Name: Determinando a estabilidade sérica da enzima adenosina desaminase 1 humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Aprenda métodos para avaliar a estabilidade sérica de enzimas em biológicos proteicos para imunologia e engenharia de proteínas. Este protocolo ajuda a prever perfis farmacocinéticos e eficácia terapêutica no tratamento do câncer.

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1. Incubação de soro
<ol><li>Prepare um estoque de 10x de HsADA1 em 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) a uma concentração final de 10 μM. Descongele uma alíquota de 15 mL de soro humano agrupado e pré-aqueça a 37 ° C. Pré-aqueça uma alíquota de 50 mL de 1x PBS a 37 °C.</li>
	<li>Preparar as misturas de incubação enzima-soro adicionando 100 μL do stock 10x HsADA1 a 900 μL de soro humano agrupado num tubo de microcentrífuga de baixa ligação, denominado mistura enzima + soro. Em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação separado, adicione 100 μL do estoque 10x HsADA1 a 900 μL de 1x PBS para comparação com um controle sem soro, conhecido como mistura de enzima + 1x PBS. A concentração final de HsADA1 em cada mistura será de 1 μM.</li>
	<li>Prepare um controle adicional em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação consistindo de 100 μL de 1x PBS misturado com 900 μL de soro humano agrupado. Isso servirá como controle não enzimático para a mistura enzima + soro. Além disso, faça um controle composto por 1 mL de 1x PBS. Isso servirá como controle não enzimático para a mistura enzimática + 1x PBS.</li>
	<li>Alíquota de 100 μL de cada mistura da etapa 1.2 em tubos separados de baixa ligação e diluir 1:1 com 100 μL de glicerol a 30% (v/v) em 1x PBS. Congelar rapidamente com azoto líquido e conservar a -80 °C. Essas amostras serão o ponto de tempo do Dia 0 e a concentração de HsADA1 nelas será de 500 nM. Repetir este passo para as misturas de controlo não enzimáticas a partir do ponto 1.3. Selar todas as enzimas e misturas de controlo com película transparente e colocá-las numa incubadora a 37 °C.</li>
	<li>Após 24 h, alíquota de 100 μL de cada amostra incubada e diluir 1:1 com 100 μL de glicerol a 30% (v/v) em 1x PBS. Congelar rapidamente com azoto líquido e conservar a -80 °C. Essas amostras serão o ponto de tempo do Dia 1. Voltar a colocar todas as misturas enzimáticas e de controlo na incubadora a 37 °C. Repita esta etapa em 72 h e 120 h. NOTA: As amostras alíquotas não precisam necessariamente ser congeladas rapidamente. Alternativamente, o usuário pode realizar o ensaio baseado em microplacas imediatamente após a coleta de cada amostra, embora curvas padrão frescas e estoques de substrato de adenosina devam ser preparados cada vez que uma amostra é testada.</li>
</ol>2. Ensaio baseado em microplacas
<ol><li>Preparar o leitor de microplacas estabelecendo um protocolo de leitura cinética (figura 2) para medir a absorvância a 260 nm com o intervalo de leitura mais curto durante 30 minutos e pré-aquecer o leitor até um ponto de regulação de 37 °C.</li>
	<li>Descongele todas as amostras coletadas no gelo. Diluir cada amostra descongelada 1:10 usando 1x PBS pré-aquecido a 37 °C como diluente em tubos de microcentrífuga de baixa ligação. A nova concentração de HsADA1 nessas amostras será de 50 nM.</li>
	<li>Faça uma diluição de 10x em 1x PBS da amostra de controle de soro não enzimático também. Além disso, prepare um estoque de adenosina 5 mM adicionando 66,8 mg de adenosina a 50 mL de 1x PBS. Prepare uma diluição de 250 μM de adenosina adicionando 400 μL do estoque de adenosina a 7.600 μL de 1x PBS e pré-aqueça a 37 ° C em uma incubadora.</li>
	<li>Em uma microplaca compatível com UV de 96 poços, adicione 160 μL da diluição de adenosina de 250 μM e 40 μL de cada amostra de proteína diluída em triplicado para um volume total de 200 μL. Isso produzirá uma concentração final de adenosina de 200 μM e uma concentração enzimática final de 10 nM.</li>
	<li>Repetir a diluição para as amostras de controlo adicionando 40 μl do soro diluído ou 1x controlos PBS e 160 μl da diluição de adenosina de 250 μM em triplicata. Isso também produzirá uma concentração final de adenosina de 200 μM, mas sem enzima. NOTA: Pode ser benéfico adicionar todas as enzimas diluídas e amostras de controle individualmente à microplaca primeiro e, em seguida, adicionar o substrato de adenosina com uma micropipeta de 12 canais para reduzir o tempo total de carregamento. Além disso, placas transparentes aos raios UV devem ser usadas nesta etapa para evitar que a própria placa confunda o sinal de absorbância medido.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada alvéolo a 260 nm durante 30 min a 37 °C. Uma vez feito isso, exporte os dados para uma planilha para análise posterior.</li>
</ol>3. Análise dos dados do leitor de microplacas
<ol><li>Determine a inclinação da região linear dos dados de absorbância em função do tempo para os primeiros minutos dos dados da microplaca. Para as amostras diluídas em soro, isso correspondeu aos primeiros ~ 120 s. Para as amostras diluídas em PBS 1x, isso correspondeu aos primeiros ~ 270 s. Esta inclinação dos valores de absorbância decrescente terá um valor numérico negativo e terá unidades de variação em unidades de absorbância por segundo (ΔA260/s).</li>
	<li>Subtrair a inclinação do controlo negativo que consiste em soro humano agrupado da inclinação dos dados enzimática + soro. Execute a mesma operação nas misturas de enzima + 1x PBS subtraindo a inclinação do controle 1x PBS.</li>
	<li>Normalize todas as inclinações ajustadas para a inclinação original em t = 0 h para obter a fração de atividade restante usando a Equação 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Equação 1</li>
	<li>Plote a fração de atividade restante versus o tempo.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliando a estabilidade sérica de HsADA1: uma abordagem baseada em microplacas

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Proteína&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>de Glicerol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Soro Humano Interno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Pooled</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hidroxi-quinurenina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosina&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxal 5-fosfato monohidratado, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>MICROPLACA UV-STAR, 96 WELL, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Adenosina Desaminase Humana Wildtype 1</td><td>Internamente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinando a estabilidade sérica da enzima adenosina desaminase 1 humana

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

As figuras mostram os resultados do ensaio executado quando conduzido com HsADA1 do tipo selvagem. A Figura 3A, B ilustra as curvas de declínio da absorbância a 260 nm das amostras provenientes das misturas 1x PBS/soro-enzima para HsADA1 de tipo selvagem após a adição de adenosina. Essa absorbância em declínio em função dos dados de tempo é o que o usuário pode esperar após a conclusão bem-sucedida do ensaio baseado em microplacas e é semelhante aos dados de absorbância que surgiriam após a adição de quantidades suficientes de HsADA1 funcional à adenosina. A Figura 3C,D ilustra as curvas de absorbância dos controles negativos testados, que não contêm enzima após a adição de adenosina. Em comparação com as amostras de enzimas reais, a mudança de absorbância desses controles negativos é quase insignificante. A partir da Figura 3, pode-se observar que as inclinações das curvas enzimáticas mudam em função do tempo de incubação. Por exemplo, a inclinação do ponto de tempo do Dia 0 é drasticamente mais íngreme do que o ponto de tempo do Dia 5.
A Figura 4 ilustra a fração de atividade retida pelo HsADA1 do tipo selvagem em função do tempo quando incubado em 1x PBS ou soro humano agrupado a 37 ° C. Especificamente, as inclinações de todas as curvas de declínio de absorbância na Figura 3A, B são normalizadas para as inclinações do Dia 0 de seus respectivos grupos. Como pode ser visto na Figura 4, há uma divergência na atividade retida para HsADA1 do tipo selvagem em 1x PBS versus soro humano agrupado. Especificamente, a enzima perde sua atividade mais rapidamente no soro humano combinado, com a enzima retendo aproximadamente 10% de sua atividade original no Dia 5. Uma perda de atividade ainda é detectável quando HsADA1 é incubado em 1x PBS, embora a enzima retenha aproximadamente 75% de sua atividade. Isso é congruente com os resultados de Jennings et al., também relatando uma diminuição na atividade após a incubação com soro a 37 ° C em quase 40% após 48 h6. Lu et al. também mostraram que a atividade da HsADA1 diminui nos fluidos corporais pleural, peritoneal e cefalorraquidiano à temperatura ambiente (25 °C)8.
Para demonstrar a flexibilidade desse protocolo, nós o usamos para testar a estabilidade sérica de outra enzima de origem humana, uma variante de quinureninase humana modificada anteriormente apelidada de HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N catalisa eficientemente a conversão de OH-Kyn em OH-AA, semelhante à enzima HsKYNase do tipo selvagem, embora seja na verdade um mutante de reversão de dois aminoácidos de uma variante de quinureninase humana projetada com especificidade de substrato alterada, ou seja, que degrada eficientemente a quinurenina em ácido antranílico7. OH-Kyn absorve fortemente a 379 nm, enquanto OH-AA não, resultando em declínio mensurável da absorbância após a adição de nossa variante HsKYNase projetada ao OH-kyn 9,10. A Figura 5A,B ilustra as curvas de declínio da absorbância a 379 nm das amostras provenientes das misturas 1x PBS/soro-enzima para HsKYNase após a adição de OH-Kyn. A Figura 5C,D ilustra as curvas de absorbância dos controles testados que não contêm enzimas. Como visto com HsADA1, há uma clara diferença nas inclinações das curvas de absorbância entre as amostras. Isso é especialmente evidente na Figura 5A, pois a inclinação do ponto de tempo de 0 h é muito mais íngreme do que os pontos de tempo de 3 h e 24 h. A Figura 6 ilustra a fração correspondente de atividade retida para a HsKYNase testada em função do tempo. Como HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N perde atividade no soro mais rapidamente do que em PBS (~ 85% de atividade perdida versus ~ 40% ao longo de 24 h). Embora a estabilidade sérica dessa variante enzimática não tenha sido testada anteriormente, ela segue a tendência geral de outras variantes da HsKYNase, que também perderam a maior parte de sua atividade em 24 horas no soro a 37 ° C7. 
De um modo geral, as enzimas podem perder atividade ao longo do tempo devido a uma série de fatores, incluindo pH, concentração de sal, temperaturae muito mais. Portanto, um resultado que não acompanhe essa tendência pode ser considerado anormal. Por exemplo, se a atividade enzimática aumentar drasticamente ao longo do tempo, isso pode indicar que os resultados são inválidos. Isso pressupõe que as condições enzimáticas não sejam alteradas, e estamos falando estritamente no sentido do tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma detalhando as etapas do protocolo para HsADA1. A figura mostra as etapas seguidas neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Figura 2: Configurações de leitura cinética do leitor de microplacas. Um protocolo de leitura cinética foi criado para medir a absorbância a 260 nm por 30 min a 37 °C com o intervalo mínimo. A figura mostra as configurações escolhidas para configurar este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de absorbância versus tempo para HsADA1 após a adição de 200 μM de adenosina. (A) Curvas de absorbância versus tempo para HsADA1 incubado com soro após a adição de 200 μM de adenosina. (B) 1x HsADA1 incubado com PBS. (C) Controle soro negativo. (D) 1x controle negativo PBS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Figura 4: Retenção da atividade de HsADA1. A atividade é avaliada em 1x PBS versus soro humano combinado a 37 °C. A fração da atividade original retida para HsADA1 incubada em 1x PBS versus soro humano combinado ao longo de 5 dias foi determinada (barras = média ± DP, n = 3). Um teste t não pareado bicaudal foi usado *p&lt;0,05, **p &lt; 0,01 e *** p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Figura 5: Curvas de absorbância versus tempo para HsKYNase66-W102H-T333N após a adição de 400 μM OH-Kyn. (A) Curvas de absorbância versus tempo para HsKYNase incubada com soro após a adição de 400 μM OH-Kyn. (B) 1x HsKYNase incubada com PBS. (C) Controle soro negativo. (D) 1x controle negativo PBS (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Figura 6: Retenção de atividade de HsKYNase66-W102H-T333N. A atividade é avaliada em 1x PBS versus soro humano combinado a 37 °C. A fração da atividade original retida para HsKYNase66-W102H-T333N incubada em 1x PBS versus soro humano agrupado ao longo de 24 h foi determinada (barras = média ± DP, n = 3). Um teste t não pareado bicaudal foi usado; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Curva padrão de adenosina e inosina. O gráfico foi desenhado para 0-200 μM. Adenosina ou inosina foi adicionada a 1x PBS nas concentrações observadas e, em seguida, a absorbância a 260 nm foi medida. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Curva padrão de OH-Kyn. O gráfico foi desenhado para 0-400 μM. O OH-Kyn foi adicionado a 1x PBS nas concentrações observadas e, em seguida, a absorbância a 379 nm foi medida. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Curvas de absorbância versus tempo a 260 nm com concentrações crescentes de HsADA1 após a adição de 200 μM de adenosina. (A) Curvas de reação para concentrações variáveis de HsADA1. (B) Mudança de dobra na inclinação da região linear das curvas de absorbância em relação a um controle PBS 1x (barras = média ± DP, n = 3). Um teste t não pareado bicaudal foi usado **p &lt; 0,01 e ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 4: Curvas de absorbância versus tempo a 379 nm com concentrações crescentes de HsKYNase projetada após a adição de 400 μM de OH-Kyn. (A) Curvas de reação para concentrações variáveis de HsKYNase projetada. (B) Mudança de dobra na inclinação da região linear das curvas de absorbância em relação a um controle PBS 1x (barras = média ± DP, n = 3). O teste t não pareado bicaudal foi usado ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 5 suplementar: Curvas de absorbância versus tempo a 379 nm usando enzima desativada por calor em 400 μM de OH-Kyn. A enzima HsKYNase desativada por calor foi adicionada a 400 μM de OH-Kyn em 1x PBS e, em seguida, a absorbância a 379 nm foi medida. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Determinando a estabilidade sérica da enzima adenosina desaminase 1 humana

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Este artigo vai descrever o procedimento para a síntese de uma membrana Nafion hidrofobicamente modificado imobilização de enzimas e como para imobilizar proteínas e / ou enzimas no interior da membrana e testar a sua actividade específica.

Nafion-Sal modificado hidrofóbico para imobilização de enzimas e Estabilização

Este vídeo explica um método quantitativo de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo da adenosina e purinas associadas geradas pelo consumo de AMP em ambiente extracelular de células cancerígenas leucêmicas. O protocolo descreve um ensaio RP-HPLC sensível, específico, confiável e reprodutível, desenvolvido e validado para a quantificação de nucleotídeos e nucleosídeos de purina extracelular produzidos por células purificadas de leucemia...

Metabolismo de purinas extracelulares: um ensaio baseado em HPLC para medir a geração e o metabolismo de adenosina em células leucêmicas

Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.

Radicais Livres em Biologia Química: de comportamento químico para o Desenvolvimento de biomarcadores

PAD4 é uma enzima responsável pela conversão de peptidil-arginina em peptidil-citrulina. A desregulação do PAD4 tem sido implicada em várias doenças humanas. Um ensaio PAD4 baseado em fluorescência fácil e compatível com alto rendimento é descrito.

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

O protocolo descrito aqui representa um método fácil e reprodutível que emprega cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo de purinas em células de leucemia linfocítica crônica (LLC) cultivadas em diferentes condições.

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Este protocolo descreve um método colorimétrico para avaliar de forma confiável a influência de substâncias químicas na atividade da Deiodinase 1 (DIO1) em microrganismos hepáticos humanos usando a reação de Sandell-Kolthoff. Inclui critérios de aceitação pré-definidos e métricas estatísticas de desempenho, apoiando esforços contínuos para a inclusão das diretrizes de teste da OCDE.

Avaliação colorimétrica da atividade da deiodinase 1 em microssomos do fígado humano usando a reação de Sandell-Kolthoff

Aprenda métodos para avaliar a estabilidade sérica de enzimas em biológicos proteicos para imunologia e engenharia de proteínas. Este protocolo ajuda a prever perfis farmacocinéticos e eficácia terapêutica no tratamento do câncer.

Determinando a estabilidade sérica da enzima adenosina desaminase 1 humana

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