Name: Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a polarizar e caracterizar macrófagos M1 e M2 derivados de monócitos humanos em superfícies de implantes de titânio. Este protocolo padronizado utiliza qRT-PCR, ELISA e CLSM para avaliar perfis de citocinas e marcadores de superfície celular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação dos efeitos imunomoduladores das superfícies dos implantes em macrófagos

<ol><li>Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+interactions+between+biomaterials+and+biological+systems+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics.</a> Biomaterials. 167, 191-204 (2018).</li>
<li>Ikada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Challenges in tissue engineering.</a> J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).</li>
<li>Aamodt, J. M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+biomaterial+scaffolds+and+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response.</a> Biomaterials. 86, 68-82 (2016).</li>
<li>Batool, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune-inflammatory+responses+through+surface+modifications+of+biomaterials+to+promote+bone+healing+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration.</a> J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).</li>
<li>Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization+in+tissue+repair+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling.</a> J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).</li>
<li>Shrivastava, R., Shukla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attributes+of+alternatively+activated+%28M2%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Attributes of alternatively activated (M2) macrophages.</a> Life Sci. 224, 222-231 (2019).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+responses+to+implants%3A+prospects+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).</li>
<li>Browne, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-mediated+modification+of+the+local+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).</li>
<li>Piatnitskaia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+macrophage+responses+to+biomaterials+in+vitro%3A+state-of-the-art+and+the+need+for+the+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement.</a> Front Immunol. 15, 1349461(2024).</li>
<li>Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+macrophages+in+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Activation of macrophages in response to biomaterials.</a> Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages%3A+heterogeneity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biol. 15 (1), 53(2017).</li>
<li>Salma Iqbal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+generated+human+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro generated human polarized macrophages.</a> J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).</li>
<li>Hotchkiss, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surface+characteristics%2C+including+topography+and+wettability%2C+alter+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation.</a> Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+behavior+and+interplay+with+gingival+fibroblasts+cultured+on+six+commercially+available+titanium%2C+zirconium%2C+and+titanium-zirconium+dental+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants.</a> Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).</li>
<li>Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+characteristics+on+commercial+dental+implants+differentially+activate+macrophages+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Implants+Res%22%5BJournal%5D)">Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo.</a> Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+osseointegration+of+strontium-modified+titanium+implants+by+regulating+angiogenesis+and+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization.</a> Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstacles+and+opportunities+for+understanding+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization.</a> J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).</li>
<li>Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+monocytic+cell+lines+U937+and+THP-1+as+macrophage+models+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).</li>
<li>Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+the+viability+and+growth+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells.</a> J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+type+modulates+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs.</a> Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).</li>
<li>Cerqueira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+inflammatory+responses+to+sol-gel+coatings+with+distinct+biocompatibility+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels.</a> J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surfaces+characteristics+modulate+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).</li>
<li>Nobs, S. P., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+guardians+of+organ+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis.</a> Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).</li>
<li>Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+diversity+of+macrophages+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origins and diversity of macrophages in health and disease.</a> Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).</li>
<li>Parisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+human+primary+macrophages+to+study+the+polarization+from+monocyte-derived+macrophages+to+pro-or+anti-inflammatory+macrophages+at+biomaterial+interface+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro.</a> J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).</li>
<li>Feuerer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+retrieval+from+3D+biomaterials%3A+A+detailed+comparison+of+common+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods.</a> J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+based+modulation+of+macrophage+polarization%3A+a+review+and+suggested+design+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles.</a> Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 poços, não tratada</td><td>Corning Incorporated (Kennebunk, EUA)&nbsp;</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de absorbância Infinite F50&nbsp;</td><td>A TECAN Austria GmbH (Gr&ouml; dig, Áustria)</td><td>TCAT91000001</td><td></td></tr><tr><td>Accutase em DPBS, 0,5 mM EDTA</td><td>EMD Millipore Corp. (Burlington, EUA)</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem de Fluorescência Anti-Desbotamento -Aquoso, Fluoroshield</td><td>abcam (Cambridge, Reino Unido)</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Termociclador</td><td>Bio-Rad / MJ Research</td><td>7212</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR International bvba (Leuven, Bélgica)</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R</td><td>Eppendorf SE (Hamburgo, Alemanha)</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>DC-SIGN (D7F5C) Tecnologia</td><td>de sinalização de células</td> mAb XP Rabbit <td>13193</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, EUA)</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração DRAQ5</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha)</td><td>130-117-344</td><td></td></tr><tr><td>Etanol &ge; 99,8% para biologia molecular</td><td>Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>1HPH.1</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato caprino (H& L) Anticorpo secundário altamente adsorvido , Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723TR</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secundário de cabra anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Cyanine3</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>GraphPad Version&nbsp; 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CCR7 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB197</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Recombinante Humano IFN-gama</td><td>(Rockford, EUA)</td><td>RIFNG100</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-13</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>)5230901032</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-4</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha)</td><td>130-095-373</td><td></td></tr><tr><td>Humano M-CSF</td><td>Peprotech (Cranbury, EUA)</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Alemanha)</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/</td><td></td></tr> <tr><td>Lipopolissacarídeos da Escherichia</td><td>Sigma Aldrich Co. (Missouri, EUA)</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Luna Universal qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Kit New England Biolabs</td><td>NEB #M3003</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010L</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Separação de Linfócitos 1077</td><td>PromoCell (Heidelberg, Alemanha)</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MCP-4/CCL13 Kit ELISA Humano</td><td>Invitrogen</td><td>EHCCL13</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de Reação Rápida de 96 Poços (0,1 mL)</td><td>Applied Biosystems (Waltham, EUA)</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Filme Adesivo Óptico MicroAmp</td><td>Life Technologies Corporation (Carlsbad, EUA)</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Base de 96 Poços Sem Salpicos</td><td>Applied Biosystems (Waltham, EUA</td><td>)4312063</td><td></td></tr><tr><td>Microlitercentrifuge CD-3124R</td><td>Phoenix Instrument (Alemanha</td><td>)9013111121</td><td></td></tr><tr><td>Vidros de Cobertura de Microscópio, 10 mm</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>4HX4.1</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Fixação de Monócitos</td><td>PromoCell (Heidelberg, Alemanha)</td><td>C-28051</td><td></td></tr><tr><td>Multiply-Pro Gef&auml; &szlig; 0,5 mL, PP</td><td>Sarstedt AG & CO (N&uuml; mbrecht, Alemanha)</td><td>7,27,35,100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific (EUA)</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio&nbsp; 3 System</td><td>Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Alemanha)</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74007</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1x, com L-glutamina</td><td>Mediatech, Inc. (Manassas, EUA)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bancada Estéril, LaminarAir HB 2472&nbsp;</td><td>Instrumentos Heraeus (Hanau, Alemanha)</td><td>51012197</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas para Cultura de Tecidos 13 mm (Plástico)</td><td>Sarstedt Inc. (Newton, EUA)</td><td>83,18,40,002</td><td></td></tr><tr><td>Discos usinados de titânio 12 cm&nbsp;</td><td>Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Alemanha)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TNF alpha Human ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>KHC3011</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano 0,4%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>1680,1</td><td></td></tr></tbody></table>

polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos m1 e m2 em superfícies de implantes 

Polarization and Characterization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Macrophages on Implant Surfaces

Os resultados deste estudo demonstram diferenciação e polarização bem-sucedidas de MDMs em superfícies de titânio, seguidas pela caracterização de macrófagos polarizados M1 ou M2. Na primeira etapa, caracterizamos MDMs polarizados usando CLSM. Com base em nossos estudos preliminares, CD209 e CCR7 foram usados como marcadores específicos para diferenciar MDMs polarizados M1 de M2. Conforme mostrado na Figura 2A, B, os MDMs polarizaram com sucesso em macrófagos M1 e M2. Na superfície de titânio, o CCR7 foi expresso mais fortemente em macrófagos polarizados M1 do que CD209, expresso especificamente em macrófagos polarizados M2. Além disso, a quantificação da intensidade relativa de fluorescência facilitou a atribuição de marcadores aos subtipos M1 ou M2 (Figura 2C).
A Figura 3 mostra uma análise representativa de qRT-PCR de MDMs em superfícies de titânio e lamínula. Os resultados mostraram que os MDMs em ambas as superfícies foram polarizados com sucesso, como demonstrado pela alta expressão dos marcadores de polarização M1 (CCR7 e TNF-ɑ) e M2 (CD209 e CCL13). Isso foi confirmado no nível da proteína pela observação de altos níveis de citocinas inflamatórias TNF-α ( Figura 4A ) e quimiocinas de IL-13 ( Figura 4B ) em células polarizadas M1 e M2, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig02v2.jpg"> Figura 2: Caracterização de MDMs polarizados usando CLSM. O enriquecimento de macrófagos polarizados M1 e M2 foi confirmado por coloração de anticorpos específicos e análise de CLSM usando anticorpos CCR7 e CD209 no dia 2 de pós-semeadura. De acordo com a coloração de fluorescência e análise CLSM, (A) ampliação de 25x e (B) ampliação de 63x, as células M1 expressaram CCR7 mais alto (em verde) do que M0 ou M2. As células M2 exibem um padrão significativo de expressão de CD209 (em verde). (C) A análise quantitativa da intensidade relativa de fluorescência de CCR7 e CD209. Os núcleos foram corados com DRAQ5 (em roxo). Os resultados são representativos de 5 experimentos semelhantes realizados de forma independente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização de MDMs polarizados usando perfis de expressão gênica. A polimerase quantitativa de transcrição reversa foi usada para estudar os níveis de mRNA de diferentes genes associados à polarização M1 (CCR7 e TNF-ɑ) e M2 (CD209 e CCL13). GAPDH foi usado como gene de limpeza. Os dados são apresentados como média ± EPM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig04.jpg"> Figura 4: Produção de citocinas por macrófagos M0, M1 e M2 cultivados em lamínulas de titânio e plástico. (A) O nível de citocinas TNF-ɑ e (B) os níveis de CCL13 nos sobrenadantes da cultura de células foram medidos usando ELISA. A secreção de citocinas foi normalizada para a secreção total de proteínas medida pelo ensaio de BCA. Os gráficos de barras representam a média ± EPM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tampão/Solução</td>
			<td>Conteúdo</td>
		</tr><tr><td>Mancha/Bloqueio de tampão</td>
			<td>PBS + 1% BSA + 0,1% Tween 20</td>
		</tr><tr><td>Tampão de lavagem</td>
			<td>PBS + 0,1% Tween 20</td>
		</tr><tr><td>Tampão de fixação</td>
			<td>3% de Paraformaldeído (PFA) em PBS</td>
		</tr><tr><td>Buffer de armazenamento</td>
			<td>1% de penicilina e estreptomicina na PBS</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista de buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome do primer</td>
			<td>Sequências diretas de primers</td>
			<td>Sequências de primer reverso</td>
		</tr><tr><td>GAPDH</td>
			<td>5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'</td>
			<td>5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'</td>
		</tr><tr><td>CCR7</td>
			<td>5'- TGGTGATCGGCTTTCTGGTC-3'</td>
			<td>5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'</td>
		</tr><tr><td>CD209</td>
			<td>5'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'</td>
			<td>5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCTCCT-3'</td>
		</tr><tr><td>CCL13</td>
			<td>5'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'</td>
			<td>5'-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3'</td>
		</tr><tr><td>TNF-ɑ</td>
			<td>5'- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'</td>
			<td>5'- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2. Sequências de primers usados em qRT-PCR.

Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes 

Foreign body reaction (FBR), an immune-mediated complex healing process, plays a crucial role in integrating implants into the body. Macrophages, as the ...

polarization-characterization-m1-m2-human-monocyte-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para induzir a diferenciação e polarização de monócitos derivados do sangue periférico em macrófagos M1 ou M2. A incubação com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, lipopolissacarídeo e interferon-gama produz macrófagos M1 pró-inflamatórios, enquanto a incubação com fator estimulador de colônias de macrófagos e interleucina-4 induz a produção de macrófagos M2 anti-inflamatórios.

Diferenciação e Polarização de Células Derivadas de Monócitos em Células Semelhantes a Macrófagos

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Este protocolo fornece um método para estudar a infecção por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos m1 ou M2 polarizados humanos baseados na diferenciação de monócitos periféricos-sanguíneos para células semelhantes a macrófagos que são infectados com a cepa virulenta H37Rv, e analisado com citometria de fluxo usando um painel de 10 cores, incluindo a expressão de marcadores M1/M2 selecionados.

Polarização de Células e Análises Derivadas de Monócitos Humanos M1 e M2 com Citometria de Fluxo sobre Infecção por Mycobacterium tuberculosis

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Aprenda a polarizar e caracterizar macrófagos M1 e M2 derivados de monócitos humanos em superfícies de implantes de titânio. Este protocolo padronizado utiliza qRT-PCR, ELISA e CLSM para avaliar perfis de citocinas e marcadores de superfície celular.

Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes

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