Name: Técnica otimizada e simplificada para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a produzir fatias de fígado cortadas com precisão (PCLS) de camundongos usando vibratome e condições de cultura otimizadas. Este protocolo garante viabilidade por pelo menos quatro dias para estudos metabólicos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo padronizado para cultura de fatias de fígado em ambientes laboratoriais básicos

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 3 cm</td><td>Qualquer</td><td></td><td>adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>6, 12, 24 placa de cultura de poços</td><td>Qualquer</td><td></td><td>adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Super cola de cianoacrilato</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>inserções 8um, para placas de 12 poços</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>inserções 8um, para placas de 24 poços</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>inserções 8um, para placas de 6 poços</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Capô de Fluxo Laminar Filtragem</td><td></td><td></td><td>de ar Hepa</td></tr><tr><td>Baixo derretimento agarose&nbsp;</td><td>Reagente de</td> tetrazólio <td>ThermoFisher 16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS&nbsp;</td>Leitor de placas multi-poços <td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comprimido PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinça cirúrgica</td><td>Qualquer</td><td></td> com <td>uma ponta quadrada plana&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s Medium E com GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica otimizada e simplificada para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Na colheita, a perfusão do animal é propositalmente omitida para garantir o processamento rápido do órgão e evitar danos aos órgãos. O fígado é extraído rapidamente após a incisão e imediatamente colocado em um tampão protetor de órgãos gelado, por exemplo, tampão Krebs24,29. Embora o corte de tecido hepático fresco sem incorporação tenha sido descrito anteriormente1, a inclusão do fígado em agarose30 de baixo ponto de fusão (Figura 1) combinada com um tampão protetor de órgãos permitirá condições ideais de corte no vibratoma, reduzindo o dano tecidual e aumentando a reprodutibilidade na espessura da seção. A espessura do tecido é crítica, pois seções finas permitem que mais camadas de células acessem nutrientes e oxigênio31 e reduzam a morte celular. No entanto, seções muito finas tornam-se difíceis de cortar de forma homogênea. Por outro lado, fatias com espessura superior a 400 μm apresentarão uma menor taxa de penetração de nutrientes. As seções foram incubadas em uma interface líquido-ar usando um inserto (Figura 1) e incubadas com 5% de CO2 e 21% deO2 a 37 °C em um agitador. As seções devem ser incubadas em um meio de cultura dentro de 3 h após a colheita, após o que a morte celular ocorre rapidamente32.
Para determinar a viabilidade do PCLS, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de 4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS), que requer desidrogenases dependentes de NAD(P)H, ou seja, células metabolicamente ativas, para reduzir o MTS. Os valores de MTS foram normalizados para o respectivo peso de fatia. Para otimizar a viabilidade do PCLS, um volume mínimo de meio de cultura foi essencial para sustentar a viabilidade após 24 h de incubação. Um volume de 0,7 mL em placas de 24 poços mostrou uma redução significativa da viabilidade pelo ensaio TMS (p = 0,02) em comparação com 1,5 mL em placas de 12 poços e 2,6 mL em placas de 6 poços (Figura 2A). Esses volumes foram escolhidos para permitir que as seções fossem ligeiramente cobertas, mas podem precisar de ajustes dependendo do tipo de insertos e placas utilizadas. Como outros33, placas de 12 poços são usadas como o melhor compromisso para a sobrevivência ideal dentro de um volume menor de meio de cultura.
A agitação é essencial e aumenta a viabilidade do PCLS em 50% em 24 h após a incubação em comparação com uma cultura estática (Figura 2B). A agitação cria uma interface ar-líquido crítica, otimizada com o uso de transwells, permitindo o acesso a nutrientes e oxigênio para ambas as faces da seção. A absorção de oxigênio e nutrientes também é aumentada pelo fluxo constante criado pelo movimento de agitação, que também passa pela membrana do transpoço.
O ensaio MTS foi avaliado a partir de 1 h de incubação até o dia 6 de incubação. A viabilidade celular permaneceu constante do dia 0 ao dia 4 pós-incubação antes de observar uma diminuição significativa (p = 0,05) no dia 6 (Figura 2C). A morfologia do PCLS avaliada pela coloração de hematoxilina e eosina (H&amp;E) não mostrou alteração dos ductos biliares e da arquitetura até 5 dias após a incubação (Figura 3A-D). Em comparação com o dia 0 (Figura 3A), o PCLS não mostrou diferença histológica no dia 1 (Figura 3B) e no dia 2 (Figura 3C) pós-incubação, com hipercromasia nuclear, infiltrado inflamatório leve, vacuolização em favor de um processo moderado de morte celular no dia 5 pós-incubação (Figura 3D). Em conjunto, esse protocolo de cultura de PCLS permite viabilidade por pelo menos 4 dias, consistente com estudos que utilizaram fatias em condições semelhantes31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema resumindo o protocolo para geração de PCLS. Este número foi modificado de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Figura 2: Protocolo otimizado de cultura de PCLS mostra viabilidade satisfatória por 5 dias. (A) Efeito do tamanho do poço na proliferação celular (n=3). (B) Efeito da agitação na proliferação celular (n = 6 por condição). (C) Ensaio de proliferação de células MTS de seções hepáticas de d0 a d6 dias de incubação (n = 5 por ponto de tempo). Unidade arbitrária OD, normalizada para fatiar o peso fresco. O gráfico mostra a média ± DP. Teste t de Student bicaudal não pareado, ns=não significativo, *p&lt;0,05, **p&lt;0,01. Este número foi modificado de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Figura 3: Resultados histológicos. (A-D) Imagens representativas da histologia do PCLS hepático após coloração H &amp; E. Barra de escala = 100 μM. Este número foi modificado de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Técnica otimizada e simplificada para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

As culturas de explante de tecido primário organotípico, que incluem fatias de corte preciso, representam a arquitetura tridimensional (3-D) do tecido, bem como as interações multicelulares do tecido nativo. Este vídeo descreve a cultura de fatias de tecido derivado de tumor de pulmão murino usando uma unidade de incubação rotativa, um sistema que permite a exposição intermitente dos tecidos ao oxigênio e nutrientes. O protocolo descreve a metodologia para gerar e cultivar fatias de tumor de...

Cultura de explante de tecido de tumor de pulmão: um procedimento para gerar e cultivar fatias de tumor de pulmão cortadas com precisão

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para inflar pulmões humanos isolados com agarose e preparar cortes de pulmão humanos cortados com precisão. As fatias de pulmão ex vivo preparadas podem ser usadas para outros experimentos imunológicos.

Preparação à base de agarose de fatias de pulmão humanas cortadas com precisão

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Este protocolo fornece um método simples e confiável para a produção de fatias hepáticas de corte de precisão viável de camundongos. As amostras de tecido ex vivo podem ser mantidas condições de cultura de tecidos de laboratório por vários dias, fornecendo um modelo flexível para examinar a patobiologia hepática.

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