Name: Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a visualizar o desenrolamento do DNA em molécula única pela helicase CMG usando microscopia TIRF. Este método revela dinâmicas da replicação em Drosophila melanogaster.

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<meta charset="utf8"></head><body>Desenrolamento de DNA mediado por CMG observado pelo crescimento do trato ssDNA-RPA

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida / Bis 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Usado para preparar Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Usado com o Coletor de Frações F9-C; Sistema de purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Gel de afinidade ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de biotina-PEG</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado conforme descrito: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digoxigenina biotinilado &nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>Massa adesiva</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Diluído do estoque</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Conectado ao sistema de purificação de proteínas AKTA; Coluna de Cromatografia de troca iônica de alta resolução</td></tr><tr><td>Caseína (5% em água, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clipes</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tábua de corte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>digoxigenina-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>corante de carga de DNA 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face (0,14 mm de espessura)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptídeo&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sintetizado pelo STP de biologia química do Instituto Francis Crick</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&NBSP;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificado conforme desribado em ' 'Análise de Molécula Única', Série Métodos em Biologia Molecular, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. e Wuite G. J. L. editores, Humana Press. Informações sobre proteínas: 2 mM, humanas, expressas em E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Epóxi - 5 minutos</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>Analisador de imagem fluorescente</td></tr><tr><td>Coloração de Ácido Nucleico GelRed; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Exemplo de coloração por ácido nucleico que é uma alternativa mais segura ao brometo de etídio.</td></tr><tr><td>Slide de vidro ou quartzo com furos para tubulação & nbsp;</td><td>Dremel Modelo 395</td><td></td><td>Ferrolho de 1 mm de espessura, cortado para 2,4 cm x 1 cm, dois furos furados a 1,4 mm de distância. Os furos devem ser perfurados em tamanhos diferentes para acomodar tubos diferentes em cada extremidade.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glicina HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton, série 1000 GASTIGHT, PTFE Luer lock 1010TLL, PTFE Luer lock (com ranhuras), volume 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Diálise Maxi GeBaFlex para tubos; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de metal</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (filtros de seringa) 0,22 & micro; m&nbsp;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Agulha</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ntraço; Gels de proteína bis-tris a 12%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Executando Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor objetivo</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mistura PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>Preparado a partir da DNA polimerase Phusion (20 & micro; L), 10 mM dNTPs (40 & micro; L), 5x Phusion HF buffer (400 e micro; L) e água (540 & micro; L).</td></tr><tr><td>Peptídeo NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcado com LD655-MAL&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>o peptídeo NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcado com LD655-MAL (Lumidyne Technologies) sobre o resíduo de cisteína, foi sintetizado e purificado pelo PTA de química peptídica do Instituto Francis Crick</td></tr><tr><td>Plasmídeo pGC261</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de plástico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE20 (diâmetro interno 0,015", diâmetro externo 0,043")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE60 (diâmetro interno 0,03", diâmetro externo 0,048")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Cromatografia Poly-Prep; 10 ml e 20 ml&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de potássio (ácido L-glutâmico sal de potássio monohidratado)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inibidor de protease (cOmplete, sem EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Single Pump 11 Elite Infusão/Retirada Programável</td><td>Aparato de Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação por PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>Buffer rCutSmart; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortase (pentamutante)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificado baseado em: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>Filtros de tubos de centrífuga Spin-X; 0,22 & micro; m acetato de celulose &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi estéril</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Filtragem Descartável Steritop Driven a Vácuo; 0,22 um; PES; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina (1 mg/mL) em 1x PBS buffer</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & micro; Aspas L</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Coloração de ácido nucleico altamente sensível que usamos para visualizar substrato de forquilhagem de DNA.</td></tr><tr><td>SYTOX laranja; 5 & micro; M em DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ligase de DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer &nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV protease (1 mg/mL); EZCut&nbsp;</td><td>Biovision</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de tecido, tipo Dounce (40 mL, Wheaton)</td><td>DWK Ciências da Vida</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Usado para preparar Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pré-adolescente-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do dna por cmg helicase

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única para obter imagens diretas e quantificar o movimento de helicase Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) totalmente reconstituída e marcada com fluorescência em moléculas de DNA lineares mantidas no lugar em uma armadilha óptica.

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Este protocolo descreve um ensaio de replicação de DNA de molécula única baseado em microscopia de fluorescência, permitindo a visualização em tempo real das interações entre DNA polimerases e obstáculos como estruturas G-quadruplex.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Este protocolo demonstra um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão unidimensional (1D) moléculas ao longo do DNA.

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

As experiências tradicionais de eletroforese em gel de laje (SGE) requerem um aparelho complicado e alto consumo químico. Este trabalho apresenta um protocolo que descreve um método de baixo custo para separar fragmentos de DNA dentro de um prazo curto.

Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Fluorescência ressonância energética baseada em transferência em tempo real observação sistemas do DNA vertente reação de troca, mediada por Rad51 foram desenvolvidos. Usando os protocolos aqui apresentados, somos capazes de detectar a formação de intermediários de reação e sua conversão em produtos, também na análise da cinética enzimática da reação.

Observação em tempo real da reação de troca de fita de DNA mediada por Rad51

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Aprenda a visualizar o desenrolamento do DNA em molécula única pela helicase CMG usando microscopia TIRF. Este método revela dinâmicas da replicação em Drosophila melanogaster.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

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