Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

A respiração mitocondrial é um dos principais geradores de energia celular na maioria das circunstâncias e um importante indicador do metabolismo e aptidão celular. Assim, as funções mitocondriais delineiam o estado celular bioenergético. Este protocolo descreve uma técnica para quantificar a respiração mitocondrial em células vivas G como um parâmetro bioenergético.

A técnica descrita neste protocolo nos ajuda a definir o mecanismo bioenergético de alguns polifenóis, como o resveratrol e o coirciteno. Também serviu como uma ferramenta para medir o metabolismo da pentose, também de PTSPTs e explicou a mudança bioenergética por trás da árvore da cabine e os efeitos do trabalho no solo. Estamos interessados em decifrar como as células adquirem alguns fenótipos, como efeitos de árvore de táxi e trabalho de solo, com mudanças significativas na bioenergética celular.

A respiração mitocondrial é uma ferramenta essencial para elucidar os mecanismos moleculares por trás desse fenômeno metabólico. Para começar, inocule um tubo de ensaio de vidro de 10 mililitros contendo três mililitros de meio YPD com 250 microlitros de células de levedura preservadas em glicerol. Incubar o tubo de ensaio durante a noite a 30 graus Celsius com agitação constante a 200 rotações por minuto.

Em seguida, usando um laço estéril, risque uma placa de trado YPD com as células de levedura cultivadas no tubo de ensaio de vidro de 10 mililitros. Incube a placa de Petri a 30 graus Celsius até que apareçam colônias isoladas. Para preparar um pré-inóculo, inocular três mililitros de meio YPD a 2% de glicose com duas ou três colônias isoladas de levedura e incubar.

Em seguida, obter 100 mililitros de meio sintético completo estéril em um Erlenmeyer de 500 mililitros. Inocular o meio com a cultura de levedura pré-inóculo durante a noite a uma densidade óptica inicial de 0,1 a 600 nanômetros. Adicione o desafio químico, como 100 micromolares de resveratrol para testar a respiração mitocondrial.

Em seguida, despeje as células da fase logarítmica intermediária em um tubo cônico vazio de 15 mililitros pré-pesado e centrifugue as células a 4.000 G por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet três vezes com 25 mililitros de água deionizada. Pese o tubo cônico contendo o pellet lavado para obter o peso úmido subtraindo o peso do tubo vazio.

Em seguida, ressuspenda o pellet lavado em dois mililitros de água deionizada. Para começar, obtenha as células de levedura tratadas com medicamentos apropriados, como o resveratrol. Coloque cinco mililitros de tampão MES-TEA de 10 milimolares e 50 miligramas de células úmidas na câmara de enxerto polar.

Delicadamente, posicione o eletrodo de oxigênio tipo Clark, garantindo que nenhuma bolha seja formada. Ligue o monitor YSI 5300A e o computador de aquisição de dados. Selecione o seletor de configuração do canal um para o ar e ajuste o canal um para 100% com o seletor de calibração do canal um.

Comece a registrar os dados e comece a medir o tempo usando um cronômetro. Com uma seringa de cromatografia, adicionar o substrato oxidável a uma concentração final de 10 milimolares e manter a câmara fechada com agitação constante. Em seguida, empregando uma seringa de cromatografia, adicione oligomicina para obter uma concentração final de 0,01 milimolar na câmara do oxímetro e registre o consumo percentual de ar.

Da mesma forma, adicione CCCP a uma concentração final de 0,015 milimolar na câmara do oxímetro para determinar a capacidade respiratória máxima. Em seguida, adicione inibidores da cadeia de transporte de elétrons, triflurositona dentária e oleosa, ou TTFA, em um milimolar, seguido de antimicina A em um miligrama por mililitro. Lave a câmara três vezes cada com etanol a 70%, seguido de água deionizada, antes de prosseguir para a próxima fonte de carbono.

Para começar, realize um ensaio de consumo de oxigênio com células de levedura, usando várias fontes e controles de carbono. Crie um novo file de projeto no software estatístico e selecione XY na seção create. Em seguida, selecione inserir ou importar dados para uma nova tabela na seção da tabela de dados.

Na seção de opções, selecione números na subseção X e na subseção Y. Clique em inserir três valores replicados em subcolunas lado a lado. Insira os dados de tempo nas colunas X e insira os dados de porcentagem de ar nas colunas Y.

Para executar uma análise de regressão linear, clique em analisar na barra de menus e, em análise, selecione regressão linear simples na análise XY e clique em OK. Obtenha o valor da inclinação na seção de resultados nas tabelas de dados. Copie os valores de inclinação calculados em uma planilha de dados.

Subtraia o valor de inclinação obtido da mistura de inibidores respiratórios Mix daqueles do substrato oxidável, oligomicina e CCCP para descartar outras fontes de consumo de oxigênio. Agora, multiplique os valores de inclinação por 237 micromolares de oxigênio, que representa a solubilidade do oxigênio nessa condição, e tampão. Converta os valores em micromolar de oxigênio por minuto, ajustando de acordo com o tempo plotado.

Divida os resultados por 50, representando os miligramas de células usadas no experimento. Finalmente, o consumo de oxigênio é expresso como micromolar de oxigênio por miligrama de células por minuto. As células cultivadas em glicose a 0,5% apresentaram consumo de oxigênio significativamente maior na respiração basal, respiração ligada ao ATP e capacidade respiratória máxima, em comparação com aquelas cultivadas em glicose a 5%.

A quercetina reduziu significativamente a respiração mitocondrial em células cultivadas com 0,5% de glicose, afetando a respiração basal, ligada ao ATP e máxima. Por outro lado, a quercetina não afetou significativamente a respiração mitocondrial nas células, crescidas em 5% de glicose.