para selecionar fragmentos de ocorrência. Isso pode ser feito definindo um limite REF (por exemplo, REF &gt; 3), uma taxa de acerto arbitrária (por exemplo, top 2%) ou selecionando fragmentos com desvios padrão REF 3 maiores que a média geométrica.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Amarração quantitativa-irreversível: triagem eficiente de ligantes eletrofílicos

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
<li>Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment-based+method+to+discover+irreversible+covalent+inhibitors+of+cysteine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases.</a> J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).</li>
<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

Os ligantes covalentes direcionados reativos à cisteína (moléculas que exercem um efeito biológico ao reagir com um resíduo de cisteína selecionado em uma proteína específica) tornaram-se cada vez mais populares como ferramentas químicas e terapêuticas nas últimas décadas1. Estes geralmente consistem em um eletrófilo levemente reativo (como acrilamida, cloroacetamida ou vinil sulfona) anexado a uma porção ligante com alta afinidade por uma proteína alvo2. Idealmente, a interação ligante-proteína ocorre por meio de um mecanismo de duas etapas envolvendo a ligação inicial do ligante não covalente, seguida pela formação de ligações covalentes irreversíveis entre a cisteína alvo e o eletrófilo3.
Vários ligantes covalentes direcionados iniciais, incluindo o inibidor de tirosina quinase de Bruton, ibrutinibe, foram desenvolvidos fornecendo um ligante reversível previamente identificado com uma alça eletrofílica4. No entanto, essa abordagem nem sempre é bem-sucedida, e outras tentativas descobriram que a instalação de eletrófilos requer otimização significativa5. Em vez disso, as abordagens eletrófilas, particularmente usando fragmentos eletrofílicos, tornaram-se mais populares nos últimos anos. Isso normalmente envolve a incubação de uma biblioteca de eletrófilos com uma proteína e, em seguida, a seleção de compostos com uma taxa aumentada de reação em direção a uma cisteína, que se supõe ser induzida por interações produtivas não covalentes entre o ligante e a bolsa de ligação6. Notavelmente, esses métodos foram aplicados com sucesso durante o desenvolvimento do inibidor de KRAS (G12C) Sotorasib1.
A triagem do primeiro eletrófilo apresenta vários desafios únicos quando comparada à triagem tradicional de ligantes não covalentes, principalmente devido à alta variabilidade na reatividade dentro e entre as classes de ogivas7. A maioria dos eletrófilos reativos à cisteína irá, com o tempo, reagir com todos os resíduos de cisteína expostos ao solvente, independentemente de qualquer interação seletiva para a proteína alvo. A ocupação do ligante, portanto, aumentará ao longo do tempo para quase todos os eletrófilos e, sem controlar a reatividade, a seleção de acertos geralmente será tendenciosa para fragmentos mais reativos que atingem um alvo mais rapidamente8.
Além disso, os métodos de triagem eletrófilos geralmente usam espectrometria de massa para detectar a formação de adutos proteína-ligante, que é limitada no rendimento9. A amostragem regular de reação é necessária por um longo período de tempo (horas a dias) para caracterizar adequadamente a cinética da reação para uma biblioteca de compostos com eletrofilicidade variada10. Uma triagem de 300 fragmentos amostrados em 10 pontos de tempo exigirá, portanto, a realização de 3000 espectros de massa, excedendo o rendimento da maioria dos sistemas de espectrometria de massa de proteínas. Métodos de maior rendimento de monitoramento da formação de adutos proteína-ligante são, portanto, desejáveis.
A abordagem descrita aqui, o ensaio de tethering quantificado irreversível (qIT), é um método de triagem eletrófilo que controla a reatividade intrínseca e utiliza uma leitura de fluorescência simples7. Proteínas, ou glutationa (um tripeptídeo não estruturado contendo tiol usado como controle da reatividade intrínseca) são incubadas com uma biblioteca de fragmentos eletrofílicos e amostras regulares coletadas para têmpera em uma solução de CPM (7-dietilamino-3- (4'-maleimidilfenil) -4-metilcumarina, um agente fluorogênico de quantificação de tiol). A formação de adutos entre a cisteína e o fragmento eletrofílico reduz a quantidade de tiol disponível para reação com CPM, reduzindo a fluorescência resultante na têmpera. A fluorescência CPM, portanto, atua como um proxy para o tiol não reagido, permitindo que a cinética da reação do tiol com cada fragmento eletrofílico seja determinada. Fragmentos eletrofílicos com reatividade proteica significativamente aumentada sobre a glutationa são selecionados como hits e priorizados para desenvolvimento posterior (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema do qIT. Uma visão geral esquemática do ensaio qIT. (criado usando BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A seleção de acertos usando valores REF controla a reatividade intrínseca e garante que os fragmentos sejam selecionados como acertos apenas se formarem interações produtivas não covalentes com um alvo de proteína. A leitura simples de fluorescência também significa que o ensaio qIT é altamente escalável e não requer métodos de monitoramento de reação baseados em espectrometria de massa.
Aqui, um procedimento abrangente para o ensaio qIT é descrito, com exemplos de resultados incluídos para ilustrar o desempenho do ensaio e a seleção de acertos.

<table><tbody><tr><td>Gás argônio</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 poços, flange baixo, placas de ensaio de fundo plano</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-agarose imobilizado</td><td>Pierce</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selos de placa de PCR</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hepes de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

triagem de fragmentos covalentes usando o ensaio quantitativo de amarração irreversível

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

O ensaio qIT é usado aqui para identificar fragmentos covalentes para uma proteína de cisteína única sem nome. MgCl2 (10 mM) foi adicionado aos tampões de reação, pois a proteína-alvo é conhecida por se ligar a íons Mg2+ . A triagem foi realizada em triplicata, e a taxa na qual cada fragmento reagiu com a proteína alvo (kpro) e a glutationa (kGSH) foi determinada. Os valores de Z' foram maiores que 0,5 para todas as placas de têmpera e a média foi de 0,75 para têmperas de proteína e 0,79 para têmperas de glutationa, indicando excelente desempenho do ensaio. Os valores de REF foram então calculados para cada fragmento e os acertos selecionados onde REF &gt; 3.
Os resultados representativos (Figura 4) fornecem um exemplo de seleção de acertos usando o ensaio qIT. O composto 1 reagiu a uma taxa 6,0 vezes maior com o resíduo de cisteína na proteína-alvo do que com a glutationa e, usando um critério de REF &gt; 3, foi selecionado como acerto (Figura 4B). Essa aceleração da taxa indica a presença de um efeito de modelagem, pelo qual as interações não covalentes posicionam 1 na orientação correta para a cisteína na proteína alvo reagir com a ogiva de cloroacetamida. Em contraste, 2 é um exemplo de fragmento não atingido, pois a reação entre 2 e o resíduo de cisteína alvo não é acelerada em relação à reação entre 2 e glutationa. A falta de aceleração da taxa indica que não há interações não covalentes produtivas posicionando 2 na orientação correta para reagir com o resíduo de cisteína alvo.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Resultados representativos. Os resultados mostram o monitoramento da reação de proteína e glutationa por qIT para (A) uma alta reatividade intrínseca, um possível fragmento de hit falso-positivo e (B) um fragmento de hit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Triagem de fragmentos covalentes usando o ensaio quantitativo de amarração irreversível

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A interacção entre os canais HCN e a sua sub-unidade auxiliar tem sido identificada como um alvo terapêutico em Perturbação Depressiva Major. Aqui, um método baseado em polarização de fluorescência para identificar pequenas moléculas inibidoras desta interacção proteína-proteína, é apresentada.

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Neste artigo, discute-se um protocolo detalhado para quantificar o comprimento do telômetro usando uma análise do fragmento de restrição terminal modificada que fornece uma medição direta rápida e eficiente do comprimento do telômero. Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de fontes celulares de DNA para quantificar o comprimento dos telômeros.

Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

A triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin é realizada usando um fluxo de trabalho com bibliotecas compostas dedicadas, ferramentas de manuseio de cristais, instalações rápidas de coleta de dados e análise de dados amplamente automatizada. O protocolo apresentado pretende maximizar a produção de tais experimentos para fornecer pontos de partida promissores para o design de ligante baseado em estrutura a jusante.

Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin

A triagem baseada em fragmentos por RMN é um método robusto para identificar rapidamente ligantes de pequenas moléculas a biomacromoléculas (DNA, RNA ou proteínas). Protocolos descrevendo a preparação de amostras baseada em automação, experimentos de RMN e condições de aquisição e fluxos de trabalho de análise são apresentados. A técnica permite a exploração ideal de núcleos ativos de RMN de 1H e 19F para detecção.

Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Este artigo descreve o processo completo do XChem para triagem de fragmentos à base de cristal, desde a solicitação de acesso e todas as etapas subsequentes até a disseminação dos dados.

Alcançando a triagem eficiente de fragmentos nas instalações da XChem na Diamond Light Source

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN).  Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Aprenda a triar fragmentos covalentes usando o ensaio qIT baseado em fluorescência para descoberta de fármacos. Este método identifica ligantes seletivos sem espectrometria de massas.

Triagem de fragmentos covalentes usando o ensaio quantitativo de amarração irreversível

Explorar mais vídeos