Name: Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda a quantificar a respiração mitocondrial em células inteiras de levedura como parâmetro bioenergético. Este método revela os mecanismos bioenergéticos de polifenóis como o resveratrol.

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<meta charset="utf8"></head><body>Medindo a respiração mitocondrial da levedura enquanto mantém o contexto celular

<ol><li>Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+respiration+within+cells+with+increased+open+pore+cytoskeletal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes.</a> Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+rotor+components+of+yeast+mitochondrial+ATP+synthase+are+mechanically+coupled+by+subunit+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).</li>
<li>Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+metabolism+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in metabolism and cell death.</a> Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).</li>
<li>Matus-Ortega, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+complexes+containing+the+internal+alternative+NADH+dehydrogenase+%28Ndi1%29+in+mitochondria+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).</li>
<li>Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+pumping+complex+I+increases+growth+yield+in+Candida+utilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys%22%5BJournal%5D)">Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis.</a> Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li>
<li>Lasserre, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+system+for+modeling+mitochondrial+disease+mechanisms+and+discovering+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies.</a> Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).</li>
<li>Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B%2FATP+ratio+of+proton+transport-coupled+ATP+synthesis+and+hydrolysis+catalysed+by+CF0F1-liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes.</a> EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alternative+respiration+system+of+Scheffersomyces+stipitis+and+effect+on+glucose+or+xylose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation.</a> FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snf1p%2FHxk2p%2FMig1p+pathway+regulates+hexose+transporters+transcript+levels%2C+affecting+the+exponential+growth+and+mitochondrial+respiration+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae.</a> Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).</li>
<li>Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+potential+of+yeast+cells+depends+on+overall+action+of+interconnected+changes+in+central+carbon+metabolism%2C+cellular+biosynthetic+capacity%2C+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+is+required+to+provide+amino+acids+during+fermentative+proliferation+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast.</a> EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+quercetin+is+related+to+mitochondrial+respiration+impairment+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
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<li>Katzmann, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+ATP-binding+cassette+transporter-encoding+gene+%28YOR1%29+is+required+for+oligomycin+resistance+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+increases+glycolytic+flux+in+Saccharomyces+cerevisiae+via+a+SNF1-dependet+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerr+Biomemb%22%5BJournal%5D)">Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism.</a> J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).</li>
<li>Gueguen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+directly+binds+to+mitochondrial+complex+I+and+increases+oxidative+stress+in+brain+mitochondria+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice.</a> PloS One. 10 (12), e0144290(2015).</li>
<li>Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+and+cytochrome+c+are+molecular+targets+of+flavonoids+that+inhibit+hydrogen+peroxide+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).</li>
<li>de Oliveira, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+and+the+mitochondria%3A+A+mechanistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view.</a> Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrillo-Garmendia%2C+A+%22Mol+Cell+Biochem%22">Mol Cell Biochem</a>. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2- tenoiltrifluoroacetona (TTFA)</td><td>Merck</td><td>T27006</td><td>Complexo inibidor II</td></tr><tr><td>3-clorofenilhidrazona carbonil cianeto (CCCP)</td><td>Merck</td><td>C2759</td><td>Desacoplador de respiração mitocondrial&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Absolut etanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Para dissolver a quercetina&nbsp;</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Merck</td><td>A1296</td><td>YPD preparação de ágar</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio granular (NH4)2SO4</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-05</td><td>SC preparação de caldo</td></tr><tr><td>Antimicina A (AA)</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>Complexo inibidor III</td></tr><tr><td>aYSI5300A</td><td>----</td><td>----</td><td>Monitor&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Z 206 A</td><td>Para centrifugação de células</td></tr><tr><td>tipo Clark oxigênio</td><td>----</td><td>----</td><td>Eletrodo&nbsp;</td></tr><tr><td>Computador</td><td>----</td><td>----</td><td>Para aquisição de dados&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato dipotássico K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-05</td><td>SC preparação de caldo</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>YPD preparação de caldo</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>Suplementação de substrato médio&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplementação de substrato Lactate</td><td>Merck</td><td>L1250</td><td>em meio&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>Inibição da ATP sintase mitocondrial</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHKE6000</td><td>Inóculo incubação tubos de vidro e frasco&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptona de caseína, digestão enzimática</td><td>Merck</td><td>82303</td><td>YPD preparação de caldo</td></tr><tr><td>Quercetina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>337951</td><td>Para diminuir a respiração mitocondrial</td></tr><tr><td>Uracila</td><td>Preparação do caldo</td> <td>Merck</td><td>U0750</td> SC</tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Merck</td><td>Y1625</td><td>YPD preparação do caldo</td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônio</td><td>Merck</td><td>Y1251</td><td>SC preparação do caldo</td></tr><tr><td>Levedura sintética Suplementos médios sem uracila</td><td>Merck</td><td>Y1501</td><td>SC preparação do caldo</td></tr></tbody></table>

quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Esta técnica de respiração mitocondrial pode ser usada para outras espécies de leveduras além de S. cerevisiae, como Scheffersomyces stipitis15 e K. marxianus16. No entanto, para fins representativos, apresentamos apenas resultados de S. cerevisiae. Sabe-se que S. cerevisiae apresenta um metabolismo respiratório predominante em baixas concentrações de glicose (abaixo de 0,8 mM)17,18. Assim, para corroborar o fenótipo respiratório de S. cerevisiae, ele foi cultivado em duas concentrações de glicose para estimular (0,5% de glicose) e limitar (5% de glicose) a respiração mitocondrial18,19. Como esperado, os resultados obtidos na respiração basal (substrato oxidável), respiração ligada ao ATP (oligomicina) e capacidade respiratória máxima (CCCP) validam o metabolismo energético característico de S. cerevisiae (Figura 2). Observamos valores mais elevados de consumo de oxigênio (respiração basal, respiração ligada ao ATP e capacidade respiratória máxima) nas células cultivadas com glicose a 0,5% em comparação com os valores obtidos nas células cultivadas com glicose a 5% (Figura 2).
Além disso, os ensaios utilizaram três substratos: glicose, glicerol e L-lactato. O objetivo do emprego de diversos substratos é avaliar diferentes partes da cadeia respiratória mitocondrial. Nessas condições, a respiração mitocondrial não apresentou alterações significativas dependentes do substrato, uma vez que nenhum tratamento para perturbar a cadeia respiratória foi adicionado (Figura 2).
Utilizamos a quercetina para avaliar a capacidade da técnica, um composto que influencia negativamente a respiração mitocondrial20. Os dados obtidos mostraram que a quercetina diminuiu significativamente a respiração mitocondrial em células cultivadas em meio suplementado com glicose a 0,5% (Figura 3). Por outro lado, as células cultivadas em meio suplementado com glicose a 5% não apresentaram influência negativa significativa da quercetina (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig01.jpg"> 
Figura 1: Curva representativa de consumo de oxigênio. Curva de consumo de oxigênio obtida em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (0,5% de glicose). As cores representam diferentes inclinações obtidas no substrato, desacopladores e suplementação de inibidores. Verde: O substrato utilizou glicose e respiração basal correspondente à inclinação. Azul: oligomicina, inibidor da ATP sintase, inclinação empregada para determinação da respiração ligada ao ATP. Amarelo: CCCP, desacoplador, inclinação usada para avaliar a respiração máxima. Cinza e vermelho: complexo inibidor II e III, respectivamente; inclinação empregada para determinar o consumo de oxigênio não dependente das mitocôndrias. Abreviaturas: CCCP = 3-clorofenilhidrazona carbonila-cianeto; TTFA = 2- tenoiltrifluoroacetona; AA = antimicina A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig02.jpg"> 
Figura 2: Ensaios de consumo de oxigênio em células de S. cerevisiae cultivadas a 0,5% e 5% de glicose. A respiração mitocondrial é avaliada através do consumo de oxigênio medido na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em SC suplementadas com 0,5% e 5% de glicose. Três substratos foram utilizados para avaliar sua influência específica na cadeia de transporte de elétrons: glicose (NADH desidrogenase), glicerol (pool de ubiquinona) e L-lactato (citocromo c). (A) Respiração basal a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substratos; (B) respiração máxima a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substratos; (C) Respiração ligada ao ATP a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substrato. Os resultados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes, com cada experimento tendo duas repetições técnicas. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey (p ≤ 0,05; letras diferentes: diferença significativa, mesmas letras: sem diferença significativa) para análise estatística. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig03_.jpg"> 
Figura 3: A quercetina limitou a respiração mitocondrial em baixa concentração de glicose em células de S. cerevisiae cultivadas. A medição do consumo de oxigênio foi realizada na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (glicose a 0,5%) suplementada com quercetina (100 μM). O etanol foi usado para dissolver a solução de quercetina. Os resultados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes, com cada experimento tendo duas repetições técnicas. As análises estatísticas foram feitas por meio de um teste t de Student pareado (*, ** p ≤ 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig03_large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig04_.jpg"> 
Figura 4: A quercetina não afeta a respiração mitocondrial em alta concentração de glicose em S. cerevisiae. O consumo de oxigênio foi medido na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (glicose a 5%) suplementada com quercetina (100 μM). O etanol é usado para dissolver a solução de quercetina. Os resultados mostram ± médio DP de três experimentos independentes, cada um com duas repetições técnicas. As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste t de Student pareado (p ≤ 0,05; ns: não significativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig04_large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

mitochondrial-respiration-quantification-in-yeast-whole-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Aprenda a quantificar a respiração mitocondrial em células inteiras de levedura como parâmetro bioenergético. Este método revela os mecanismos bioenergéticos de polifenóis como o resveratrol.

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

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