Técnica otimizada e simplificada para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão

Os protocolos para produzir e cultivar fatias de fígado cortadas com precisão, ou PCLS, podem variar drasticamente. A principal desvantagem do PCLS é sua meia-vida curta, mas aqui, demonstramos que a produção e o cultivo de PCLS podem ser alcançados em condições padrão de laboratório com acesso ao Vibratome, garantindo uma meia-vida de pelo menos quatro dias. PCLS, um modelo atraente que preenche as lacunas entre os modelos in vitro e in vivo, mas muitas vezes são negligenciados devido à sua meia-vida relativamente curta. No entanto, eles contêm todos os tipos de células e uma arquitetura preservada, essencial para a soma metabólica e, portanto, se assemelham a um mini modelo de todo o órgão, permitindo o estudo e tratamento de tecidos vivos enquanto replicam seus fenótipos complexos. Fatias contínuas são um processo muito simples, mas tecnicamente desafiador. Para facilitar isso, nosso protocolo se concentra em etapas importantes, como a orientação do corte e a incorporação do tecido, mas também a relevância de um mini modelo de volume para cultura e um sistema dinâmico para aumentar sua meia-vida.

[Narrador] Antes da colheita, prepare um litro de tampão Krebs-Henseleit, uma bandeja de vibratome desinfetada e resfriada, lâminas de vibratome autoclavadas e 4% de agarose de baixo ponto de fusão. No dia da colheita, mantenha a agarose derretida em banho-maria a 37 graus Celsius até o uso. Em seguida, prepare as placas de cultura adicionando 2,6, 1,5 e 0,7 mililitros de meio completo por poço em placas de seis, 12 e 24 poços, respectivamente. Insira inserções porosas de oito micrômetros em cada poço. Coloque as placas em uma incubadora umidificada ajustada para 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Esterilize todos os instrumentos necessários para a colheita usando métodos de esterilização apropriados. Pulverize o abdômen do camundongo sacrificado com etanol 70% para desinfetar a área. Usando uma pinça e tesoura estéreis, corte a pele e o peritônio do meio do abdômen para abrir a cavidade abdominal. Disseque suavemente o fígado dos órgãos ou vasos circundantes, evitando danos aos lobos. Em seguida, armazene todo o fígado imediatamente em tampão Krebs gelado. Usando uma pinça romba e uma faca ou tesoura afiada e estéril, separe cada lóbulo individualmente para evitar danificar os lóbulos durante a separação. Usando uma faca afiada e estéril, apare todas as bordas do lóbulo escolhido para criar bordas retas e gerenciáveis para incorporação. Em seguida, despeje a agarose de baixo ponto de fusão a 4% em uma placa de Petri de três centímetros colocada sobre gelo úmido para esfriar uniformemente e evitar que o lóbulo afunde. Deixe a agarose esfriar por mais 30 segundos e coloque o lóbulo aparado no centro da agarose, deixando-a assentar no meio do bloco. Em seguida, corte as bordas externas do bloco de agarose e desaloje o bloco de agarose do prato. Certifique-se de que o lado superior e o lado colado à plataforma Vibratome estejam paralelos à borda superior do lóbulo. Comece configurando o Vibratome para cortar com uma espessura de 250 micrômetros com uma velocidade de cinco e uma frequência de sete hertz. Depois de esterilizar o vibratomo e colocar a bandeja no vibratome, envolva-o com gelo para manter o ambiente frio. Coloque as lâminas em um ângulo de 10 graus para baixo em relação ao plano horizontal. Em seguida, encha o tanque Vibratome com tampão Krebs gelado. Aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato na plataforma para prepará-la para a montagem do bloco de agarose. Em seguida, seque a borda do bloco de agarose que será colado na plataforma com tecido absorvente estéril. Agora, coloque o bloco de agarose na plataforma removível do Vibratome. Posicione o lóbulo do fígado na vertical para permitir cortes transversais, o que reduz a pressão no lóbulo e facilita um corte mais suave. Aguarde um minuto para que a cola endureça e submerja a plataforma no tanque de vibratome, garantindo que o bloco de agarose esteja completamente coberto com tampão Krebs. Para programar o Vibratome para corte, defina as posições de início e parada. Em seguida, comece a cortar as fatias até atingir o lóbulo do fígado. Use uma espátula para coletar as fatias de fígado, pois isso evita danos, ao contrário de pinças ou escovas. Colete as fatias em um tampão Krebs gelado até que estejam prontas para o cultivo. Usando uma espátula, transfira as fatias de fígado para os poços preparados contendo meios e inserções. Em seguida, coloque as placas em um agitador orbital ajustado para 130 rpm e incube-as em uma incubadora de cultura de células convencional a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio.